尼日利亚菌素的纯化方法与流程

本发明属于药物化学领域，具体涉及尼日利亚菌素的纯化方法。

背景技术：

尼日利亚菌素是一个多环醚羧酸(polycyclic ether carboxylic acid)化合物，尼日利亚菌素的分子式为C₄₀H₆₈O₁₁，相对分子质量为742。其作用主要是进行氢离子和钾离子的交换。类似颉氨酶素与钾离子形成复合体一样，它的带负电荷的羧化物与阳离子相互作用形成尼日利亚菌素-钾离子复合体，进行氢离子-钾离子交换。

申请号201310486479.X公布了一种尼日利亚菌素的纯化方法，具体方法是将发酵液离心，收集上清液；用乙酸乙酯萃取上清液，减压浓缩，干燥得乙酸乙酯萃取物，再溶于乙酸乙酯，再加入到硅胶柱中进行洗脱，收集洗脱液进行薄层层析分析，合并洗脱液，真空蒸干，产物进行抑藻活性的测定，获得可抑藻的活性组分，然后高效液相色谱洗脱，收集洗脱液，获得尼日利亚菌素。

该纯化方法操作繁杂，且用了高效液相色谱洗脱，价格昂贵，不利于工业生产。因此，本领域迫切需要提供一种生产成本低廉、操作简单且适合于工业化生产的尼日利亚菌素的纯化方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种生产成本低廉、操作简单且适合于工业化生产的尼日利亚菌素的纯化方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种尼日利亚菌素的纯化方法，包括以下步骤：

1)胞内含尼日利亚菌素的链霉菌发酵液进行固液分离过滤，得到菌丝体；

2)菌丝体用酒精浸泡提取，得到浸提液，减压浓缩浸提液至无酒精为止，得到浓缩后的浸提液，用乙酸丁酯或乙酸乙酯萃取浓缩后的浸提液，取上相萃取液并浓缩至干，得到稠状浓缩物；

3)用甲醇或者乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物，过滤后得滤液；

4)用非极性烷烃溶剂与水共同萃取步骤3)中的滤液，取下相液，浓缩下相液中的烷烃层至干，得尼日利亚菌素粗品；

加入水的目的是提高溶液极性差，有利于水相油相分层，提高萃取效果。加入非极性烷烃溶剂的作用是去除油性杂质，提高产品纯度。

5)用乙醇溶液溶解步骤4)中的尼日利亚粗品，得到尼日利亚粗品醇溶液；

乙醇和烷烃层混溶的程度比甲醇大，本步骤使用乙醇。

6)用非极性烷烃溶剂与水共同萃取步骤5)中的中尼日利亚粗品醇溶液，取上相液，蒸发浓缩上相液的烷烃，析出白色固体；

加入水的目的是提高溶液极性差，有利于水相油相分层，提高萃取效果。加入非极性烷烃溶剂的作用是增加混合溶剂的非极性溶解力，从而提高产品纯度。

7)抽滤步骤6)中白色固体，并用非极性烷烃浸润洗涤该白色固体；

8)烘干步骤7)中白色固体，即得到含有尼日利亚菌素固体。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤2)中酒精与菌丝体重量比为8:1至10:1。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤2)中浓缩后的浸提液与每次萃取用的乙酸丁酯或乙酸乙酯的体积比为1:1；用乙酸丁酯或乙酸乙酯萃取浓缩后的浸提液2次，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并浓缩至干，得到稠状浓缩物。

浸泡时间分两次提取，第一次浸泡2小时，浸泡过程中每隔半个小时搅拌一次，第一次浸泡后固液分离获得一次酒精浸泡液；然后进行第二次浸泡，合并两次浸提液。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤3)中甲醇或者乙醇与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:1至5:1。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤3)用甲醇或者乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物后过滤前，还包括用活性炭进行脱色处理，活性炭与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:100。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，非极性烷烃溶剂为正己烷、环己烷的一种或者多种。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤4)中每次萃取用的非极性烷烃溶剂与步骤3)中的滤液体积比1:1，水与步骤3)中的滤液体积比0.01:1至0.1:1；萃取次数为3次。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤5)中乙醇与步骤4)中尼日利亚菌素粗品重量比为3:1至10:1。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤6)中非极性烷烃溶剂与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比为1:1至3:1，水与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比0.01:1至0.1:1。

优选地，所述尼日利亚菌素的纯化方法，步骤8)中烘干温度为45℃-50℃，烘干时间为3至5小时。

附图说明

图1为尼日利亚菌素的结构式。

图2为经过本发明纯化方法后尼日利亚菌素HPLC的色谱图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施方式并配合附图详予说明。

图1为尼日利亚菌素的结构式。

分子式：C₄₀H₆₈O₁₁，相对分子质量为：724.9g/mol。

实施例1

本实施例的具体工艺方法如下：

1)将胞内含尼日利亚菌素的链霉菌发酵液进行固液分离过滤，得到菌丝体；

2)菌丝体用酒精浸泡提取，酒精与菌丝体重量比为8:1，得到浸提液，减压浓缩浸提液至无酒精为止，得到浓缩后的浸提液，用乙酸丁酯萃取浓缩后的浸提液2次，其中浓缩后的浸提液与每次萃取用的乙酸丁酯的体积比为1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并浓缩至干，得到稠状浓缩物；

3)用乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物，其中乙醇与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为5:1，过滤后得滤液；在用乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物后过滤前，还可以用活性炭进行脱色处理，活性炭与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:100；

4)用非极性烷烃溶剂正己烷与水共同萃取步骤3)中的滤液，其中每次萃取用的非极性烷烃溶剂正己烷与步骤3)中的滤液体积比1:1，水与步骤3)中的滤液体积比0.01:1，萃取次数为3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并浓缩下相层至干，得尼日利亚菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步骤4)中的尼日利亚粗品，其中乙醇与步骤4)中尼日利亚菌素粗品重量比为10:1，得到尼日利亚粗品醇溶液；

6)用非极性烷烃溶剂正己烷与水共同萃取步骤5)中的中尼日利亚粗品醇溶液，其中非极性烷烃溶剂正己烷与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比为1:1，水与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比0.01:1，取上相液，蒸发浓缩上相液的烷烃，析出白色固体；

7)抽滤步骤6)中白色固体，并用正己烷浸润洗涤该白色固体；

8)烘干步骤7)中白色固体，其中烘干温度为50℃，烘干时间为3小时，即得到含有尼日利亚菌素固体。

实施例2

本实施例的具体工艺方法如下：

1)将胞内含尼日利亚菌素的链霉菌发酵液进行固液分离过滤，得到菌丝体；

2)菌丝体用酒精浸泡提取，酒精与菌丝体重量比为10:1，得到浸提液，减压浓缩浸提液至无酒精为止，得到浓缩后的浸提液，用乙酸乙酯萃取浓缩后的浸提液2次，其中浓缩后的浸提液与每次萃取用的乙酸乙酯的体积比为1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并浓缩至干，得到稠状浓缩物；

3)用甲醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物，其中甲醇与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:1，过滤后得滤液；在用甲醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物后过滤前，还可以用活性炭进行脱色处理，活性炭与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:100；

4)用非极性烷烃溶剂环己烷与水共同萃取步骤3)中的滤液，其中每次萃取用的非极性烷烃溶剂环己烷与步骤3)中的滤液体积比1:1，水与步骤3)中的滤液体积比0.1:1，萃取次数为3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并浓缩下相层至干，得尼日利亚菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步骤4)中的尼日利亚粗品，其中乙醇与步骤4)中尼日利亚菌素粗品重量比为3:1，得到尼日利亚粗品醇溶液；

6)用非极性烷烃溶剂环己烷与水共同萃取步骤5)中的中尼日利亚粗品醇溶液，其中非极性烷烃溶剂环己烷与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比为3:1，水与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比0.1:1，取上相液，蒸发浓缩上相液的烷烃，析出白色固体；

7)抽滤步骤6)中白色固体，并用正己烷浸润洗涤该白色固体；

8)烘干步骤7)中白色固体，其中烘干温度为45℃，烘干时间为5小时，即得到含有尼日利亚菌素固体。

实施例3

本实施例的具体工艺方法如下：

1)将胞内含尼日利亚菌素的链霉菌发酵液进行固液分离过滤，得到菌丝体；

2)菌丝体用酒精浸泡提取，酒精与菌丝体重量比为9:1，得到浸提液，减压浓缩浸提液至无酒精为止，得到浓缩后的浸提液，用乙酸丁酯萃取浓缩后的浸提液2次，其中浓缩后的浸提液与每次萃取用的乙酸丁酯的体积比为1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并浓缩至干，得到稠状浓缩物；

3)用乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物，其中乙醇与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为4:1，过滤后得滤液；在用乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物后过滤前，还可以用活性炭进行脱色处理，活性炭与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:100；

4)用非极性烷烃溶剂为体积比为1:1的正己烷和环己烷的混合物与水共同萃取步骤3)中的滤液，其中每次萃取用的非极性烷烃溶剂为体积比为1:1的正己烷和环己烷的混合物与步骤3)中的滤液体积比1:1，水与步骤3)中的滤液体积比0.03:1，萃取次数为3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并浓缩下相层至干，得尼日利亚菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步骤4)中的尼日利亚粗品，其中乙醇与步骤4)中尼日利亚菌素粗品重量比为8:1，得到尼日利亚粗品醇溶液；

6)用非极性烷烃溶剂为体积比为1:1的正己烷和环己烷的混合物与水共同萃取步骤5)中的中尼日利亚粗品醇溶液，其中非极性烷烃溶剂为体积比为1:1的正己烷和环己烷的混合物与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比为1.5:1，水与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比0.03:1，取上相液，蒸发浓缩上相液的烷烃，析出白色固体；

7)抽滤步骤6)中白色固体，并用正己烷浸润洗涤该白色固体；

8)烘干步骤7)中白色固体，其中烘干温度为48℃，烘干时间为3.5小时，即得到含有尼日利亚菌素固体。

实施例4

本实施例的具体工艺方法如下：

1)将胞内含尼日利亚菌素的链霉菌发酵液进行固液分离过滤，得到菌丝体；

2)菌丝体用酒精浸泡提取，酒精与菌丝体重量比为8.5:1，得到浸提液，减压浓缩浸提液至无酒精为止，得到浓缩后的浸提液，用乙酸乙酯萃取浓缩后的浸提液2次，其中浓缩后的浸提液与每次萃取用的乙酸乙酯的体积比为1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并浓缩至干，得到稠状浓缩物；

3)用甲醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物，其中甲醇与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为3:1，过滤后得滤液；在用甲醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物后过滤前，还可以用活性炭进行脱色处理，活性炭与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:100；

4)用非极性烷烃溶剂正己烷与水共同萃取步骤3)中的滤液，其中每次萃取用的非极性烷烃溶剂正己烷与步骤3)中的滤液体积比1:1，水与步骤3)中的滤液体积比0.08:1，萃取次数为3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并浓缩下相层至干，得尼日利亚菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步骤4)中的尼日利亚粗品，其中乙醇与步骤4)中尼日利亚菌素粗品重量比为5:1，得到尼日利亚粗品醇溶液；

6)用非极性烷烃溶剂正己烷与水共同萃取步骤5)中的中尼日利亚粗品醇溶液，其中非极性烷烃溶剂正己烷与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比为2.5:1，水与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比0.08:1，取上相液，蒸发浓缩上相液的烷烃，析出白色固体；

7)抽滤步骤6)中白色固体，并用正己烷浸润洗涤该白色固体；

8)烘干步骤7)中白色固体，其中烘干温度为46℃，烘干时间为4.5小时，即得到含有尼日利亚菌素固体。

实施例5

本实施例的具体工艺方法如下：

1)将胞内含尼日利亚菌素的链霉菌发酵液进行固液分离过滤，得到菌丝体；

2)菌丝体用酒精浸泡提取，酒精与菌丝体重量比为9.5:1，得到浸提液，减压浓缩浸提液至无酒精为止，得到浓缩后的浸提液，用乙酸丁酯萃取浓缩后的浸提液2次，其中浓缩后的浸提液与每次萃取用的乙酸丁酯的体积比为1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并浓缩至干，得到稠状浓缩物；

3)用乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物，其中乙醇与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为3.5:1，过滤后得滤液；在用乙醇溶液溶解步骤2)中的稠状浓缩物后过滤前，还可以用活性炭进行脱色处理，活性炭与步骤2)中的稠状浓缩物的重量比为2:100；

4)用非极性烷烃溶剂环己烷与水共同萃取步骤3)中的滤液，其中每次萃取用的非极性烷烃溶剂环己烷与步骤3)中的滤液体积比1:1，水与步骤3)中的滤液体积比0.05:1，萃取次数为3次；每次都取下相液，合并下相萃取液并浓缩下相层至干，得尼日利亚菌素粗品；

5)用乙醇溶液溶解步骤4)中的尼日利亚粗品，其中乙醇与步骤4)中尼日利亚菌素粗品重量比为6.5:1，得到尼日利亚粗品醇溶液；

6)用非极性烷烃溶剂环己烷与水共同萃取步骤5)中的中尼日利亚粗品醇溶液，其中非极性烷烃溶剂环己烷与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比为2:1，水与步骤5)中尼日利亚粗品醇溶液体积比0.05:1，取上相液，蒸发浓缩上相液的烷烃，析出白色固体；

7)抽滤步骤6)中白色固体，并用正己烷浸润洗涤该白色固体；

8)烘干步骤7)中白色固体，其中烘干温度为47℃，烘干时间为4小时，即得到含有尼日利亚菌素固体。

纯度检测方法：高效液相色谱柱后衍生测定，色谱柱Kromasil ODS C18，5μm，250mm*4.6mm；以V(甲醇)：V(乙酸)：V(水)＝94:3:3为流动相，香草醛为衍生剂进行高效液相色谱柱后衍生分析，检测波长520nm；流动相流速0.8mL/min；衍生液流速0.4mL/min；反应温度95℃；柱温30℃；外标法定量。衍生液配置：量取5mL H2SO4，缓慢加入到250mL甲醇中，置冰水浴中缓慢加入20g香草醛，混匀，脱气5min后避光保存，临用现配。

在上面测定参数下，用本方法纯化前后，测得实施例5得到的尼日利亚菌素HPLC的色谱图，见图2。

通过图2，可以看出尼日利亚菌素峰面积较大，尼日利亚菌素纯度可以达到95％，若按本技术方案进行重结晶，产品纯度可以继续提高。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。