一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除MSTN基因的方法与流程

文档序号:11837994阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

(1)构建pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2载体,构建方法如下:

A、从基因数据库中下载多物种MSTN基因的核苷酸序列,并进行同源比对选取两对靶序列,分别为MSTN靶序列1:5’-AGGCACTGGTATTTGGCAGAG-3’和MSTN靶序列2:5’-AAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3’;

B.根据同源对比结果和gRNA的PAM设计原则,合成两对与靶序列不同,表达的蛋白相同,带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链,分别命名为:MSTN-1和MSTN-2;

C.用BsmBI酶切pPDNA330质粒,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,再进行切胶回收;

D.用连接酶将MSTN-1和MSTN-2分别与BsmBI酶切后的pPDNA330质粒进行连接,得到重组质粒载体,分别命名为:pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2;

(2)对重组质粒载体pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2进行敲除效率的筛选验证、对比,选择MSTN基因敲除效率更高的重组质粒载体转染受体细胞;

(3)转染不同物种的受体细胞,收集转染之后的受体细胞,并提取细胞基因组进行测序,根据基因组测序结果合成检测引物进行PCR扩增,扩增产物连接入pEASY-T1载体,挑取单克隆细菌,进行测序,对MSTN基因敲除表达结果进行检测。

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,其特征在于,所述MSTN-1的上游序列为,5’-ACCGCTCTGCCAAATACCAGTGCCT-3’,下游序列为,5’-AAACAGGCACTGGTATTTGGCAGAG-3’;MSTN-2的上游序列5’-ACCGAAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3’,下游序列为,5’-AAACGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTT-3’。

3.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,其特征在于,所述重组质粒载体pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2敲除效率的筛选验证选用荧光蛋白表达法进行验证,具体方法如下:

(1)利用RGS-CR做为验证报告载体:使用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ对验证报告载体RGS-CR进行线性化;

(2)合成与MSTN靶序列1和MSTN靶序列2对应的两条带有EcoR Ⅰ和BamH I粘性末端的DNA双链,分别命名为:#MSTN-1和#MSTN-2;

其中,#MSTN-1引物的上游序列为:5’-AATTCCTCTGCCAAATACCAGTGCCTGGGG-3’,

下游序列为:5’-GATCCCCCAGGCACTGGTATTTGGCAGAGG-3’;

#MSTN-2引物的上游序列为:5’-AATTCAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTCTGGG-3’,

下游序列为:5’-GATCCCCAGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTTTG-3’;

(3)采用T4连接酶将步骤(1)的RGS-CR线性化产物和步骤(2)带有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ粘性末端的#MSTN-1和#MSTN-2两对DNA双链进行连接得到重组质粒载体,分别命名为:RGS-#MSTN-1和RGS-#MSTN-2;

(4)取传代的HEK-293T细胞于4个培养皿中;

(5)取4个离心管编号为1、2、3、4,每个管分别加入含FBS的DMEM;

(6)然后在1号管加pPDNA330-MSTN-1和RGS-#MSTN-1,2号管加pPDNA330和RGS-#MSTN-1,3号管加pPDNA330-MSTN-2和RGS-#MSTN-2,4号管加pPDNA330和RGS-#MSTN-2;最后在每个管中加入罗氏转染试剂,混匀,室温静置后,将混合液分别加入培养皿,并于培养箱中培养,培养完成后在荧光显微镜下观察目的基因的荧光表达情况。

4.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,其特征在于,所述受体细胞选用人的Hela细胞或水牛的成纤维细胞。

5.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,其特征在于,所述检测引物选用人或水牛的MSTN-2基因的上、下游序列做为检测引物,人MSTN-2基因检测引物命名为:hMSTN,hMSTN上游序列为5’-AATCTGGTACTCAAACTTGGA-3’,下游序列为5’-ATATTATTTGTTCTTTGCCATT-3’;水牛的MSTN-2基因检测引物命名为:bufMSTN,bufMSTN上游序列为5’-CATAAAGGAAGAATCAAGCCTA-3’,下游序列为5’-TTCGCCATTAAAATATAGCATA-3’。

6.根据权利要求1-5所述任意一项利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,其特征在于,所述利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法可用于人或水牛的MSTN基因敲除。

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