本发明属于医药化学领域，具体涉及杂环化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，它们的制备方法以及含有这些化合物的药物组合物和这些化合物或组合物在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的用途。
背景技术：
：丙型肝炎病毒(HCV)感染是世界范围内流行的疾病，全球慢性感染者已超过2亿，中国感染率为3.2％，位列世界前三。丙型肝炎病毒感染的临床表现多样，轻至炎症，重至肝硬化、肝癌。慢性丙型肝炎还可以并发某些肝外表现，包括类风湿性关节炎、干燥性结膜角膜炎、扁平苔藓、肾小球肾炎、混合型冷球蛋白血症、B细胞淋巴瘤和迟发性皮肤卟啉症等，可能是机体异常免疫反应所致。丙肝肝硬化失代偿期时，可以出现各种并发症，如腹水腹腔感染，上消化道出血，肝性脑病，肝肾综合征，肝衰竭等表现。HCV属于黄病毒科肝病毒属病毒，其与黄病毒科中的另外两个属即瘟病毒属和黄病毒属的基因结构相似。目前，治疗HCV感染的标准方法有干扰素以及干扰素和利巴韦林联合疗法。不过，仅50％的治疗者对该方法有反应，且干扰素具有明显的副作用，例如流行性感冒样症状、体重减低以及疲乏无力，而干扰素和利巴韦林联合疗法则产生相当大的副作用，包括溶血、贫血症和疲乏等。已开发的用于治疗HCV感染的药物包括蛋白酶抑制剂、噻唑烷衍生物、噻唑烷和N-苯甲酰苯胺、菲醌、解旋酶抑制剂、核苷聚合酶抑制剂和胶霉毒素、反义硫代磷酸酯寡核苷酸、核酶以及核苷类似物等。虽然目前的抗HCV感染的药物在临床上取得了一些成功，但是仍然需要开发更多的结构类型的化合物，以取得更优异的抗HCV感染疗效。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一类具有通式I结构的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：Cy选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，所述的环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选被一个或多个卤素、羟基、烷基、环烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基酰基氨基、烷基酰基、氨基酰基、烷基氨基酰基、硝基、氰基取代；R1、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃，且R2为氢、烷基或烷氧基；或者R2、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃，且R1为氢、烷基或烷氧基；R4、R5各自独立为氢或烷基；X1为N(R6)或O，R6选自H和烷基，所述烷基任选被一个或多个烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、烷基氨基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、烷基酰基、氨基酰基、烷氨基酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基、芳基或杂芳基取代；X2选自C(R7)和N(R8)；若X2选自C(R7)，则X3选自C(R9)，且X2、X3之间的虚线的键表示双键；若X2选自N(R8)，则X3为羰基，且X2、X3之间的虚线的键表示单键；R7、R8、R9独立地选自氢、卤素、羟基、烷基、环烷基、杂环烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基酰基氨基、烷基酰基、氨基酰基、烷基氨基酰基、硝基和氰基；m为0、1、2或3。本发明的另一个目的是提供制备本发明的通式I的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的方法。本发明的再一个目的是提供包含本发明的通式I的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药和药学可接受的载体的组合物，以及包含本发明的通式I的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药和另一种或多种抗病毒感染性疾病的药物的组合物。本发明的还一个目的是提供本发明的通式I的化合物或其立体异构体、药学 上可接受的盐、溶剂化物或前药治疗病毒感染性疾病，尤其是治疗丙型肝炎病毒感染引起的疾病的方法，以及本发明的通式I的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备用于治疗病毒感染性疾病，尤其是治疗丙型肝炎病毒感染引起的疾病的药物中的应用。针对上述目的，本发明提供以下技术方案：其中：Cy选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，所述的环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基任选被一个或多个卤素、羟基、烷基、环烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基酰基氨基、烷基酰基、氨基酰基、烷基氨基酰基、硝基、氰基取代；R1、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃，且R2为氢、烷基或烷氧基；或者R2、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃，且R1为氢、烷基或烷氧基；R4、R5各自独立为氢或烷基；X1为N(R6)或O，R6选自H和烷基，所述烷基任选被一个或多个烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、烷基氨基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、烷基酰基、氨基酰基、烷氨基酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基、芳基或杂芳基取代；X2选自C(R7)和N(R8)；若X2选自C(R7)，则X3选自C(R9)，且X2、X3之间的虚线的键表示双键；若X2选自N(R8)，则X3为羰基，且X2、X3之间的虚线的键表示单键；R7、R8、R9独立地选自氢、卤素、羟基、烷基、环烷基、杂环烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基酰基氨基、烷基酰基、氨基酰基、烷基氨基酰基、硝基和氰基；m为0、1、2或3。在一些具体的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物或其异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：Cy选自环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，所述环烷基、杂环烷基、芳基 和杂芳基可被一个或多个卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、硝基C1-6烷基、环烷基C1-6烷基、C3-8杂环烷基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、单C1-6烷基氨基、单C1-6烷基氨基C1-6烷基、双C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基C1-6烷基、C1-6烷基酰基、C1-6烷基酰基C1-6烷基、C1-6烷氧基酰基、C1-6烷氧基酰基C1-6烷基、C1-6烷基酰基氧基、C1-6烷基酰基氧基C1-6烷基、氨基酰基、氨基酰基C1-6烷基、单C1-6烷基氨基酰基、单C1-6烷基氨基酰基C1-6烷基、双C1-6烷基氨基酰基、双C1-6烷基氨基酰基C1-6烷基、C1-6烷基酰基氨基或C1-6烷基酰基氨基C1-6烷基取代；进一步优选地，Cy选自C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C6-10芳基、C6-10杂芳基，所述环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基可被一个或多个卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、硝基C1-6烷基、C3-8环烷基C1-6烷基、C3-8杂环烷基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、单C1-6烷基氨基、单C1-6烷基氨基C1-6烷基、双C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基C1-6烷基、C1-6烷基酰基、C1-6烷基酰基C1-6烷基、C1-6烷氧基酰基、C1-6烷氧基酰基C1-6烷基、C1-6烷基酰基氧基、C1-6烷基酰基氧基C1-6烷基、氨基酰基、氨基酰基C1-6烷基、单C1-6烷基氨基酰基、单C1-6烷基氨基酰基C1-6烷基、双C1-6烷基氨基酰基、双C1-6烷基氨基酰基C1-6烷基、C1-6烷基酰基氨基或C1-6烷基酰基氨基C1-6烷基取代；更进一步优选地，Cy选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、四氢吡咯基、四氢呋喃基、苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吲哚基、异吲哚基和喹啉基，所述环丙基、环丁基、环戊基、环己基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、四氢吡咯基、四氢呋喃基、苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、吲哚基、异吲哚基和喹啉基可被一个或多个卤素、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、氨基C1-6烷基、羧基C1-6烷基、氰基C1-6烷基、硝基C1-6烷基、C3-8环烷基C1-6烷基、C3-8杂环烷基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、单C1-6烷基氨基、单C1-6烷基氨基C1-6烷基、双C1-6烷基氨基、双C1-6烷基氨基C1-6烷基、C1-6烷基酰基、C1-6烷基酰基C1-6烷基、C1-6烷氧基酰基、C1-6烷氧基酰基C1-6烷基、C1-6烷基酰基氧基、C1-6烷基酰基氧基C1-6烷基、氨基酰基、氨基酰基C1-6烷基、单C1-6烷基氨基酰基、单C1-6烷基氨基酰基C1-6烷基、双C1-6烷基氨基酰基、双C1-6烷基氨基酰基C1-6烷基、C1-6 烷基酰基氨基或C1-6烷基酰基氨基C1-6烷基取代。在一些具体的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物或其异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：R1为氢、C1-6烷基或C1-6烷氧基，且R2、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；或者R2为氢、C1-6烷基或C1-6烷氧基，且R1、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；R4、R5各自独立为氢或C1-6烷基；进一步优选地，R1为氢、C1-3烷基或C1-3烷氧基，且R2、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；或者R2为氢、C1-3烷基或C1-3烷氧基，且R1、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；R4、R5各为氢、C1-3烷基；更进一步优选地，R1为氢、甲氧基、乙氧基、丙氧基，且R2、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；或者R2为氢、甲氧基、乙氧基、丙氧基，且R1、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；R4、R5各自独立为氢、甲基、乙基、丙基。在一些具体的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物或其异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：X1为N(R6)，R6选自H和C1-6烷基，所述烷基任选被一个或多个烷基、环烷基、杂环烷基、烷氧基、烷基氨基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、烷基酰基、氨基酰基、烷氨基酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基、芳基或杂芳基取代；进一步优选地，R6选自H和C1-3烷基，所述的烷基和环烷基可以被一个或多个C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基、卤素、羟基、氨基、硝基、氰基、C1-6烷基酰基、氨基酰基、C1-6烷氨基酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基、芳基或杂芳基取代。在一些具体的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物或其异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：X2选自C(R7)，X3选自C(R9)，且X2、X3之间的虚线的键表示双键。在一些具体的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物或其异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：X2选自N(R8)，X3为羰基，且X2、X3之间的虚线的键表示单键。在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的通式I的化合物或其异构体、 药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：Cy为苯基，其任选被一个或多个卤素、羟基、烷基、环烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基酰基氨基、烷基酰基、氨基酰基、烷基氨基酰基、硝基、氰基取代；R1为氢、C1-6烷基或C1-6烷氧基，且R2、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；或者R2为氢、C1-6烷基或C1-6烷氧基，且R1、R3与它们所连接的原子一起构成2,3-二氢苯并呋喃；R4、R5各自独立为氢或C1-6烷基；X1为N(R6)，R6选自H和C1-6烷基；X2选自C(R7)和N(R8)；若X2选自C(R7)，则X3选自C(R9)，且X2、X3之间的虚线的键表示双键；若X2选自N(R8)，则X3为C(O)，且X2、X3之间的虚线的键表示单键；R7、R8、R9独立地选自氢、卤素、羟基、烷基、环烷基、杂环烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基酰基氨基、烷基酰基、氨基酰基、烷基氨基酰基、硝基和氰基；m为0、1、2或3。在一些具体的实施方案中，本发明的化合物为通式I的化合物或其异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，其中：R7、R8、R9各自独立地选自氢、卤素、羟基、烷基、环烷基、杂环烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、氨基、烷基氨基、烷基酰基氨基、烷基酰基、氨基酰基、烷基氨基酰基、硝基和氰基；进一步优选地，R7、R8、R9各自独立地选自氢、卤素、羟基、C1-6烷基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、氨基、C1-6烷基氨基、C1-6烷基酰基氨基、C1-6烷基酰基、氨基酰基、C1-6烷基氨基酰基、硝基和氰基；更进一步优选地，R7、R8、R9各自独立地选自氢、卤素、羟基、C1-3烷基、C3-6环烷基、C3-6杂环烷基、C1-3卤代烷基、C1-3烷氧基、C1-3卤代烷氧基、氨基、C1-3烷基氨基、C1-3烷基酰基氨基、C1-3烷基酰基、氨基酰基、C1-3烷基氨基酰基、硝基和氰基。在一些实施方案中，本发明提供了以下具体化合物：另一方面，本发明提供本发明的通式I化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：a)式(1)的化合物在酸催化下与醇进行酯化反应，得到式(2)的化合物；b)式(2)的化合物经过取代、缩合反应制得式(3)的化合物；c)式(3)的化合物与卤化铜反应制得式(4)的卤代化合物；d)式(4)的化合物在碱性条件下水解得式(5)的化合物；e)式(5)的化合物经过Curtius重排反应、脱羧反应制得式(6)的氨基化合物；f)式(6)的化合物经过增环反应制得式(7)的稠环化合物；g)式(7)的化合物通过常用制备方法制得式(8)的化合物；h)式(8)的化合物经过Suzuki反应制得式(I)的化合物。其中，X为卤素，优选选自氯、溴，M为烷基，优选选自C1-6烷基，R1、R2、R3、R4、R5、X1、X2、X3、Cy、m如以上通式I中所定义。第三方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的通式I所示化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药与药学上可接受载体。可以将本发明的通式I所示化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。第四方面，本发明提供本发明的通式I所示化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药或本发明的药物组合物治疗病毒性感染疾病的受治疗者的方法，包括向所述受治疗者施用通式I的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药或者包含通式I的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的药物组合物，以有效减少所述受治疗者中所述病毒的病毒载量的量施用。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗和/或预防病毒感染例如HCV病毒感染的方法，包括向需要此治疗的个体给予本发明的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药或其药物组合物。在另一个实施方案中，本发明提供抑制病毒感染例如HCV病毒感染的方法，包括使所述病毒与治疗有效量的本发明的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、 溶剂化物或前药或其药物组合物接触。另一方面，本发明提供本发明的通式I所示化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或前药用于预防或治疗病毒性感染，尤其是HCV病毒感染疾病的应用，以及在制备预防和/或治疗病毒性感染疾病的药物中的应用，特别是在制备预防和/或治疗HCV病毒感染，如HCV病毒性肝炎疾病的药物中的应用。该类疾病的实例有急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎以及丙型肝炎和乙型肝炎或丁型肝炎的混合感染。术语定义除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本发明中的“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。包括顺反异构体、对映异构体和构象异构体。所有立体异构体均属于本发明的范围。本发明的化合物的单独立体异构体可基本上不含其它异构体或可以混合成例如外消旋体，或者与所有其它的立体异构体混合。本发明中的“药学上可接受的盐”是指本发明所述的化合物与酸形成的药学上可接受的盐，所述的酸例如可选自，但不限于：磷酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、柠檬酸、马来酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、醋酸、乳酸、硝酸、磺酸、对甲苯磺酸、苹果酸、甲烷磺酸或其类似物。本发明中的“溶剂化物”在常规意义上是指溶质(如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂(如水)组合形成的复合物。溶剂是指本领域的技术人员所知的或容易确定的溶剂。如果是水，则溶剂化物通常被称作水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等。本发明中的“前药”是指在生物体中的生理条件下，由于与酶、胃酸等反应而转化成式(Ⅰ)的化合物的化合物，即通过酶的氧化、还原、水解等转化成式(Ⅰ)的化合物的化合物和/或通过胃酸等的水解反应等转化成式(Ⅰ)的化合物的化合物等。本发明中的“药物组合物”是指包含任何一种本文所述的化合物，包括对应的异构体、前药、溶剂化物、药学上可接受的盐或其化学的保护形式，和一种或多种药学上可接受载体的混合物。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。所述组合物通常用于制备治疗和/或预防由一种或多种激酶介导的疾病的药物。本发明中的“药学上可接受的载体”是指对有机体不引起明显刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体，包含所有的溶剂、稀释剂或其它赋形剂、分散剂、表面活性剂等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容。可以作为药学上可接受的载体的一些实例包括，但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、以及纤维素和乙酸纤维素；麦芽、明胶等。本发明中的“烷基”指直链或支链的饱和脂肪烃基团，优选含1至6个碳原子的直链或支链基团，进一步优选含有1至3个碳原子的直链或支链基团，非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基等。烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上。本发明的“卤代烷基”是指至少被一个卤素原子取代的烷基。本发明中的“环烷基”是指环状的饱和烃基，优选8个碳原子以下的烃基。本发明的“C3-8环烷基”是指含有3-8个碳原子的环状饱和烃基。本发明的“C3-6环烷基”是指含有3-6个碳原子的直链或支链的饱和烃基。本发明中的“烷氧基”是指-O-烷基。本发明中的“卤素”是指氟、氯、溴、碘。本发明中的“烷基氨基”是指-NH-烷基或-N-(烷基)(烷基)。本发明中的“烷基酰基”是指-C(O)-烷基。本发明中的“氨基酰基”是指-C(O)-NH2，术语“烷氨基酰基”是指-C(O)-NH-烷基或-C(O)-N-(烷基)(烷基)。本发明中的“磺酰基”是指-S(O)2-烷基，术语“亚磺酰基”是指-S(O)-烷基。本发明中的“芳基”是指含有一个或多个苯环的芳烃基团。合适的芳基包括苯基、萘基。本发明中的“杂芳基”是指芳基中至少有一个碳原子被杂原子替代的芳香性基团。所述的杂原子为O、S、N。例如，本文所述杂芳基包括但不限于吡啶基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、异噁唑基、异噻唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁二唑基、噻二唑基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基和三嗪基。本发明中的“杂环烷基”是指至少含有一个杂原子的饱和环状基团，其中杂原 子为N、O或S。本发明中的“-NHMs”是甲基磺酰胺基的缩写。具体实施方式下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。实施例1N-(4-(4-甲氧基-3,3-二甲基-9-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-甲基苯基)甲基磺酰胺步骤14-溴-3,5-二羟基苯甲酸甲酯的制备将4-溴-3,5-二羟基苯甲酸(111.2g)溶于甲醇(400mL)中，加入浓硫酸(8mL)，回流5h。冷却，将反应液倒入水中，过滤，干燥，得白色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝247.0.步骤24-溴-3-羟基-5-(2-甲基丙烯氧基)苯甲酸甲酯的制备将实施例1步骤1中制得的4-溴-3,5-二羟基苯甲酸甲酯(116g)溶解于丙酮(500mL)中，加入碳酸钾(64.8g)，升温至回流，滴加3-溴-2-甲基丙烯(76.1g)，回流反应3h。过滤，浓缩，柱层析得白色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝301.0.步骤34-羟基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸甲酯的制备将实施例1步骤2中制得的4-溴-3-羟基-5-(2-甲基丙烯氧基)苯甲酸甲酯(47.7g)溶于DMF/H2O(40:1)(470mL)中，加入醋酸钯(1.78g)、四乙基氯化铵一水合物(34.9g)、醋酸钠(32.5g)、甲酸钠(12.9g)，氩气保护下，90℃反应6h。反应完全后，加入乙酸乙酯过滤，加入饱和食盐水，萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化，得标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝223.步骤47-溴-4-羟基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸甲酯的制备将实施例1步骤3中制得的4-羟基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸甲酯 (18.6g)溶于乙腈(180mL)，加入溴化铜(37.4g)，搅拌过夜，加入乙酸乙酯，过滤，浓缩，柱层析纯化，得白色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝315.步骤57-溴-4-羟甲基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸的制备将实施例1步骤4中制得的7-溴-4-羟基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸甲酯(12.5g)溶解于DMF(125mL)中，降温至0℃，加入NaH(60％，2.17g)，0℃下搅拌30min，滴加碘甲烷(8.87g)，反应2h后，加入乙酸乙酯和水萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，浓缩液用THF/H2O(1:1，120mL)溶解，加入NaOH(6.67g)，回流8h，浓缩除去THF，浓盐酸调节pH3-4，过滤，干燥，得白色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝301.步骤67-溴-4-羟甲基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-氨基的制备将实施例1步骤5中制得的7-溴-4-羟甲基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-甲酸(13g)溶解于叔丁醇(100mL)中，加入三乙胺(4.8g)，DPPA(13.1g)，回流4h。反应完毕后，浓缩除去叔丁醇，加入乙酸乙酯溶解，依次用1M柠檬酸、饱和NaHCO3、饱和食盐水洗涤，浓缩，干燥，加入HCl的乙酸乙酯溶液，搅拌过夜，过滤，用石油醚：乙酸乙酯＝2：1混合溶液洗涤，得灰色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝272.步骤76,9-二溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉的制备将2-溴丙烯醛(1.2g)溶于醋酸(35mL)中，滴加Br2(1.07g)的醋酸溶液(35mL)，室温搅拌15min。将实施例1步骤6中制得的7-溴-4-羟甲基-3,3-二甲基-2,3-二氢苯并呋喃-6-氨基(2.3g)加入上述溶液中，60℃反应约0.5h，浓缩除去醋酸，加入乙酸乙酯，饱和碳酸氢钠水溶液萃取，合并有机层，浓缩，柱层析纯化，得淡黄色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝386.步骤84-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲基-N-苯基甲磺酰胺的制备将实施例1步骤7中制得的6,9-二溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉(1.2g)、3-甲基-4-硼酸频哪醇酯-N-苯基甲磺酰胺(1.06g)、碳酸钠(0.98g)和Pd(PPh3)4(0.36g)溶于甲醇/二氯甲烷(2:1，10mL)，90℃微波30min，浓缩反应液，柱层析纯化，得淡黄色固态化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝491.步骤9N-(4-(4-甲氧基-3,3-二甲基-9-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-2,3-二氢呋喃 并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-甲基苯基)甲基磺酰胺的制备将实施例1步骤8中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲基-N-苯基甲磺酰胺(125mg)、(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)硼酸(42.35mg)、碳酸钠(81mg)和Pd(PPh3)4(29.5mg)溶于甲醇/甲苯(2:1，2mL)，120℃微波65min，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.52(s，6H，2CCH3)，2.29(s，3H，ArCH3)，3.04(s，3H，SCH3)，4.02(s，3H，OCH3)，4.26(s，2H，CH2)，8.31(s，1H，NHS)，6.23-8.66(m，8H，8ArH)，11.55(s，1H，NHCO).ESI-MSm/z:[M+H]+＝506.2.实施例2N-(4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-甲基苯基)甲基磺酰胺将实施例1步骤8中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲基-N-苯基甲磺酰胺(0.25g)、2,6-二甲氧基-3-吡啶硼酸(0.1g)、碳酸钠(0.16g)和Pd(PPh3)4(0.058g)溶于甲醇/甲苯(2:1，2mL)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸(2mL)溶解，加入HBr(0.2mL)，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.52(s，6H，2×CH3)，2.29(s，3H，CH3)，3.04(s，3H，CH3)，3.86(s，3H，OCH3),4.02(s，3H，OCH3)，4.26(s，2H，OCH2)，6.25(s，1H，NH)，6.25-8.66(m，7H，7ArH)，9.79(s，1H，NH).ESI-MSm/z:[M+H]+＝536.2.实施例3N-(4-(4-甲氧基-9-(6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-甲基苯基)甲基磺酰胺将实施例1步骤8中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲基-N-苯基甲磺酰胺(250mg)、2-甲氧基-6-甲基吡啶-3-基硼酸(85.68mg)、碳酸钠(161.9mg)和Pd(PPh3)4(58.8mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离，得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.51(d，6H，2CCH3)，2.23(s，3H，NHCCH3)，2.30(s，3H，ArCH3)，3.04(s，3H，SCH3)，4.01(s，3H，ArOCH3)，4.25(d，2H，CH2)，6.04-8.66(m，7H，7ArH)，9.83(brs，1H，NHS)，11.55(s，1H，NHCO).ESI-MSm/z:[M+H]+＝520.2.实施例4N-(4-(9-(2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-甲基苯基)甲基磺酰胺将实施例1步骤8中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲基-N-苯基甲磺酰胺(250mg)、2,4-二甲氧基嘧啶-5-硼酸(93.67mg)、碳酸钠(161.9mg)和Pd(PPh3)4(58.8mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.51(d，6H，2CCH3)，2.29(s，3H，ArCH3)，3.04(s，3H，SCH3)，4.01(s，3H，ArOCH3)，4.29(q，2H，CH2)，7.17-8.72(m，6H，6ArH)，9.81(brs，1H，NHS)，10.97(brs，1H，NHCH)，11.12(s，1H，CONHCO).ESI-MSm/z:[M-H]-＝521.2.实施例5N-(4-(9-(5-氟-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-甲基苯基)甲基磺酰胺将实施例1步骤8中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲基-N-苯基甲磺酰胺(250mg)、2-甲氧基-5-氟吡啶-3-硼酸(85.68mg)、碳酸钠(161.9mg)和Pd(PPh3)4(58.8mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.53(s，6H，2CCH3)，2.30(s，3H，ArCH3)，3.04(s，3H，SCH3)，4.03(s，3H，ArOCH3)，4.30(s，2H，CH2)，7.17～8.70(m，7H，7ArH).ESI-MSm/z:[M-H]-＝522.1.实施例6N-(4-(9-(2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺步骤14-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-N-苯基甲磺酰胺的制备将实施例1步骤7中制得的6,9-二溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉(650mg)、4-硼酸频哪醇酯-N-苯基甲磺酰胺(438.67mg)、碳酸钠(427mg)和Pd(PPh3)4(155mg)溶于甲醇/二氯甲烷(2:1，10mL)，90℃微波30min。柱层析得淡黄色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝477.步骤2N-(4-(9-(2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺的制备将实施例6步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-N-苯基甲磺酰胺(120mg)、2,4-二甲氧基嘧啶-5-硼酸(53.4mg)、碳酸钠(80.2mg)和Pd(PPh3)4(29mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩 后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.52(d，6H，2CH3)，2.85(s，3H，SCH3)，4.05(s，3H，OCH3)，4.28(q，2H，CH2)，7.18-9.02(m，7H，7ArH)，11.11(s，1H，CONHCO).ESI-MSm/z:[M+H]+＝508.9.实施例7N-(4-(4-甲氧基-3,3-二甲基-9-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺将实施例6步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-N-苯基甲磺酰胺(100mg)、(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)硼酸(58.2mg)、碳酸钠(66mg)和Pd(PPh3)4(24mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，制备分离得白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.53(s，6H，2CH3)，2.89(s，3H，SCH3)，4.06(s，3H，OCH3)，4.26(s，2H，CH2)，6.23-8.97(m，9H，9ArH)，11.52(d，1H，NHCO).ESI-MSm/z:[M+H]+＝491.9.实施例8N-(4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺将实施例6步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-N-苯基甲磺酰胺(100mg)、2,4-二甲氧基吡啶-5-硼酸(92mg)、碳酸钠(132mg)和Pd(PPh3)4(48.4mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.52(s，6H，2CH3)， 3.04(s，3H，SCH3)，3.85(s，3H，NHCOCH3)，4.06(s，3H，ArOCH3)，4.26(s，2H，CH2)，6.25-8.99(m，8H，8ArH).ESI-MSm/z:[M+H]+＝521.9.实施例9N-(4-(4-甲氧基-3,3-二甲基-9-(6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺将实施例6步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-N-苯基甲磺酰胺(200mg)、2-甲氧基-6-甲基吡啶-3-基硼酸(84mg)、碳酸钠(132mg)和Pd(PPh3)4(48.4mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.52(s，6H，2CCH3)，2.25(s，3H，ArCH3)，3.04(s，3H，SCH3)，4.06(s，3H，OCH3)，4.25(s，2H，CH2)，6.04～8.99(m，8H，8ArH)，9.98(brs，1H，NHS)，11.55(s，1H，NHCO).ESI-MSm/z:[M+H]+＝505.9.实施例10N-(3-氟-4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺步骤14-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-氟-N-苯基甲磺酰胺的制备将实施例1步骤7中制得的6,9-二溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉(250mg)、3-甲基-4-硼酸频哪醇酯-3-氟-N-苯基甲磺酰胺(224mg)、碳酸钠(205mg)和Pd(PPh3)4(74.6mg)溶于甲醇/二氯甲烷(2:1，10mL)，90℃微波30min，浓缩反应液，柱层析纯化，得淡黄色固态标题化合物。ESI-MS m/z:[M+H]+＝495.步骤2N-(3-氟-4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6基)苯基)甲基磺酰胺的制备将实施例10步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-氟-N-苯基甲磺酰胺(100mg)，2,4-二甲氧基吡啶-5-硼酸(44.5mg)、碳酸钠(64.3mg)和Pd(PPh3)4(23.4mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ1.52(s，6H，2CH3)，3.06(s，3H，SCH3)，3.85(s，3H，NHCOCH3)，4.03(s，3H，ArOCH3)，4.27(s，2H，OCH2C)，6.25-8.99(m，7H，7ArH).ESI-MSm/z:[M+H]+＝540.1.实施例11N-(4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-三氟甲基苯基)甲基磺酰胺步骤14-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-三氟甲基-N-苯基甲磺酰胺的制备将实施例1步骤7中制得的6,9-二溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉(650mg)、4-硼酸频哪醇酯-3-三氟甲基-N-苯基甲磺酰胺(735.7mg)、碳酸钠(427mg)和Pd(PPh3)4(155mg)溶于甲醇/二氯甲烷(2:1，10mL)，90℃微波30min，浓缩反应液，柱层析纯化，得淡黄色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝545.步骤2N-(4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3-三氟甲基苯基)甲基磺酰胺的制备将实施例11步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-三氟甲基-N-苯基甲磺酰胺(100mg)、2,4-二甲氧基吡啶-5-硼酸(44.5mg)、碳酸钠(64.3mg)和Pd(PPh3)4(23.4mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微 波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.53(s，6H，2CH3)，3.15(s，3H，SCH3)，3.86(s，3H，NHCOCH3)，4.0(s，3H，ArOCH3)，4.31(s，2H，OCH2C)，6.25-8.67(m，7H，7ArH)，10.32(s，1H，NHS).ESI-MSm/z:[M+H]+＝590.1.实施例12N-(3-甲氧基-4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺步骤14-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲氧基-N-苯基甲磺酰胺的制备将实施例1步骤7中制得的6,9-二溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉(650mg)、4-硼酸频哪醇酯-3-甲氧基-N-苯基甲磺酰胺(735.7mg)、碳酸钠(427mg)和Pd(PPh3)4(155mg)溶于甲醇/二氯甲烷(2:1，10mL)，90℃微波30min。柱层析得淡黄色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝507.步骤2N-(3-甲氧基-4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)苯基)甲基磺酰胺的制备将实施例12步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3-甲氧基-N-苯基甲磺酰胺(500mg)、2,4-二甲氧基吡啶-5-硼酸(217mg)、碳酸钠(314mg)和Pd(PPh3)4(114mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.52(s，6H，2CH3)，3.07(s，3H，SCH3)，3.80(s，3H，NHCOCH3)，3.86(s，3H，COCH3)，4.0(s，3H，ArOCH3)，4.27(s，2H，OCH2C)，6.25-8.77(m，7H，7ArH)，9.90(s，1H，NHS).ESI-MSm/z:[M+H]+＝552.2.实施例13N-(4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基 -2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3,5-二甲基苯基)甲基磺酰胺步骤14-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3,5-二甲基-N-苯基甲磺酰胺的制备将实施例1步骤7中制得的6,9-二溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉(650mg)、4-硼酸频哪醇酯-3,5-二甲基-N-苯基甲磺酰胺(545.9mg)、碳酸钠(427mg)和Pd(PPh3)4(155mg)溶于甲醇/二氯甲烷(2:1)(10mL)，90℃微波30min，柱层析得淡黄色固态标题化合物。ESI-MSm/z:[M+H]+＝505.步骤2N-(4-(4-甲氧基-9-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉-6-基)-3,5-二甲基苯基)甲基磺酰胺的制备将实施例13步骤1中制得的4-(9-溴-4-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢呋喃并[3,2-g]喹啉基)-3,5-二甲基-N-苯基甲磺酰胺(300mg)、2,4-二甲氧基吡啶-5-硼酸(130mg)、碳酸钠(68.64mg)和Pd(PPh3)4(189mg)溶于甲醇/甲苯(2:1)，120℃微波65min，浓缩后用醋酸溶解，加入HBr，在60℃搅拌1.5h后反应完全，浓缩，制备分离得灰白色固态标题化合物。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.53(s，6H，2CH3)，2.01(s，6H，2ArCH3)，3.05(s，3H，SCH3)，3.84(s，3H，NHCOCH3)，4.02(s，3H，ArOCH3)，4.31(s，2H，OCH2C)，6.25-8.58(m，6H，6ArH)，10.35(s，1H，NHS).ESI-MSm/z:[M+H]+＝550.2.药理活性评价实验例1本发明的化合物血清中活性偏移测试1.实验材料1.1试剂:表1.试剂列表试剂名称供应商DMEM细胞培养液Invitrogen胎牛血清Corning人血清Sigma谷氨酰胺Invitrogen青霉素-链霉素Hyclone非必需氨基酸添加剂Invitrogen筛选抗生素G418Invitrogen磷酸盐缓冲液Hyclone胰酶Invitrogen二甲基亚砜(DMSO)SigmaBright-Glo检测试剂Promega1.2HCV1a和1b复制子细胞:通过将HCV基因型1a或1b复制子稳定转入Huh7细胞系来制备HCV1a和1b复制子细胞。Huh71a和1b细胞系由上海药明康德新药开发有限公司提供，为包含带有稳定的荧光素酶(Luc)报告子的HCV1a或HCV1b复制子的Huh7细胞系。其通过基因重组技术将HCV非结构蛋白基因、neo(G418抗性)及荧光素酶报告基因克隆入pBR载体构建。然后将携带有HCV复制子的载体转染入huh7细胞，通过G418抗性筛选，HCV复制子可稳定复制且相关蛋白和荧光素酶在huh7细胞内稳定表达。该细胞模型用于抗HCV化合物体外筛选。通过检查荧光素酶的表达水平而测定化合物的抗HCV的活性。参见LohmannV,etal.1999.ReplicationofsubgenomichepatitisCvirusRNAsinahepatomacellline.Science.285(5424):110-113.1.3化合物：本发明以上实施例中制备的化合物，用100％DMSO配制成10mM母液，暂存氮气柜中。2.实验方法1).化合物处理：将本发明的实施例化合物的DMSO母液稀释后加入96孔实验板中。化合物终浓度最高为1μM，三倍梯度稀释，共10个浓度。DMSO终浓度为0.5％。2).细胞处理：在上述96孔细胞板中种入HCV-1a和HCV-1b复制子细胞，每 孔接种细胞数为8×103个细胞/孔，随后置于37℃，5％CO2培养箱中培养3天。3).抗HCV复制子活性检测：每孔加荧光素酶发光底物Bright-Glo，5分钟内用化学发光检测系统Envision检测Luminescence信号值，原始数据(RLU)用于化合物抑制活性计算。4).数据处理：使用如下公式将原始数据处理为抑制百分数：CPD：化合物孔的信号值HPE(Hundredpercenteffect):100％有效作用对照孔信号值，孔中只有DMEM培养液ZPE(Zeropercenteffect):无效作用对照孔信号值，用0.5％DMSO代替化合物。将抑制百分数导入GraphPadPrism软件进行数据处理得出化合物对应的曲线和对HCV复制子的抑制活性(EC50)数值。部分数据见表2。表2以上实验结果可以看出，本发明的化合物具有较好的抑制HCV病毒的能力，非常有希望成为HCV治疗剂。尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。当前第1页1 2 3