具有融合至常规Fab片段的单域抗原结合片段的二价抗体的制作方法

本发明涉及一种二价抗体，特别是具有融合至常规Fab片段的单域抗原结合片段的二价抗体。
背景技术：
：双特异抗体(BsMAb,BsAb)是由两种不同单克隆抗体的片段组成的人造蛋白，因而可结合到两种不同类型抗原。例如，在癌症免疫治疗中，经过工程化的BsMAbs同时结合至细胞毒性细胞及要被杀灭的靶标(如肿瘤细胞)。至少三种类型的双特异抗体已经被提出或测试，包括三官能抗体、化学连接的Fab和双特异T细胞衔接体。为了克服制造上的难点，已经开发了被称作三官能抗体的第一代BsMAb。它由两个重链和两个轻链组成，每个来自不同的抗体。这两个Fab区针对两种抗原。Fc区由两个重链组成并形成第三个结合位点，由此得名。已设计其他类型的双特异抗体来解决某些问题，例如，半衰期短、免疫原性和细胞因子释放引起的副作用。它们包括：仅由Fab区组成的化学连接的Fab，以及各种类型二价及三价的单链可变区(scFv)(模拟两种抗体可变结构域的融合蛋白)。最新开发的形式是双特异的T细胞衔接体(BiTE)及四官能的抗体。虽然取得了这些进步，但是双特异抗体主要的挑战仍然存在，例如提高制造效率、保留免疫原性和维持半衰期。技术实现要素：在一个实施方式中，本发明提供了二价或三价抗体，这种抗体包括常规的抗原结合片段(Fab)和一个或两个单域抗原结合(VHH)片段。每一个Fab和VHH具有对某种抗原的特异性，它们可能相同或不同。在抗体生产和纯化中，这样的一种相对于常规抗体分子量减少的二价或三价抗体，呈现一个显著的优势。尽管它尺寸小，但出乎意料地，这样的抗体仍然能有效地结合到两个不同的抗原，实现它预期的生物学功能。尽管这些公开的双特异抗体是异质二聚体，已知它们不利于表达和生产，但同样出乎意料地，它们能在细菌细胞(例如E.coli)轻易表达，导致生成可溶性蛋白。相反，其他由E.coli生产的已知的双特异抗体几乎不溶。除此之外，因为Fab的重链和轻链不会与它们自己结合(即，重链结合重链或者轻链结合轻链)，所以在生产中避免形成非预期的异质二聚体或至少使其最小化，导致预期的异质二聚体产量高。因此，本发明的一个实施方式提供了一种二价抗体，所述二价抗体包含(a)包含抗体的轻链和部分重链的抗原结合片段(Fab)和(b)融合至所述轻链的或部分重链的C-末端的单域抗原结合(VHH)片段，其中所述部分重链不包括CH2或CH3结构域。在在某些方面，VHH片段融合至所述部分重链。在某些方面，该抗体进一步地包含融合至所述轻链的第二VHH片段。在某些方面，Fab片段和VHH片段每个都有对肿瘤细胞或者免疫细胞的特异性。在某些方面，所述Fab片段具有对肿瘤抗原的特异性，并且所述VHH片段具有对免疫细胞的特异性。在某些方面，所述肿瘤抗原选自CEA、EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸盐结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和腱生蛋白。在某些方面，所述肿瘤抗原是CEA或Her2。在某些方面，所述VHH片段有对哺乳动物T细胞或哺乳动物NK细胞的特异性。在某些方面，VHH片段对选自CD3、CD16、CD19、CD28和CD64的抗原有特异性。在某些方面，所述抗原是CD16或CD3。在某些方面，所述VHH片段分别在Kabat位置37、44、45和47不包含Val、Gly、Leu和Trp残基。在一个实施方式中，本发明还提供了包含一个或多个编码本发明的抗体的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，宿主细胞是细菌细胞或酵母细胞。在某些方面，宿主细胞是E.coli。在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备可溶性抗体方法，所述方法包含使本发明的宿主以及收获在细胞中表达的抗体。更进一步地，在一个实施方式中，本发明提供一种治疗患者中的肿瘤的方法，该方法包括给所述患者施用本发明的抗体。附图说明图1a为一种二价抗体，所述抗体包括抗原结合片段(Fab)和单域抗原结合片段(VHH)。此Fab片段包括具有可变域(VH)和恒定域(CH1)的部分重链，以及具有可变域(VL)和恒定域(CL)的轻链。重链和轻链由二硫键连接。VHH片段融合至重链的C端。图1b为一种三价抗体，这种抗体包括抗原结合片段(Fab)和两个单域抗原结合片段(VHH和VHH‘)。所述Fab片段包括具有可变域(VH)和恒定域(CH1)的部分重链，以及具有可变域(VL)和恒定域(CL)的轻链。重链和轻链由二硫键连接。VHH和VHH‘片段各自融合至重链和轻链的C端。图2a-f展示了双特异抗体S-Fab设计和制备。(a)单链的细菌表达结构。此结构包含：PelB信号序列、人源化抗CD3(UTCH1克隆)VH或VL、CH1或CL、以及抗CEAVHH。Flag标签或his8标签被加至C端，以助于蛋白检测和纯化。(b)通过共表达的对照Fab(HCBF4/5)和S-Fab(HCB5/6)的方案。(c)和(b)，SDS-PAGE考马斯蓝染色及免疫印迹检测经固定化Ni-NTA亲和层析后的纯化蛋白。上图，Ni-NTA亲和层析法(M，分子量梯；SF，蔗糖组分；PF，周质组分；P，微孔球；FT，穿透液；W，洗液；E，洗脱液；E1,100nM咪唑，E2,200nM咪唑，E3，300nM咪唑，E4,400nM咪唑)。箭头表明纯化的HCBF4/5(左)和HCBF5/6(右)；中图，免疫印迹法通过抗His抗体检测HCBF5；下图，免疫印迹法通过抗Flag抗体检测HCBF4(左)和HCBF6(右)。(e)经第二次固定化Ni-NTA亲和层析后的纯化蛋白。(f)凝胶过滤层析展示了电泳至60kd的HCBF4/5和HCB5/6。上图，凝胶过滤的蛋白标记。图3a-c展示了纯化的S-Fab能够识别T细胞和CEA抗原。(a)在CD3阳性的Jurkat细胞上，HCBF5/6(50ug/ml)(黑色线)和对照OKT3抗体(红色线)的流式细胞分析，灰色区域是没有染色的细胞，以及蓝色线是只有抗Flag-FITC染色的细胞。(b)和(c)，HCBF4/5和HCB5/6结合至CEA的SPR分析。图4a-e展示了S-Fab以T细胞依赖的和肿瘤抗原依赖的方式杀伤肿瘤细胞。在存在所示浓度的S-Fab和Fab的情况下，人T细胞与肿瘤细胞以10:1(a)和5:1(b)的比例混合。细胞孵育48小时后，如方法与材料所述测量细胞毒性。(c)在不同细胞系中的CEA免疫印迹分析。(d)S-FabHCBF5/6在HT29(空心正方形)、LS174T(空心三角形)、DLD-1(空心菱形)细胞中的EC50。(e).结合抗CD3影响S-FabHCB5/6活性。在存在所示浓度的HCBF5/6和对照Fab的情况下，使用T细胞和LS174T(10：1)进行细胞毒性试验(*P<0.05,Ttest,100nMHCBF4/5对不含HCBF4/5)。所有的误差线代表三次同样实验的标准差。数据代表至少三次独立实验之一。图5展示了S-Fab在体内抑制肿瘤生长。NOD/SCID小鼠(n＝5/每组)皮下移植LS174T及人的PBMC。随后，给予小鼠PBS(实心菱形，PBS治疗，无PBMC移植)；仅PBMC(空心三角形，PBS治疗，PBMC移植)；HCBF4/5(空心圆形,HCBF4/5治疗,PBMC移植)；这些数据代表5只小鼠的平均的肿瘤体积。误差线代表标准差.(*P<0.05,Ttest,HCBF5/6比其他三组)。图6.由E.coli纯化Her2-S-Fab.(a)Her2-S-Fab和对照Her2-Fab的细菌表达构建体，每个构建体含有用于周质表达的信号序列pelB；抗Her2-VL-CL和抗Her2-VH-CH1构建体的共表达产生Her2-Fab；抗Her2-VL-CL和抗Her2-VH-CH1-抗CD16VHH构建体的共表达产生Her2-S-Fab；为便于蛋白检测和纯化，在每个构建体的C末端连接Flag标签或His8标签。(b)两步法纯化后Her2-S-Fab的考马斯亮蓝染色结果，M代表分子量标记，单位为kD；(c)凝胶过滤色谱显示Her2-S-Fab的大小为约65kD。图7.Her2-S-Fab识别Her2阳性细胞。Her2-PE抗体(a)、曲妥珠单抗(b)、对照Fab(c)和Her2-S-Fab(d)在不同细胞系上的流式细胞分析结果。图8.Her2-S-Fab诱导NK细胞介导的细胞毒作用。(a)以10μg/ml的Her2-Fab、Her2-S-Fab或曲妥珠单抗对CHO和SKOV3细胞系进行细胞毒性实验。数据是三次实验的平均值，误差条表示标准差。黑色表示无NK细胞时的CHO；灰色表示加入了NK的CHO；粗条纹表示无NK细胞的SKOV3；系条纹表示添加了NK的SKOV3。(b-f)对不同细胞系进行了剂量依赖性的细胞毒作用的分析：CHO(b)；MDAMB435(c)；MCF7(d)；SKBR3(e)和SKOV3(f)。Her2-Fab、Her2-S-Fab或曲妥珠单抗的浓度为0.01ng/ml至10μg/ml。数据是三次实验的平均值，误差条表示标准差。图9.Her2-S-Fab抑制体内肿瘤生长。NOD/SCID小鼠(n＝5/组，雄性)被皮下接种SKOV3细胞(2x106)和新鲜分离的人PBMC(2x107)的混合物。两小时后，腹腔注射PBS、对照Her2-Fab(1mg/kg)或Her2-S-Fab(1mg/kg)作为首次给药(D0)。在随后6天(D1、D2、D3、D4、D5和D6)，给小鼠皮下(i.p.)注射PBS(点画线)；Her2-Fab(1mg/kg，虚线)或Her2-S-Fab(1mg/kg，实线)。数据代表5只小鼠的平均肿瘤体积。误差条表示标准差(*P<0.05，ttest，Her2-S-Fab相对于其他两组)。具体实施方式定义应当注意的是术语“一种”实体是指一个或多个该实体，例如，“一种二价抗体”被理解为代表一个或多个二价抗体。同样地，这些术语“一种”、“一个或多个”和“至少一个”在此可互换使用。“同源性”或“同一性”或者“相似性”是指两个多肽序列间的或两个核酸分子间的序列相似性。通过比较在每个序列的位置而测定同源性，每一个序列可能为了比较目的而被比对。当这种比较序列的位置被相同碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在那个位置是同源的。序列间的同源性程度随着这些序列共有的匹配或同源位置的数量而变。“不相关的”或“非同源的”序列是指与本发明的序列之一具有低于40％的同一性，优选低于25％的同一性。多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一序列具有某种百分比(例如，60％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指当比对时，在比较这两个序列时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。使用本领域已知的软件程序可确定这种比对和同源性或序列同一性的百分比。术语“等同的多核苷酸”是指与一种参照核酸序列或其互补序列具有一种一定程度同源性或序列同一性的核酸序列。在一个方面，核酸的同源体能够杂交至此核酸或其互补序列。同样地，“等同的多肽”是指与对照多肽的氨基酸序列具有一定程度同源性或序列同一性的多肽。在某些方面，序列的同一性至少约为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些方面，这种等同序列保持对照序列的活性(例如表位结合)或结构(例如盐桥)。在此公开的每一个多肽或多核苷酸，它的等同物也是预期的。在一个方面，一种多肽的等同物包括氨基酸残基的改变(即，缺失、增加或取代)。在一方面，一种多肽等同物包括不多于两种氨基酸残基的改变。在一方面，一种多肽的等同物包括不多于3、4或5种氨基酸残基的改变。在一些方面，这种氨基酸改变位于对参照的多肽活性不是关键的残基上。对多肽活性关键的残基能够通过位点特异性突变分析、甚至是序列比对(因为这种序列是高度保守的)而被轻易地测试。本文所用的“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性地识别和结合到一种或多种抗原的多肽或多肽复合物。抗体是全抗体和其任何抗原结合片段或单链。因此，术语“抗体”包括至少含有免疫球蛋白一部分的分子的任何蛋白或肽，此免疫球蛋白分子的一部分具有结合至抗原的生物活性。这样的例子包括，但不限于，重/轻链或其配体结合部分的互补性决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架(FR)区或其任何部分、或结合蛋白的至少一部分。术语抗体也包含一旦激活即具备抗原结合能力的多肽或多肽复合物。本文所用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。无论结构如何，抗体片段都与完整抗体所识别的相同抗原结合。此术语“抗体片段”包括适配体、镜像体(spiegelmers)、双体。术语“抗体片段”也包括任何合成的或基因工程化的蛋白，这些蛋白通过结合至特异抗原以形成一种复合体而像抗体一样起作用。本发明的抗体、抗原结合多肽、其变体或衍生物包括但不限于多克隆的、单克隆的、多特异性的、人类的、人源的、灵长化的(primatized)或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段(例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv))、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VK或VH域的片段、由Fab表达文库生成的片段、以及抗独特型(anti-Id)抗体(包括例如在此公开的anti-Id抗体至LIGHT抗体)。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。轻链分为kappa或lambda(Κ,λ)。每一个重链种类可与kappa或lambda轻链结合。总体来说，轻链和重链彼此共价结合，当通过杂交瘤、B细胞或基因工程的宿主细胞产生免疫球蛋白时，两个重链的“尾”部通过共价的二硫键或非共价键而彼此结合。在重链中，氨基酸序列从在Y构象叉状端的N端运行到在每一个链的底部的C端。轻链和重链都被分为结构和功能的同源性的区。术语“恒定的”和“可变的”被功能性地使用。在这一方面，应当理解的是，轻链可变域(VK)和重链可变域(VH)都决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CK)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要的生物特性，例如分泌、经胎盘流动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得远离抗原结合位点或抗体氨基端时而增加。N端部分是可变域，而C端部分是恒定域；CH3和CK结构域实际上分别包含了轻链和重链的羧基端。如上所述，可变区允许抗体选择性地识别及特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VK结构域和VH结构域，或互补决定区(CDR)的亚类，结合以形成确定出三维的抗原结合位点的可变域。这种四元抗体结构形成了呈现在Y的每一个臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由在每条VH和VK链上的三个CDR确定(即，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。在一些例子中，例如，源自骆驼科或基于骆驼科免疫球蛋白的工程化的某些免疫球蛋白分子，完整免疫球蛋白分子可能仅由重链组成，而不具有轻链，参见例如Hamers-Castermanetal.,Nature363:446-448(1993)。在天然抗体中，存在于每一个抗原结合域中的六个“互补决定域”或“CDR”是短的、非连续的氨基酸序列，它们被特异地定位以当抗体在水性环境中呈现三维构型时形成抗原结合域。抗原结合域中的剩余部分的氨基酸(称“构架区”)展现出较低的分子间可变性。构架区主要采用β-折叠构象，CDR形成环，这些环连接β-折叠结构，在某些情况下构成β-折叠结构的一部分)。因此，构架区用于形成支架，其通过链间的非共价的相互作用而将CDR以正确的方向定位。由排列的CDR形成的抗原结合域定义出在免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促使抗体非共价地结合至它的同源表位。对于任何给定的重链或轻链的可变域，本领域普通技术人员能够轻易地分别鉴别包含CDR和构架区的这些氨基酸，因为它们已经被准确定义(参见“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,”Kabat,E.,etal.,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,(1983)；以及ChothiaandLesk,J.MoI.Biol.,196:901-917(1987),通过引用将它们整体并入本文中)。如果在本领域中对于一个术语使用和/或接受两个或更多个定义，那么在本文中，除非另有说明，否则该术语的定义意在包括所有这样的涵义。一个具体的例子是，术语“互补决定区”(“CDR”)用来描述在重链多肽和轻链多肽的可变区内都找得到的非连续抗原结合位点。这个特定的区域已在以下文献中有描述：Kabatetal.,U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest”(1983)和Chothiaetal.,J.MoI.Biol.196:901-917(1987)，通过引用将它们合并至本文中。根据Kabat和Chothia对于CDR的定义，其包括彼此对比时的氨基酸残基的重叠或子群体。但是，使用任何一种关于抗体或其可变区的CDR的定义都被认为是在本发明定义和使用的术语的范围内。包含如以上任一引用文献所定义的CDR的合适氨基酸残基被作为对比而列于以下表格中。包含特定CDR的准确残基数量根据CDR的序列和大小而变化。对于抗体的可变区氨基酸序列来说，本领域技术人员可通过常规方法确定出包含特定CDR的残基。Kabat等也定义了可适用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本领域技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统应用至任何可变域序列，而不需要依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文所使用的，“Kabat编号”是指在以下文献中阐述的编号系统：Kabatetal.,U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,“SequenceofProteinsofImmunologicalInterest”(1983)。“特异性结合”或“对……有特异性”通常是指抗体通过其抗原结合域结合至表位，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一定的互补性。根据这个定义，当抗体经由其抗原结合域相比于结合至随机的不相关的表位而言能够更快速地结合至特定表位，则称该抗体“特异性结合”至该表位。术语“特异性”被用来定量特定抗体结合特定表位的相对亲和性。例如，对于给定的表位，抗体“A”被视为比抗体“B”具有更高的特异性，或者抗体“A”结合至表位“C”的特异性高于其结合至相关的表位“D”的特异性。本文使用的术语“治疗”是指治疗性或预防性手段，其中对象被预防或减慢(缓解)不期望的病理学变化或紊乱，例如癌症的进展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是局部的或整体的)，无论这些结果是否是可检测的或不可检测的。“治疗”还指与不接受治疗预期的存活期相比存活期延长。需要治疗的对象包括已患有疾病或病症的对象以及倾向于患有该疾病或病症的对象或需要预防该疾病或病症的对象。“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何期望诊断、预后或治疗的对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、驯养动物、农畜以及动物园动物、竞技动物或宠物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。术语“有治疗需要的患者”或“有治疗需要的对象”包括可从施用本发明的抗体或组合物中受益的对象，例如哺乳动物对象，以实现例如检测、诊断程序和/或治疗的目的。二价和三价抗体在一个实施方式中，本发明提供二价抗体，其具有融合至Fab片段的其中一个链的单域抗原结合片段(VHH)。当Fab片段的另一个链也融合至单域抗原结合片段(VHH’)，那么该抗体是三价的。本发明的二价或三价抗体可以是单特异性的、双特异性的或三特异性的。当Fab和VHH具有结合至相同抗原的特异性，那么该抗体是单特异性的。如果他们具有不同的结合特异性，那么该抗体是双特异性的。如果VHH、VHH’和Fab每个具有不同的结合特异性，那么该抗体是三特异性的。如试验例中所证实的，双特异性抗体的示意性类型是靶定两个不同抗原的抗体，其中一个抗原存在于肿瘤细胞或微生物上，另一个存在于免疫细胞上。当施用至个体时，这种双特异性抗体特异性地结合至肿瘤细胞或微生物，同时特异性地结合至免疫细胞(如细胞毒细胞)。这种双重结合可导致所结合的肿瘤或微生物被宿主的免疫系统杀死。A.本发明的双特异性抗体的预料不到的性质因为VHH片段比常规抗体小且短得多，先前人们怀疑当VHH融合至Fab片段时，大的蛋白会由于位阻效应而抑制VHH的结合能力。而且，人们怀疑这种嵌合蛋白在生理条件下不会稳定。但是，在预料之外的是，所怀疑的位阻效应对本发明的二价抗体的功能具有有限的影响。而且，该抗体(不需要Fc片段)的总体亲和性与常规抗体相当。另一个惊人之处在于VHH可有效地结合至其靶标，而不论它以相同的方向(即VHH的N端连接至Fab片段的重链或轻链的N端)或是以相反的方向(即VHH的C端连接至Fab片段的重链或轻链的N端)融合至Fab片段。本发明的优点还体现于细胞表达效率和蛋白稳定性。虽然一般认为小的抗体比更大的抗体更容易在细胞中产生，但是异源二聚体抗体对于抗体产生提出了特别的挑战。这至少是因为两个(或三个或四个)不同的蛋白链可在细胞内外相互作用，导致干扰，从而降低了宿主细胞表达系统的效率，且增加了蛋白的不稳定性。因此，具有全部重链和轻链的异源二聚体抗体通常表达于两个独立的细胞，或使用共同的轻链来减少轻链与重链的错配，这导致生成无功能的抗体。即使是小于本发明公开的双特异性抗体的那些双特异性抗体也具有这些问题。例如，双特异性T细胞衔接体(BITE)是由两个典型的单链可变片段构成的融合蛋白。虽然小于(通常为55KDa)本文公开的双特异性抗体(约65KDa)，但BITE无法在细菌细胞中以可溶形式表达。目前，BITE在哺乳动物细胞中表达，其非常昂贵。预料不到的是，如试验例中所证实的，当表达于E.coli细胞时，多达约20％的本发明的双特异性抗体是可溶的(基于Western杂交分析)。如上所述，这些抗体比BITE大得多。但是，虽然细菌表达的BITE完全不溶，但本发明的抗体可轻易由细菌产生。因此，该结果是令人惊讶的且是预料之外的。因此，本发明的抗体与常规抗体相比具有相对较小的尺寸，并且能够有效地(特别是以大规模生产的方式)再例如酵母和细菌宿主中生产。这些抗体的这种稳定性、可溶性和半寿期大大优于本领域正在开发的那些双特异性抗体。从之前的描述可知，本发明的抗体表现出高细菌生产率、稳定性和接合亲和性。这种二价和三价抗体的例子分别图示于图1a和图1b中。图1a显示具有Fab部分和VHH部分的二价抗体。Fab部分包括具有可变域(VL)和恒定域(CL)的轻链。Fab部分还包括具有可变域(VH)和恒定域(CH1)的重链。不同于普通抗体的重链，该重链不包括CH2域和CH3域中的任何一个或两个。Fab片段是功能性单元，可特异性结合至抗原。在结构上，VH和VL包含适于这种特异性的CDR，CH1和CL具有适当的氨基酸残基使得它们彼此连接以形成所需的Fab结构。图1a显示了VHH片段融合至Fab片段的重链的CH1域的C端。容易意识到的是，在一些实施方式中，VHH片段也可融合至轻链。当融合至Fab片段时，VHH和Fab可具有相同的N端至C端方向，使得整个链能够以单个多核苷酸来表达。在另一个实施方式中，VHH的C端可连接至Fab片段的重链或轻链的C端。类似地，图1b显示了本发明的三价抗体，其包括Fab部分和两个VHH(VHH和VHH’)，每个VHH融合至Fab片段的一个链。抗体的Fab部分可容易地识别和制备。例如，轻链和重链的序列可从包括两个相同的Fab片段的任何常规抗体中识别。常规抗体可来源于动物或人源化，并且可进一步通过本领域已知的方法来修饰。“单域抗原结合片段”或“单域抗体片段”或“VHH”是一种能够结合至抗原而不需配备轻链的抗原结合片段。VHH最初以单个抗原结合片段的形式分离自单域抗体(sdAb)。第一个已知的单域抗体分离自骆驼(Hamers-Castermanetal.,Nature363:446-8(1993))，之后分离自软骨鱼。骆驼产生没有轻链的功能性抗体，它们的单个N端结构域(VHH)结合抗原而无需结构域配对(见HarmsenandHaard,AppMicrobiolBiotechnol.,77:13-22(2007)综述)。单域抗体不包括CH1域，在常规抗体中，CH1域与轻链相互作用。VHH包含构成免疫球蛋白结构域的核心结构的四个框架区(FR1-FR4)以及涉及抗原结合的三个互补决定区(CDR1-CDR3)。相比于人VH结构域，VHH框架区显示出与人VH结构域的高序列同源性(>80％)。参见HarmsenandHaard,2007，其进一步描述称：“VHH的最特征性的特点在于在四个FR2位置(第37、44、45和47位；Kabat编号)处的氨基酸取代，它们在常规VH结构域中是保守的，并且涉及与VL结构域的疏水相互作用”。VHH通常具有在这些以及其他在常规VH中高度保守的位置处的不同氨基酸(如Leu11Ser、Val37Phe或Tyr、Gly44Glu、Leu45Arg或Cys、Trp47Gly)。HarmsenandHaard,2007还描述了：VHH的CDR具有某些已知的特征性特点。例如，CDR1的N端部分比常规抗体更加可变。而且，某些VHH具有延长的CDR3，其通常通过与CDR1或FR2中的半胱氨酸形成额外的二硫键而稳定，导致CDR3环在之前的VL的整个界面上折叠。美洲驼VHH的特定亚家族(VHH3)还含有一个延长的CDR3，其通过与FR2的第50位的半胱氨酸形成额外的二硫键而稳定。本领域已知有许多sdAb，并且能够从例如骆驼等动物中容易制备。基于这些sdAb，它们的VHH可轻易被识别和制备。表1列出了许多VHH和sdAb的非限制性例子。因此，在一些实施方式中，本发明提供包含每个这样的公开序列或其等同物的多肽以及编码每个多肽的多核苷酸。在一个方面，该多肽包含SEQIDNO:13的氨基酸序列，或具有一个、两个或三个氨基酸插入/缺失/取代的氨基酸序列。表1.示例性的单域抗原结合片段(VHH)和单域抗体(sdAb)从上表可明显看出，这些序列的某些区域是高度保守的(例如FR1-3)，而CDR是更加可变的。B.单特异性、双特异性和三特异性抗体当Fab片段和VHH具有相同的结合特异性时，二价抗体可以是单特异性的，或者当它们具有不同的结合特异性时，二价抗体可以是双特异性的。类似地，三价抗体可以是单特异性的、双特异性的或三特异性的。双特异性抗体可被配置以靶定不同的抗原。例如，在Fab片段和VHH片段之间，一个具有对第一免疫细胞的特异性，另一个可靶定第二免疫细胞；一个具有对第一肿瘤细胞的特异性，而另一个具有对第二肿瘤细胞的特异性；一个具有对免疫细胞的特异性，另一个具有对微生物、感染细胞、肿瘤细胞、炎症细胞、凋亡细胞或外源细胞(无限定)的特异性。类似地，三价抗体可按需要配置。在一个方面，Fab、VHH和VHH’片段具有对相同抗原或表位的特异性。在另一个方面，Fab片段具有对一种抗原或表位的特异性，而VHH和VHH’片段具有对另一种抗原或表位的特异性。在另一个方面，Fab片段具有与VHH相同但与VHH’不同的结合特异性。在另一个方面，它们中的每一个都具有不同的结合特异性。二价和三价抗体的结合结构的非限制性的例子列于下表中。表2.二价抗体的示例性结构表3.三价抗体的示例性结构片段结合特异性片段结合特异性片段结合特异性Fab免疫细胞VHH第二种免疫细胞VHH’第二种免疫细胞Fab免疫细胞VHH第二种免疫细胞VHH’第三种免疫细胞Fab肿瘤细胞VHH第二种肿瘤细胞VHH’第二种肿瘤细胞Fab肿瘤细胞VHH第二种肿瘤细胞VHH’第三种肿瘤细胞Fab免疫细胞VHH肿瘤细胞VHH’肿瘤细胞Fab免疫细胞VHH肿瘤细胞VHH’第二种肿瘤细胞Fab肿瘤细胞VHH免疫细胞VHH’免疫细胞Fab肿瘤细胞VHH免疫细胞VHH’第二种免疫细胞Fab肿瘤细胞VHH免疫细胞VHH’第二种肿瘤细胞Fab免疫细胞VHH肿瘤细胞VHH’第二种免疫细胞C.结合靶标在一些实施方式中，二价抗体的Fab或VHH(或VHH’)片段具有对肿瘤抗原的免疫特异性。“肿瘤抗原”是在肿瘤细胞中产生的抗原物质，即，它引起宿主的免疫响应。肿瘤抗原可用于识别肿瘤细胞并且是癌症治疗的潜在候选物质。体内的正常蛋白不是抗原性的。但是，某些蛋白在肿瘤生成过程中产生或过度表达，因而对身体来说显得是“外源”的。这可包括很好地躲避了免疫系统的正常蛋白、通常以极小量产生的蛋白、通常仅在特定发育阶段产生的蛋白或结构由于突变而被修饰的蛋白。本领域已知有许多肿瘤抗原，通过筛选可容易发现许多新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性例子包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和Tenascin。在一些方面，Fab或VHH片段具有对相比于相应非肿瘤细胞在肿瘤细胞上过度表达的蛋白的特异性。“相应非肿瘤细胞”是指与肿瘤细胞来源的细胞具有相同细胞类型的非肿瘤细胞。要注意的是，这样的蛋白不必然不同于肿瘤抗原。非限制性的例子包括癌胚抗原(CEA)，其过度表达于大多数结肠癌、直肠癌、乳癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道癌；调蛋白受体(HER-2,neu或c-erbB-2)，其通常在乳癌、卵巢癌、直肠癌、肺癌、前列腺癌和宫颈癌中过度表达的；表皮生长因子受体，其在一系列实体肿瘤(包括乳癌、头颈癌、非小细胞性肺癌和前列腺癌)内过量表达；脱唾液酸糖蛋白受体；转铁蛋白受体；在肝细胞上表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂酶复合体受体；在胰岛导管腺癌细胞上过度表达的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)；用于抗血管新生基因治疗的血管内皮生长因子受体(VEGFR)；选择性地过表达于90％的非黏液型的卵巢癌的叶酸受体；细胞表面的多糖-蛋白复合物(glycocalyx)；碳水化合物受体；以及多聚免疫球蛋白受体，其有益于基因转运至呼吸道上皮细胞，并且对肺病(例如囊胞性纤维症)治疗有吸引力。在一个方面，VHH片段对CEA或Her2具有特异性。这种VHH的代表性的序列为SEQIDNO:1或6(表1)。在一些方面，VHH包括SEQIDNO:1或6的氨基酸序列并具有一个或两个或三个插入、缺失或取代。在一个方面，VHH包括SEQIDNO:7氨基酸序列(抗-EGFR1)，并且任选地具有一个或两个或三个插入、缺失或取代。在一些方面，Fab或VHH片段对微生物(例如病毒或细菌)具有特异性。微生物的非限制性例子包括微生物表面受体和内毒素。内毒素的例子包括，但不限于，脂多糖(LPS)和脂寡糖(LOS)。在一些方面，VHH片段包括选自SEQIDNO:8-11(表1)的氨基酸序列，或者任选地具有一个或两个或三个插入、缺失或取代。在一些方面，二价抗体的另一片段对免疫细胞具有特异性。在一个方面，该免疫细胞选自由T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性细胞和肥大细胞组成的群组。在一个方面，该另一片段特异性地识别抗原，所述抗原选自由CD3、CD16、CD19、CD28和CD64组成的群组。在一个方面，第二VHH特异地识别CD3或CD16。在一个方面，该另一片段对CD16或CD3具有特异性。VHH片段的代表性序列为SEQIDNO:2、3、4、5、12和13(表1)，或者任选地具有一个或两个或三个插入、缺失或取代。在一些方面，Fab部分包括：一个或两个选自SEQIDNO:14-25(表4)的氨基酸序列，或者任选地具有一个或两个或三个插入、缺失或取代。表4.Fab序列示例下表5展示了本发明的双特异抗体的一个实施例的氨基酸序列。表5.靶向CD3(在Fab处)和CEA(在VHH处)的双特异抗体以上描述的任何的抗体或多肽可进一步地包括额外的多肽，例如，指导所编码的多肽的分泌的信号肽、如本文所述的抗体恒定区或其他如本文所述的异源多肽。本领域普通技术人员将理解，本文所公开的抗体可被修饰，使得它们在氨基酸序列上不同于它们所其衍生的天然结合多肽。例如，源自一种特定蛋白的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如，对起始序列具有一定百分数的一致性，例如它可能和起始序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性。此外，可在“非必需”氨基酸区进行核苷酸或氨基酸的保守性取代、缺失或插入。例如，源自特定蛋白多肽或氨基酸可以同起始序列一样，除了一个或多个单个的氨基酸取代、插入、或缺失(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或更多个单独的氨基酸取代、插入或缺失)。在某些实施方式中，相对于起始序列，源自特定蛋白的多肽或氨基酸序列具有一至五、一至十、或一至二十个单独的氨基酸取代、插入或缺失。在某些实施方式中，抗原结合多肽包含通常不与抗体相连的氨基酸序列或一个或多个部分。下文详细描述了示例性的修饰。例如，本发明的片段可包含柔性连接序列，或可被修饰以添加了功能部分(例如PEG、药物、毒素或标记)。本发明的抗体、其变体或衍生物包括被修饰的衍生物，即任何类型分子共价连接至抗体，只要该共价连接不阻止抗体结合至表位。例如，但并非为了限制，抗体可以被修饰，例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基或阻断基衍生化，蛋白酶切、连接至细胞配体或其他蛋白等。通过已知的技术可实施大量化学修饰中的任何修饰，包括但不限于特异的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。此外，抗体可以包含一个或多个非典型氨基酸。在其他实施方式中，本发明的抗原结合多肽可以包含保守的氨基酸取代。在“保守的氨基酸取代”中，一个氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域被定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在免疫球蛋白多肽的非必须氨基酸残基更适宜由来自同样侧链家族的其他氨基酸残基取代。在另一个实施方式中，氨基酸链可以被结构相似但侧链家族成员的顺序或组成上不同的链取代。下表提供了保守氨基酸取代的非限制的例子。在表中相似性分数0或更高来表明在两种氨基酸的保守取代。CGPSATDENQHKRVMILFYWW-8-7-6-2-6-5-7-7-4-5-3-32-6-4-5-20017Y0-5-5-3-3-3-4-4-2-40-4-5-2-2-1-1710F-4-5-5-3-4-3-6-5-4-5-2-5-4-10129L-6-4-3-3-2-2-4-3-3-2-2-3-32426I-2-3-2-1-10-2-2-2-2-2-2-2425M-5-3-2-2-1-1-3-20-1-20026V-2-1-1-100-2-2-2-2-2-2-24R-4-300-2-1-1-101236K-5-2-10-10001105H-3-20-1-1-111236Q-5-10-10-12214N-40-1100212E-50-100034D-51-10004T-200113A-21112S0111P-3-16G-35C12在一些实施方式中，抗体可以被结合至治疗性的制剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂类、生物效应调节物、药物制剂或PEG。这些抗体可以被结合或融合至治疗性的制剂，这种治疗性制剂可包括可检测标记(例如放射性标记)、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或诊断剂、细胞毒性制剂(药物或毒素)、超声增强剂、非放射性标记、它们的组合和其他本领域已知的制剂。通过耦合至化学发光的化合物来标记抗体，则该抗体可以被检测。然后，通过检测荧光(出现在化学反应过程中)的存在，来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。极其有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。编码抗体的多核苷酸及制备抗体的方法本发明也提供了分离的编码双特异抗体、其变体或衍生物的多核苷酸或核酸分子。本发明的多核苷酸可在相同的多核苷酸分子上或在独立的多核苷酸分子上编码全部的VHH、其变体或衍生物。此外，本发明的多核苷酸可在相同的多核苷酸分子上或在独立的多核苷酸分子上编码抗体的或VHH、其变体或衍生物的一部分。在某些实施方式中，制备的抗体将不会在受试动物(例如人体)上引起有害的免疫反应。在一个实施方式中，使用领域认可的技术修饰本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物以降低它们的免疫原性。例如，抗体可以是人源化的、灵长化的、去免疫性的，或者可制备嵌合抗体。本发明的双特异抗体的结合特异性能通过体外分析(例如，免疫沉淀法、放射免疫测定(RIA)或免疫酶联吸附法(ELISA))来确定。生产系统和方法本发明还提供了用于生产本发明的双特异性抗体的方法和系统。本领域公知的适于生产抗体的细胞包括人类细胞(例如CHO细胞)、哺乳动物细胞和细菌细胞。用细菌细胞来生产双特异抗体存在重大挑战。然而，正如在实施例中所展示的，当在细菌细胞中表达抗体时，即使是两个肽链都表达于相同细胞中时，产生的抗体很大程度上也是可溶的。因此，在一个实施方式中，本发明提供了包含一个或多个编码本发明的双特异抗体的两个链的多核苷酸的宿主细胞。在一个方面，单核苷酸构建体(例如质粒)包括两个编码序列。在另一个方面，本发明提供两种不同多核苷酸构建体，每一个编码其中一个多核苷酸链。在一个实施方式中，本发明还提供了包含本发明的双特异抗体的两个多肽链的宿主细胞。在一些方面，所述宿主细胞是人类细胞。在一些方面，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述宿主细胞是酵母细胞。在一些方面，所述宿主细胞是细菌细胞，包括G+和G-细菌细胞。代表性的细菌细胞包括，但不限于，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。在某些方面，本发明还提供制备本发明的双特异性抗体的方法。在一个方面，该方法需要在宿主细胞中表达该抗体的两个肽链并且从细胞裂解液中提取抗体。此外，本发明还提供由这些方法得到的双特异性抗体。治疗和诊断方法如上所述，本发明的双特异性抗体、其变体或衍生物可用于与癌症或感染性疾病相关的某些治疗和诊断方法中。本发明进一步涉及基于抗体的疗法，其涉及将本发明的双特异性抗体施用至患者，例如动物、哺乳动物和人体，以治疗本文所述的一种或多种疾病或症状。本发明的治疗性组合物包括，但不限于，本发明的抗体(包括本文所述的其变体和衍生物)和编码本发明的抗体(包括本文所述的其变体和衍生物)的核酸或多核苷酸。本发明的抗体可被用来治疗、抑制或预防以下疾病、失调或病症，包括与例如与增加细胞存活或抑制细胞凋亡相关的疾病或失调(如癌症)相关的恶性疾病、失调或病症，所述癌症包括但不限于滤泡性淋巴瘤、带有p53突变的癌症以及激素依赖的肿瘤(包括但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑色素瘤、成视网膜瘤、恶性胶质瘤、肺癌、大肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经母细胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺癌、乳腺癌、前列腺癌、Kaposi肉瘤)；自体免疫失调(例如多发性硬化症、Sjogren综合征、Grave病、Hashimoto甲状腺炎、自体免疫糖尿病、胆汁性肝硬变、Behcet病、Crohn病、多肌炎、系统性红斑狼疮、免疫相关的肾小球肾炎、自体免疫的胃炎、自体免疫的血小板减少性紫癜及类风湿性关节炎)；和病毒性感染(例如疱疹病毒、痘病毒及腺病毒)、炎症、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、急性移植物排斥和慢性移植物排斥。本发明的抗原结合多肽、其变体或衍生物被用于抑制癌症的发展、演进和/或转移，特别是在上文或随后的段落中列出的癌症。可用本发明的抗体或其变体或衍生物治疗、预防、诊断和/或预后与细胞存活增加相关的其他的疾病或病症，包括但不限于，以下疾病的进展和/或转移：恶性肿瘤及相关疾病，例如白血病(急性白血病(如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞、单核细胞和白血病细胞))和慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多、淋巴瘤(如Hodgkin病和非Hodgkin病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤(包括但不限于：肉瘤和癌(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊锁瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、Ewing瘤、平滑肌瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、胸腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、Wilm肿瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、形状细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、间胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网细胞膜瘤))。本发明的抗体也可通过靶定微生物和免疫细胞来影响微生物的消除而用于治疗由微生物引起的感染性疾病或杀灭微生物。在一个方面，该微生物是病毒(包括RNA和DNA病毒)、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、原生动物或真菌。对于任何特定病人特异的剂量和治疗方案将取决于多种因素(包括所使用的特异抗原结合多肽、其变体或衍生物，患者的年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物的联合以及被治疗的特定疾病的严重程度)。医护人员对这样的因素的判断属于本领域普通技术人员判断范围内。该剂量还会基于被治疗的个体病人、施用途径、配方的类型、所使用的组合物的特点、疾病的严重程度及所期待的效果。使用的剂量可通过本领域所公知的药理学和药代动力学的原则决定。双特异抗体、变体的施用方法包括但不限于：皮内的、肌内的、腹腔的、静脉的、皮下的、鼻内的、硬膜外的和口腔途径。抗原结合多肽或组合物可以通过任何方便途径施用，例如，通过输注或弹丸式注射、通过上皮或黏膜保护层的吸收(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等等)；它可同其他生物活性制剂一起使用。因此，包含本发明的抗原结合多肽的药用组合物可以经口腔、直肠、肠外、阴道内、腹腔、局部(如通过粉剂、软膏、滴剂或皮肤药贴)、含服施用或是通过口腔或鼻的喷雾施用。本文所用的术语“肠胃外的”是指施用的方式，这种方式包括静脉内的、肌内的、腹腔的、胸骨内的、皮下的和关节内的注射和输注。施用可以是系统的或局部的。此外，可预期通过任何合适途径将本发明的抗体引入至中枢神经系统，这些途径包括：脑室内和鞘内的注射；通过脑室内导管(例如连接至储存器(例如Ommaya储存器))可以促进脑室内的注射。也可采用肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器及带有气雾剂的配方给药。将本发明的双特异抗体或组合物局部施用至需要治疗的区域可能是合乎需要的；这可通过例如(但不限于)以下方式实现：手术中局部输注、局部施用(例如在术后联合使用伤口敷料)、注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物(植入物为多孔的、非多孔的、非渗透的或凝胶状的材料，包括薄膜(例如硅胶膜)或纤维))。优选地，当给予包括本发明的蛋白(包括抗体)时，需注意使用此蛋白不吸附的材料。本发明的抗体在炎症、免疫或恶性疾病、失调或病症的治疗、抑制和预防中有效量，可以通过标准的临床技术来确定。此外，可以选择性地采用体外测定来帮助识别最佳剂量范围。在配方中采用的准确的剂量也将取决于给药的途径以及疾病、失调、或病症的严重性，并且应当根据执业医生的判断和每一个患者的情况来决定。有效剂量可以从源自体外的或动物模型测试系统的剂量-反应曲线推论出。作为一般性的建议，给予患者的本发明的抗原结合多肽的剂量通常为0.1mg/kg至100mg/kg患者体重、0.1mg/kg至20mg/kg患者体重，或1mg/kg至10mg/kg患者体重。总体来说，由于对外源的多肽的免疫反应，在人体内，人的抗体比来自其他种属的抗体具有更长的半衰期。因此，人抗体的较低给药剂量和更低给药频率通常是可能的。而且，本发明的抗体的给药频率和剂量可通过修饰(例如脂化)而增强这些抗体的摄入和组织穿透力(例如进入大脑)来降低。用于治疗感染或恶性疾病、病症或失调的方法(包含给予本发明的抗体、其变体或衍生物)，在用于人体前，通常在体外被测试，然后在可接受动物模型中进行体内测试，以获得期待的治疗或预防活性。合适的动物模型(包括转基因动物)对本领域普通技术人员是熟知的。例如，表明本文所述的抗原结合多肽的治疗效用的体外实验包括抗原结合多肽在细胞系或病人组织样品上的效果。利用本领域技术人员所知的技术(例如在本文其他地方公开的试验)可确定抗原结合多肽在细胞系和/或组织样品上的效果。根据本发明，可被用来确定是否需要使用特异性的抗原结合多肽的体外试验包括体外细胞培养试验(其中病人组织样品在培养基中生长并被暴露于或以其他方式给予抗体)以及观察这种抗体在该组织样品上的效果。在进一步的实施方式中，本发明的组合物与抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗菌剂或抗生素制剂或抗真菌制剂联合施用。任何这些在本领域已知的制剂都可以在本发明的组合物中被给予。在另一个实施方式中，本发明的组合物与化疗制剂联合给予。可与本发明的组合物一起给予的化疗制剂包括但不限于：抗生素衍生物(例如阿霉素、博来霉素、道诺霉素、防线菌素)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、抗代谢物(例如氟尿嘧啶、5-FU、氨甲嘌呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯嘌呤和6-巯基鸟嘌呤)、细胞毒剂(例如卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂及长春新碱硫酸盐)、激素(例如甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、乙炔雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲羟睾酮、二磷酸己烯雌酚、氯烯雌醚及睾内酯)、氮芥衍生物(苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙胺(氮芥)、噻替哌)、类固醇类及制品(倍他米松磷酸钠)及其他(例如达卡巴嗪、天冬酰胺酶、米托坦、长春新碱硫化物、长春花碱硫化物和依托泊苷)。在另外的实施方式中，本发明的组合物与细胞因子联合给予。可与本发明的组合物一起被给予的细胞因子包括但不限于：IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗-CD40、CD40L和TNF-α。在另外的实施方式中，本发明的组合物与其他治疗或预防疗法(例如放射治疗)联合给予。组合物本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效量的抗体及可接受的载体。在一个具体实施方式中，术语“药学上可接受的”意为由联邦的或州政府的监管机构许可的、或在美国药典或其他通常公认的药典所列的用于动物，更具体来说，用于人的。进一步地，“药学上可接受载体”通常将是无毒的固态的、半固态的或液态的填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的辅料。术语“载体”是指药物使用所借助的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这样的药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物被静脉注射地给药时，水是首选载体。盐溶液及水性的葡萄糖与甘油溶液也可以作为液相的载体被采用，特别是对可注射的溶液来说。合适的药物赋形剂包括：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可以包含少量的润湿或乳化剂或pH缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。也可预期加入抗菌制剂(例如苄醇或苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)；螯合剂(乙二胺四乙酸)和用于等张性调节的制剂(例如氯化钠或右旋糖)。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、药片、药丸、胶囊、粉末、缓释配方等形式。该组合物可使用惯常的粘合剂和载体(例如甘油三酯)而作为栓剂配制。口服配方可包括标准的载体，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。在Remington'sPharmaceuticalSciences中由E.W.Martin描述合适的药物载体的例子(通过引用将其合并至本中)。这样的组合物将包含治疗上有效量的抗原结合多肽(较好为纯化的形式)与合适数量的载体，以便为患者提供合适的给药方式。这种配方应适合给药的方式。这种亲代(parental)制剂可装于安瓿瓶、一次性注射器或是玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。在一种实施方式中，根据例行程序将该组合物配制成适于静脉给药于人类的药物组合物。通常，用于静脉给药的组合物为在无菌等渗的水性缓冲液中的溶液。在必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉药(例如利多卡因，以减轻注射部位疼痛)。组分通常是单独或是混合在一起以单位剂量形式提供，例如，在密闭容器(例如标明活性制剂的数量的安瓿或sachette)中的冻干粉剂或无水浓缩物。当组合物通过输注给予时，它可分散于含有无菌的药物级水或盐水的输液瓶中。当组合物通过注射给予时，可提供一个安瓿的用于注射的无菌水或盐水，以便在给药前此成分可以被混合。本发明的组合物可以被配制成中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括由阴离子形成的盐，例如那些源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，及由阳离子形成的盐，例如那些源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、乙基羟乙胺、组氨酸、普鲁卡因等的盐。实验例实施例1.双特异抗体诱导T-细胞介导的细胞毒性该实施例提供了一种新的双特异抗体形式，通过将靶定CEA阳性的肿瘤细胞的单域抗-CEAVHH连接至结合T细胞的抗-CD3Fab而成。这样的抗体(S-Fab)可募集T细胞至CEA-阳性的肿瘤细胞。通过使T细胞参与，这种S-Fab抗体在体外有效地杀伤CEA阳性的肿瘤细胞。在异种移植的模型中，该S-Fab抗体展现了有力的肿瘤抑制效果，表明这样的策略用于许多免疫疗法中。进一步地，该S-Fab抗体可以从E.coli中被有效地且稳定地表达和纯化。该实施例利用了单域抗体(VHH)和Fab片段的组合来生产异质二聚体抗体。在这种形式中，一个抗-CEAVHH被连接至抗-CD3抗体(VH-CH1)的部分重链的C端，然后所产生的VH-CH1-VHH链与抗-CD3轻链(VL-CL)配对来形成S-Fab双特异抗体。CEA被选为靶标，是因为它通常在癌症(结肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肺癌、乳癌、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌)中过度表达。这种S-Fab抗体从E.coli中被表达和纯化。体外实验证实S-Fab的肿瘤细胞杀伤功能对CEA-阳性的肿瘤细胞是特异性的并且是依赖T细胞的。在体内，这种S-Fab抗体抑制肿瘤发展。因此，这样的抗体形式呈现了作为免疫治疗剂的双特异抗体的新形式。方法与材料Fab设计和蛋白纯化构建如图2a-b的S-Fab蛋白HCBF5/6和对照FabHCBF4/5。基于公开的序列合成抗-CD3(人源化的UCHT1)基因(见表5)。骆驼抗-CEAVHH序列被克隆到CH1域的C端。信号序列被添加至每一个链的N端用于周质表达。重组抗体的质粒被共转化进入BL21(DE3)感应细胞，并且在带有合适的抗生素选择的LB培养基中共表达。对于蛋白表达，1L培养物于16℃生长20h至OD6000.8-1.0(0.1mMIPTG诱导)。细菌细胞在4℃，4400rpm离心30min形成细胞团块。在冷冻的蔗糖溶液中(20mMTris-HClpH8.0；25％(w/v)蔗糖；1mMEDTA；1mMPMSF)以1:4(m/v)重悬细胞团块而携带周质提取物。这种悬浮液在8,500g离心20min，上清液为蔗糖组分。细胞团块在冷冻的周质溶液(5mMMgCl2)中被重悬，悬浮液在8,500g离心20min，上清液为周质组分。通过由C端His8-标记的固定化金属亲和层析的两个步骤，从蔗糖组分和周质组分的混合组分中纯化这种蛋白。按制造商所述，使用GESuperdex200Increase10/300GL进行了凝胶过滤。凝胶过滤的蛋白标记购自Sigma(MWGF1000)。细胞系和动物所有细胞系(包括CEA阳性的人直肠癌细胞系HT29、DLD-1和LS174T，CEA阴性的人直肠癌细胞系SKOV3，和JurkatT细胞系)购自中国科学院典型培养物保藏中心(中国，上海)。在5％CO2,37℃潮湿的培养箱中，HT29和SKOV3在含10％的胎牛血清(Gibco,LifeTechnologies,China)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的DMEM培养基(Gibco,LifeTechnologies,China)中培养，LS174T和Jurkat含有10％胎牛血清(Gibco,LifeTechnologies,USA)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的RPMI-1640培养基(Gibco,LifeTechnologies,China)中培养。Nod/SCID小鼠购自中山大学实验动物中心。人血液采集、动物照料和动物实验由中山大学批准。从PBMC分离T细胞使用Ficoll密度离心从健康捐赠者中制备人PBMC。用EasySepTM人CD3阳性选择试剂盒(STEMCELLTechnologies,Inc.,Vancouver,Canada)纯化T细胞。分离的T细胞培养于含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的完全的RPMI1640培养基中，置于37℃,5％CO2潮湿培养箱。CEA和S-Fab相互作用的表面等离子体共振(SPR)试验癌胚抗原CEA全长蛋白(ab742，Abcam)被用于固定化芯片(GLC芯片,#33D211O1,Bio-Rad)。在固定化后，在25℃，以5μl/min流速的PBST(10mMNa3PO4，150mMNaCl,0.01％Tween，pH＝7.4)作为电泳缓冲液，进行了对不同样品的相互作用分析。用ProteOnTMXPR36(Bio-rad)收集数据，使用ProteinOnevaluation软件(Bio-rad)分析这些数据以适用合适的结合模型。根据结合与解离相的拟合测定动力学常数。KD源自这些常数的比率。阳性对照(CEA/CD66e(CB30)MousemAb(#2383,CellSignaling)用于优化此过程。流式细胞分析为了检查S-Fab与CD3细胞表面标记的结合，1×106Jurkat细胞/样品被离心收集(1000rpm，5min)，然后用1ml冰冷的PBS+0.1％BSA清洗。细胞团块在100ul冰冷的PBS+0.1％BSA中重悬。抗-CD3抗体(R&Dsystems,MAB100)、HCBF4/5和HCBF5/6(S-Fab)被加至终浓度50ug/ml。细胞与一抗在冰上孵育一小时。细胞被用冰冷的PBS+0.1％BSA清洗两次。然后，羊-抗-鼠Alexa488或抗-Flag-FITC被加至终浓度10ug/ml。细胞在冰上再孵育一小时。清洗在细胞两次后，进行流式细胞分析。细胞毒性试验SKOV3、HT29和LS174T被用作靶细胞。人PBMC或分离的未预刺激的T细胞被用作效应细胞。100ul的靶标细胞(5000个细胞)被转移至96孔板的每一个孔(一式四份)。在6小时孵育后，等体积的CD3+T细胞以E:T(10:1或5:1)的比率被加至每一个孔。然后加入从0.01ng/ml至10ug/ml的所示浓度的抗体。在48小时孵育后，细胞用PBS洗两次。10ulCCK8Kit随后被加入至每一个孔中。通过”Magellan”软件使用TECANInfiniteF50进行测量。靶细胞存活率(％)按照此公式计算：[(存活靶细胞(样品)-培养基)/(存活靶细胞(对照)-培养基)]×100。在竞争性试验中，LS174T被用作靶细胞。效应细胞对靶细胞的比率是10:1。HCBF4/5和HCBF5/6以1:1、1:10和1:100的比率加入。然后，如上所述进行细胞毒性试验。体内试验非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠饲养于中山大学实验动物中心，在无菌和标准化环境条件下(20-26℃室温，40％-70％相对湿度，及12小时昼夜节律)小鼠接受高压灭菌的食物、垫料和无菌饮用水。从细胞培养液中收获的LS174T人结肠癌细胞，用PBS洗一次，在PBS中重悬，然后与自健康捐赠者刚分离的PBMC混合。细胞悬液被皮下注射于右侧，总体积0.4mL/小鼠，混合有1x106LS174T细胞和5x106人PBMC。在LS174T/T细胞移植后一小时，腹腔注射(i.p.)给予抗体或载体对照(PBS)。然后，在接下来的7天每日治疗这些动物。肿瘤大体形成于移植后大约8到10天。用游标卡尺在两个垂直的方向上测量肿瘤体积，使用此公式(宽度2x长度)/2计算体积。所有结果以每一组的算术平均值表示。结果S-Fab双特异抗体构建和纯化通过抗-CEA单域抗体和常规抗-CD3Fab的连接而设计出双特异抗体S-Fab(图2a,2b)。该单价抗-CD3Fab被期望识别T细胞和募集T细胞。在VH-CH链的C端，抗CEAVHH与Fab融合。S-Fab的表达水平与对照抗CD3Fab的表达水平相当。为了促进S-Fab的表达和纯化，S-Fab的两个链被克隆进两个不同的质粒；周质表达被用于纯化此复合体(图2c,2d)。与Fab相似，此S-Fab以异质二聚体的形式被纯化。免疫印迹(图2c,2d)展现了该半抗体的确折叠成一个完整的Fab。在第二次Ni-NTA亲和纯化后，此蛋白的纯度超过90％(图2e)。然后，凝胶过滤被用于分析此纯化蛋白。轻链和重链组合成完整Fab抗体(图2e)，分子量(～65KD和～50KD)如预期分子量一样。S-Fab识别抗原CD3和CEA为了检测此纯化抗体是否能识别这些抗原，进行流式细胞术分析以表征CD3抗原与S-FabHCBF5/6的结合。对于对照抗体OKT3，观察到了在D3阳性的Jurkat细胞上的阳性表达(图3a)。S-FabHCBF5/6也具有在Jurkat细胞上的阳性表达(图3a)，表明HCBF5/6可结合至Jurkat细胞。这种低强度可能是由于Fab的单价造成的。为了确认S-Fab与CEA的结合，该实施例使用SPR来测量S-Fab与CEA的结合。对于对照FabHCBF4/5，没有检测到与CEA的结合(图3a)。在kd～12.5nM时可观察到S-FabHCBF5/6与CEA的牢固结合(图3b)。HCBF5/6S-Fab杀伤特异性表达CEA的肿瘤细胞为了评估S-Fab是否能靶定肿瘤细胞以实现T细胞介导的细胞杀伤，进行了细胞毒性测定。在E:T10:1(图4a)或5:1(图4b)的比率，对于S-Fab(HCBF5/6)或对照CD3Fab(HCBF4/5)都没有观察到对CEA阴性的细胞系(SKOV3)的细胞毒性。对于CEA阳性的细胞系(LS174)，对照抗CD3Fab(HCBF4/5)没有细胞杀伤作用；但S-Fab(HCB5/6)可以诱导细胞杀伤(图4b)。对于CEA阳性细胞系(HT29)，对照CD3Fab(HCBF4/5)本身即可杀伤肿瘤细胞，然而，S-Fab(HCBF5/6)比HCBF4/5可诱导更高细胞杀伤活性(图4a和4b)。免疫印迹分析表明LS174T细胞比HT29细胞具有更高CEA表达(图4c)。在剂量反应实验中，相比于在HT29细胞上，S-FabHCBF5/6在LS174T细胞上具有更低的IC50(图4d)，进一步地确认CEA的表达对于S-FabHCBF5/6介导的细胞杀伤是重要的。T细胞结合介导S-Fab的细胞杀伤活性为了进一步地确认T细胞对S-FabHCBF5/6诱导的细胞杀伤必不可少，进行了竞争性测定。CD3+T细胞和LS174T以E:T＝10:1的比率使用。当1nMHCBF5/6被用于肿瘤细胞和T细胞时，引发了有效的细胞杀伤(图5)。然而，当应用增大量的FabHCBF4/5时，细胞杀伤效应缩小。由于单独的FabHCBF4/5对细胞杀伤不具影响，此数据表明S-FabHCBF5/6需要结合至T细胞来引导细胞杀伤。当T细胞的结合被对照抗体HCB4/5竞争隔离时，则诱导了较低的细胞杀伤作用。S-Fab在体内抑制肿瘤生长该实施例测试了S-FabHCBF5/6是否能在体内抑制肿瘤生长。LS174T细胞与人PBMC混合，然后在NOD-SCID小鼠上皮下移植。然后，这些小鼠用20ug的S-FabHCBF5/6，或作为对照组的PBS或对照FabHCBF4/5(n＝5)来处理。对于仅用PBMC治疗的肿瘤或含对照FabHCBF4/5的PBMC治疗的肿瘤没有观察到肿瘤生长抑制。对于用PBMC和HCBF5/6治疗的小鼠观察到了明显的肿瘤生长抑制(图5)。在用PBMC和HCBF5/6治疗的小鼠中，仅五分之二的小鼠形成了肿瘤。在其他三组小鼠中没有观察到肿瘤生长。这些数据确认了S-FabHCB5/6可特异性地抑制在移植瘤小鼠中的肿瘤生长。该实施例提供了双特异抗体的新的形式(S-Fab)。双特异抗体作为强有力的免疫治疗方法已经引起了极大兴趣。对于它们的抗肿瘤活性的各种各样的形式已经被提出和研究。在它们之中，因为BITE通过直接靶向T细胞诱导强的抗肿瘤活性，所以BITE(两个单链Fv融合的抗体)展现了广阔的前景。Blinatumomab(靶定CD19和CD3的BITE抗体)已经被允许在临床上用于B细胞白血病。然而，单链Fv融合蛋白(通过BITE和其他相似的技术使用)具有聚集的趋势和在细菌细胞内表达的难题。一种新的双特异抗体(S-Fab)以常规Fab为基础(图2b)，其中单域抗体连接至VH-CH1的C端。不同于BITE或其他单链Fv，在本研究中S-Fab的抗-CD3部分是Fab的天然形式，因此更趋于稳定。测试了一些不同的抗CD3抗体，由于源自UTCH1克隆的抗CD3Fab展现出在E.coli.更好表达和可溶性，因而将它在本研究中使用。由于这种抗CD3Fab可以在E.coli中表达和生成，它极大地减少ScFv表达的复杂性，ScFv通常需要昂贵的哺乳细胞表达系统。S-Fab提供了双特异抗体的新形式，其具有多种优势。在本发明中使用天然人抗-CD3Fab，T细胞可以参与杀伤肿瘤细胞。实施例2.双特异抗体诱导NK-细胞介导的细胞毒性该实施例提供了一种新的双特异抗体形式Her2-S-Fab，通过将单域抗-CD16VHH连接至曲妥珠单抗(Trastuzumab，)Fab的C末端构建而成。Her2-S-Fab可经细菌细胞表达和纯化。在体外细胞实验中，Her2-S-Fab可通过招募NK细胞特异性杀死Her2过表达的癌细胞。与曲妥珠单抗相比，观察到了增强的肿瘤细胞杀伤效果。体内研究表明，Her-2-S-Fab可抑制肿瘤进展。方法与材料Fab设计与蛋白纯化Her2-S-Fab及对照Her2-Fab的构建体显示于图6a中，通过标准DNA克隆技术，首先化学合成曲妥珠单抗抗Her2VL-CL和VH-CH1(见表5)，并克隆到pET21a载体和pET26b载体中。随后，将VHH-CD16克隆到曲妥珠单抗抗Her2VH-CH1的C-末端。在N-末端添加信号序列pelB以实现细胞周质表达。VL-CL/VH-CH1-VHH(CD16)的异源二聚化形成了Her2-S-Fab，而VL-CL/VH-CH1的异源二聚化形成了Her2-Fab。在E.coli中的细胞周质蛋白纯化简述如下。编码不同多肽的两个质粒被共转化至具有合适抗生素标记的BL21(DE3)细胞中。诱导蛋白质表达并提取细胞周质。通过Ni-NTA琼脂糖亲和色谱以及抗IgGCH1亲和纯化从蔗糖与细胞周质成分的混合物中纯化出抗Her2Fab或Her2-S-Fab(图6b)。使用GEHiload16/600Superdex200pg按制造商(GE)说明进行凝胶过滤。凝胶过滤的蛋白质标记物购自Sigma(MWGF1000)。细胞系和动物Her2阳性癌细胞系SKBR3(人乳腺癌细胞)、BT474(人乳腺癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、MCF7(人乳腺癌细胞)以及Her-2阴性癌细胞系MDAMB435、MDAMB468、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)均购自中科院典型培养物中心(上海)。SKBR3、SKOV3和MDAMB435细胞培养于添加了10％HI胎牛血清(Gibco,LifeTechnologies,USA)和1％青霉素/链霉素(HyClone)的DMEM培养基(Gibco,LifeTechnologies,China)中；BT474和CHO细胞培养于添加了10％HI胎牛血清(Gibco,LifeTechnologies,USA)和1％青霉素/链霉素(HyClone)的RPMI-1640培养基(Gibco,LifeTechnologies,China)中；MDAMB468细胞培养于L15(Gibco,LifeTechnologies,China)中，置于温度37℃、湿度5％的CO2培养箱中。Nod/SCID小鼠购自中山大学实验动物中心。人血液采集、动物照料和动物实验由中山大学批准。血细胞分离使用Ficoll密度离心从健康捐赠者中制备人外周血单核细胞(PBMC)。用EasySepTM人NK细胞富集试剂盒(STEMCELLTechnologies,Inc.,Vancouver,Canada)纯化NK细胞。分离的NK细胞培养于含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的完全RPMI1640培养基中，置于37℃,5％CO2潮湿培养箱。流式细胞分析当组织培养细胞融合度达到80-90％时，加入0.25％胰蛋白酶消化。在1500rpm离心5分钟按1×105细胞/样品收集细胞，然后用3ml冰冷的PBS+0.1％BSA清洗两次。细胞团块在500ul冰冷的PBS+0.1％BSA中重悬。每个试管中分别加入曲妥珠单抗、Her-2Fab或Her2-S-Fab作为一抗；羊-抗-人IgG(H+L)AlexaFluor488(Invitrogen,cat#A11013)作为二抗。HER2/neu-PE(BD,cat#340552)作为对照。清洗在细胞两次后，进行流式细胞分析。细胞毒性试验SKBR3、BT474、MCF7、SKOV3、MDAMB435、MDAMB468和CHO细胞被作为靶(T)细胞。人PBMC细胞或分离的NK细胞(未经刺激)被用作效应(E)细胞。100μl的靶细胞(5000个细胞)被转移至96孔板的每一个孔(一式三份)。在12小时孵育后，等体积的NK细胞以E:T(10:1)的比例被加至每一个孔。然后加入从0.01ng/ml至10μg/ml的所示浓度的抗体。在72小时孵育后，使用CCK8试剂(Dojindo，CK04)对细胞存活率进行定量分析。靶细胞存活率(％)按照此公式计算：[(存活靶细胞(样品)-培养基)/(存活靶细胞(对照)-培养基)]×100。体内肿瘤生长抑制试验从细胞培养液中收获SKOV3细胞，用PBS洗一次，在PBS中重悬，然后与从健康捐赠者刚分离的PBMC混合。细胞悬液被皮下注射于NOD/SCID小鼠右侧，总体积0.2mL/小鼠，混合有2x106SKOV3细胞和1x107人PBMC。在SKOV3/PBMC细胞移植后2小时，腹腔注射(i.p.)给予抗体或载体对照(PBS)。然后，在接下来的6天每日治疗这些动物并观测小鼠状态。用游标卡尺在两个垂直的方向上测量肿瘤体积，使用公式(宽度2x长度)/2计算体积。所有结果以每一组的算术平均值表示。结果Her2-S-Fab和Her2-Fab的纯化Her2-Fab和Her2-S-Fab的纯化通过两步法实现，首先使用Ni-NTA-琼脂糖，再使用抗-CH1亲和纯化(图6b)。因为VHH相对较小且为可溶性的，添加抗CD16VHH不会影响抗Her2Fab的表达水平和溶解度。Her2-S-Fab的溶解度和表达水平与对照Her2-Fab相当(0.6mg/L)。为了确定Her2-S-Fab是否正确地折叠成为异源二聚物，使用凝胶过滤法来分析纯化的蛋白。蛋白的大部分形成了单个的峰。轻链和重链组成完整的Fab抗体，分子量为约65kD(图6c)和约50kD(数据未示出)，分别与Her2-S-Fab和Her2-Fab的预期分子量相似，表明大部分Her2-S-Fab都正确地折叠。Her2-S-Fab识别Her2阳性细胞为验证Her2-S-Fab是否可以结合至Her2阳性表达细胞，利用HER2阳性和HER2阴性细胞进行流式细胞分析。结果显示，使用对照抗Her2抗体，Her2阴性细胞CHO、MDAMB435和MDAMB468具有非常低的、甚至没有染色；MCF7具有非常低的Her2表达；而BT474、SKBR3和SKOV3细胞具有高Her2表达(图7a)。曲妥珠单抗可以染色HER2表达细胞(图7b)。Her2-Fab和Her2-S-Fab都可结合至HER2阳性细胞(图7c和7d)，并且显示出相似的荧光强度变化，表明对照Fab和Her2-S-Fab具有相似的结合能力。Her2-Fab和Her2-S-Fab也显示出于曲妥珠单抗相同的染色模式，强度较低，这与Her2-Fab以及Her2-S-Fab的单价性质一致。Her2-S-Fab诱导NK细胞介导的细胞毒作用为了评价Her2-S-Fab的细胞毒作用，Her2-Fab、Her2-S-Fab以及曲妥珠单抗被与癌细胞以及新鲜分离的NK细胞一起培养。在10μg/ml的浓度下，即使存在NK细胞，HER2-阴性细胞系CHO中也没有观察到细胞毒性(图8a)。对于HER2过表达的细胞系SKOV3，当不存在NK细胞时，只有曲妥珠单抗降低细胞增殖，存活率为72％(图8a)，Her2-S-Fab或Her2-Fab对细胞存活率无影响。但是，当存在NK细胞时，Her2-S-Fab诱导强烈的细胞毒性，并且比曲妥珠单抗的细胞毒性更高(存活率10.70％vs33.12％)(图8a)。Her2-S-Fab的细胞毒作用依赖于抗CD16，因为单独的Her2-Fab即使在存在NK细胞的情况下也没有细胞毒作用(图8a)。为进一步评价Her2-S-Fab在肿瘤细胞上的作用，我们测定了不同抗体在癌细胞上的剂量反应。Her2-Fab对细胞存活率没有或仅有很少的影响，而不论Her2表达状态如何(图8b-f)。曲妥珠单抗在无NK细胞时仅对Her2高表达细胞SKOV3具有轻微的肿瘤抑制作用(图8b-f)。在存在NK细胞的情况下，曲妥珠单抗和Her2-S-Fab对SKBR3和SKOV3细胞引起强烈的细胞毒作用，并且呈剂量依赖性，但对于HER2阴性细胞系MDAMB435以及CHO没有作用(图8b-f)。对于MCF7(Her2低表达癌细胞)需要高浓度的抗体才能诱导细胞毒作用，表明Her2-S-Fab的活性依赖于Her2的表达。在MCF7、SKBR3和SKOV3细胞中，Her2-S-Fab都显示出比曲妥珠单抗更强的细胞毒作用，表明Her2-S-Fab与曲妥珠单抗更有效。Her2-S-Fab抑制体内肿瘤生长使用过继转移模型来测试Her2-S-Fab是否可以在体内抑制肿瘤生长。首先将SKOV3细胞与人PBMC细胞混合，随后皮下移植到NOD/SCID小鼠中。小鼠随后用PBS、Her2-Fab或Her2-S-Fab处理。对于以Her2-Fab处理的小鼠，没有观察到肿瘤生长的抑制。但是，对于Her2-S-Fab，观察到的强大的肿瘤生长抑制现象(图9)。因此，Her2-S-Fab可被用来使NK细胞导向Her2过表达细胞。Her2-S-Fab能够在体内和体外有效地杀伤Her2阳性癌细胞。说明书中引用的所有专利和其他参考文献都是本发明所属领域普通技术人员的水平的表示，通过引用将它们以整体形式合并至本文中，包括其中的任何表格和附图，就如同每个参考文献都单独通过引用以其整体形式合并至本文中一样。本领域技术人员会容易意识到，本发明可容易改造而获得本文所述的那些目的和优点以及隐含在本文中的那些目的和优点。在本文中以当前优选实施方式的代表的形式描述的方法、变体和组合物是示例性的，并不意在限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，可对它们做出改变或将其用于其他用途，但这都包括在如所附权利要求定义的本发明的范围内。此外，当以马库什群组或其他替代物组群形式描述本发明的一些特征或方面时，本领域技术人员会意识到，本发明也以该马库什群组或其他群组的任何单个成员或成员的子群组的形式被描述。而且，除非有相反表示，否则当一些实施方式中提供了各种数量值时，通过取任何两个不同的值作为一个范围值的端点，来描述其他实施方式。这些范围值也在本发明的范围之内。在适当时候，本文中解释性地描述的内容可在缺少未在本文具体公开的任何一个或多个元件、一个或多个限制条件的情况下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包括”、“实质上由…组成”以及“由…组成”中的任何一个都可被其他两个术语替代。因此，要理解的是，虽然本发明已通过优选实施方式和任选的特征具体公开，但本领域技术人员可对本文公开的想法做出修改和变化，而这些修改和变化仍属于所附权利要求定义出的本发明的范围之内。当前第1页1 2 3