抑瘤素M在制备促进间充质干细胞体外定向分化为骨细胞的产品中的应用的制作方法

本发明属于细胞生物技术及骨组织工程技术领域,具体涉及抑瘤素M在制备促进间充质干细胞体外定向分化为骨细胞的产品中的应用。

背景技术：

目前，由外伤、肿瘤、感染或骨折治疗不当等引起的骨缺损、骨折不连接在临床极为常见。骨骼移植(植骨)是治疗骨缺损、骨折不连接的必需手段。

传统植骨材料主要为自体骨骼、异体骨骼和人工骨材料。自体骨骼是一种较理想的移植物，其成骨迅速，无免疫排斥反应，但其来源有限，常不足以修复大块的骨缺损，且采集时会增加手术创伤并可能引起并发症。同种异体骨供骨量大，无自体取骨的并发症，但活性成分少，成骨作用弱，植入后仅能起到充填和支架作用，易发生疲劳骨折，并可能导致交叉感染。人工骨来源广泛、取材方便，没有同种异体骨可能导致交叉感染的危险，但可引起免疫排异反应，生物相容性差，吸收、替代过程缓慢，再出现骨不连或骨缺损发生率高。

近年来组织工程与再生医学技术的迅猛发展，为解决传统植骨术后骨形成缓慢和新骨形成不良等技术难点提供了一种有效解决途径。其研究思路主要是从成骨支架、成骨细胞和调控成骨分化的细胞因子三方面着手，通过形成组织工程人工骨，解决植骨后新骨形成缓慢的问题。其中种子细胞的来源、调控种子细胞成骨分化的诱导剂是其关键所在。成骨细胞是经典的种子细胞来源，但却存在大量取材不便、对供区会有一定损伤、增殖能力较弱等明显缺点，不能满足作为骨组织工程种子细胞的需要。

随着科技的发展近年来，干细胞逐渐成为骨组织工程研究的热点。按发生学来源和细胞发育阶段可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。出于伦理学和使用安全性的原因，使胚胎干细胞的研究与应用引起了全世界范围内的争议。成体干细胞是指在胚胎发育成成体的过程中存留在各种组织和脏器中的未分化细胞，其仍具有分化潜能，只是失去了发育成完整个体的能力。目前，实验和临床研究最多的成体干细胞是间充质干细胞。

但间充质干细胞分化成成骨细胞需要化学诱导或生长因子的诱导，现有技术中经典的成骨诱导剂主要包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠等。但诱导间充质干细胞成骨分化的效率比较低。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供抑瘤素M在制备促进间充质干细胞体外定向分化为骨细胞的产品中的应用。所述的抑瘤素M在间充质干细胞体外成骨分化中具有可以上调成骨分化标志物ALP、Runx2、OPN和OCN在mRNA、蛋白水平的表达以及钙离子沉积的作用。

本发明的第二目的在于提供了抑瘤素M配合间充质干细胞在制备治疗骨损伤药物中的应用，该应用方法可广泛用于骨质疏松、骨折、骨缺损和骨创伤药物的制备。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用了如下技术方案：

抑瘤素M在制备促进间充质干细胞体外定向分化为骨细胞的产品中的应用。

在本发明中，所述产品优选为药物。

抑瘤素M(OSM)为IL-6细胞因子家族的成员，是一种多功能的细胞调节因子，可作用于多种细胞，具有调节基因活性、细胞存活、增殖和分化的潜在功能。

本发明中，所述抑瘤素M能够促进间充质干细胞成骨细胞分化标志蛋白在mRNA和蛋白水平的表达，使碱性磷酸酶活性升高以及矿化结节的形成，定向诱导向成骨细胞分化。

本发明所述的抑瘤素M由美国R&D公司购买获得，由大肠杆菌表达重组制备。

本发明所采用的优选技术方案为：将体外分离培养得到的间充质干细胞接种到添加有抑瘤素M和化学诱导剂的基础培养基中进行培养得到成骨细胞，所述培养时间6～21天。

所述培养时间优选为7天、14天或21天。

本发明通过上述技术方案将间充质干细胞接种到添加有抑瘤素M和化学诱导剂的基础培养基上进行培养一段时间，随后通过实验验证间充质干细胞可以促进成骨细胞分化标志蛋白在mRNA和蛋白水平的表达，可以使碱性磷酸酶活性升高以及矿化结节的形成，以证明抑瘤素M可以定向诱导间充质干细胞向成骨细胞分化。

进一步地，间充质干细胞的接种密度为2×10⁴cells/cm²～5×10⁴cells/cm²。

所述间充质干细胞的接种密度优选为2×10⁴cells/cm²。

原始获得的间充质干细胞的来源不足且含量较低。所以一般情况下我们会将原始获得的间充质干细胞作为种子细胞进行培养扩增，以得到上述接种密度的要求。

进一步地，所述基础培养基包括胎牛血清和DMEM/F12培养液，其中，所述DMEM/F12培养液占80～90％体积比，胎牛血清占10～20％体积比。

进一步地，基础培养基包括10％体积比的胎牛血清和90％体积比DMEM/F12培养液。

本发明中，所述基础培养基中DMEM/F12培养液和胎牛血清混合后的体积为100％。

进一步地，所述抑瘤素M在基础培养基中的浓度为0.1～10ng/mL。

抑瘤素M在基础培养基中的浓度典型但非限制性的为0.1、1和10ng/mL。

进一步地，所述化学诱导剂包括地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸2磷酸盐混合形成，其中，所述地塞米松的含量为100nmol/L，所述β-甘油磷酸钠的含量为10mmol/L，所述抗坏血酸2磷酸盐的含量为50mg/L。

进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

人脐带间充质干细胞取材于一直作为分娩废弃物的脐带组织，取材方便，易于收集、保存、冷冻，不受伦理道德及法律方面的限制。脐带间充质干细胞含量丰富，一根30cm的脐带可得到10⁷原代细胞，且细胞较为原始，分化能力强，生物性能稳定，多次传代扩增后仍能保持旺盛功能，可以为实验和临床提供充足的细胞来源。

目前为止，脐带间充质干细胞已经在多方面被证明是自体和异体细胞移植、治疗的理想细胞。和胚胎干细胞相比，脐带间充质干细胞在生物学特征和免疫学特性上与其相似，是骨组织工程种子细胞的重要来源。

同时，脐带间充质干细胞作为理想的骨种子细胞具有以下特点：(1)脐带间充质干细胞结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；(2)脐带间充质干细胞体外培养时增殖力强；(3)脐带间充质干细胞在一定的条件下能向特定的方向分化，稳定表达成骨细胞表型。有上述特点可知脐带间充质干细胞是一种理想的骨种子细胞。

上述脐带间充质干细胞作为种子细胞进行培养扩增的过程包括：原代培养、传代培养、冻存和复苏。

上述原代培养是指将所分离的脐带间充质干细胞在37℃、5％的CO₂、95％的空气气相下培养48h后换液，先用PBS溶液轻轻冲洗3次，以去除大部分的未贴壁细胞，换上基础培养液，37℃、5％的CO₂、95％的空气条件下继续培养。

本发明中所述基础培养液是指含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液。

上述传代培养是指将待脐带间充质干细胞生长至占培养皿底面的80％时传代，先吸去旧培养液，PBS缓冲液冲洗2次，用细胞分离液消化至大部分细胞胞质回缩，将要从培养皿底壁脱落时，加入基础培养液终止消化，用吸管轻轻吹打制成单细胞悬液，以1:3的比例将细胞接种在另一培养皿中继续培养。

上述冻存是指当传代培养后的脐带间充质干细胞生长至占培养皿底面的80％时，消化并收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清液，以5×10⁶cells/ml的比例加入预冷冻存液，充分混匀后置预冷的冻存管中。按4℃30min,-20℃30min,-80℃过夜的程序进行冻存。最后置于液氮罐中保存。长期冻存后应间隔一定时间复苏细胞，观察细胞生长情况。

上述复苏是指从液氮罐中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶解，要在1～2min内完成复温。然后吸出细胞悬液接种在培养皿中，加入基础培养液，于37℃、5％CO₂、95％的空气气相下培养，第二天换液。

更进一步地，所述脐带间充质干细胞通过如下步骤制得：(1)将脐带浸泡消毒，随后用缓冲液进行冲洗，将冲洗后的脐带分离脐静脉及脐动脉，然后将脐带剪成脐带组织块；

(2)在剪好的脐带组织块中加入细胞分离液，在37℃、5％CO₂和95％空气的条件下分离消化12h；

(3)将分离消化后的脐带组织块离心后弃上清，随后悬浮细胞，分离得到脐带间充质干细胞。

进一步地，所述步骤(2)中的细胞分离液按体积百分比计包括：DMEM/F12培养液占80～90％体积比，胎牛血清占10～20％体积比，Ⅱ型胶原酶占0.01～0.1％体积比和透明质酸酶占0.05～0.1％体积比。

进一步地，细胞分离液按体积百分比计，DMEM/F12培养液占80％体积比，胎牛血清占19.94％体积比，Ⅱ型胶原酶占0.01％体积比和透明质酸酶占0.05％体积比。

进一步地，本发明所述的抑瘤素M配合间充质干细胞在制备治疗骨损伤药物中具有重要的作用。所述骨损伤疾病是指骨质疏松、骨折、骨缺损和骨创伤等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了细胞因子抑瘤素M的新用途，即促进间充质干细胞分化为成骨细胞的作用。所述抑瘤素M可以上调成骨分化标志物ALP、Runx2、OPN和OCN在mRNA、蛋白水平的表达以及钙离子沉积，促进间充质干细胞向成骨细胞分化。

(2)抑瘤素M可用作干细胞移植治疗骨损伤疾病和修复重建骨组织的促细胞分化剂。干细胞移植治疗骨损伤疾病目前正处于实验研究阶段(含临床实验研究)，预计促细胞分化剂抑瘤素M的引入将有助于该领域的研究，为开发制备治疗骨质疏松、骨折、骨缺损、骨创伤等疾病的药物提供物质基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1显示抑瘤素M促进脐带间充质干细胞成骨分化第7天碱性磷酸酶染色结果，其中，(a)、(b)、(c)、(d)和(e)分别为对比例1、对比例2、实施例3、实施例4、实施例5的碱性磷酸酶染色结果。

图2显示抑瘤素M促进脐带间充质干细胞成骨分化第14天碱性磷酸酶染色结果，其中，(a)、(b)、(c)、(d)和(e)分别为对比例1、对比例2、实施例3、实施例4、实施例5的碱性磷酸酶染色结果。

图3显示抑瘤素M促进脐带间充质干细胞成骨分化第21天茜素红染色结果，其中，(a)、(b)、(c)、(d)和(e)分别为对比例1、对比例2、实施例3、实施例4、实施例5的茜素红染色结果。

图4显示抑瘤素M促进脐带间充质干细胞成骨分化第14天免疫细胞化学染色法检测骨桥蛋白和骨钙素，其中，(a)、(b)和(c)分别为对比例1、对比例2、实施例5免疫细胞化学染色法检测骨桥蛋白和骨钙素的检测结果。

图5显示抑瘤素M促进脐带间充质干细胞成骨分化3天、7天、14天、21天实时定量RT-PCR检测成骨分化转录因子Runx2、CollagenⅠ水平，其中，(a)为对对比例1、对比例2、实施例3、实施例4、实施例5分别在3天、7天、14天、21天时对Runx2基因片段进行实时定量RT-PCR检测的分析结果，(b)为对比例1、对比例2、实施例3、实施例4、实施例5分别在3天、7天、14天、21天时对CollagenⅠ基因片段进行实时定量RT-PCR检测的分析结果。

图6显示抑瘤素M促进脐带间充质干细胞成骨分化14天使用蛋白免疫印记法检测骨桥蛋白和骨钙素表达，其中，(a)、(b)、(c)、(d)和(e)分别为对比例1、对比例2、实施例3、实施例4、实施例5的蛋白免疫印记法检测骨桥蛋白和骨钙素表达结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1脐带间充质干细胞的制得

(1)将脐带放入酒精浸泡消毒，随后用PBS缓冲液进行冲洗，将冲洗后的脐带分离脐静脉及脐动脉，然后将脐带剪成长度约5mm的组织块；

(2)在剪好的脐带组织块中加入细胞分离液，在37℃、5％CO₂和95％空气的条件下分离消化12h；

(3)将分离消化后的脐带块以1500rpm离心10min，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12液体培养基悬浮细胞，分离得到脐带间充质干细胞,细胞含量为5×10⁴cells/ml。

实施例2脐带间充质干细胞培养扩增过程

(1)原代培养：将所分离的脐带间充质干细胞以5×10⁴cells/ml的密度接种在37℃、5％的CO₂、95％的空气气相下培养48h后换液，先用PBS溶液轻轻冲洗3次，以去除大部分的未贴壁细胞，换上基础培养液，37℃、5％的CO₂、95％的空气条件下继续培养。

本发明中所述基础培养液是指含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液。

(2)传代培养是指将待脐带间充质干细胞生长至占培养皿底面的80％时传代，先吸去旧培养液，PBS缓冲液冲洗2次，用细胞分离液消化至大部分细胞胞质回缩，将要从培养皿底壁脱落时，加入基础培养液终止消化，用吸管轻轻吹打制成单细胞悬液，以1:3的比例将细胞接种在另一培养皿中继续培养。

(3)冻存是指当传代培养后的脐带间充质干细胞生长至占培养皿底面的80％时，消化并收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清液，以5×10⁶cells/ml的比例加入预冷冻存液，充分混匀后置预冷的冻存管中。按4℃30min,-20℃30min,-80℃过夜的程序进行冻存。最后置于液氮罐中保存。长期冻存后应间隔一定时间复苏细胞，观察细胞生长情况。

(4)复苏是指从液氮罐中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中快速晃动，直至冻存液完全溶解，要在1-2min内完成复温。然后吸出细胞悬液接种在培养皿中，加入基础培养液，于37℃、5％CO₂、95％的空气气相下培养，第二天换液。

对比例1基础培养液组(Normal)的制备

将脐带间充质干细胞以2×10⁴cells/cm²密度接种于6孔培养板中，然后将培养板置于含有10％的胎牛血清的DMEM/F12的培养液进行培养7至21天。

对比例2化学试剂诱导液组(Control)的制备

将脐带间充质干细胞以2×10⁴cells/cm²密度接种于6孔培养板中，然后将培养板置于含有10％的胎牛血清和成骨分化化学诱导剂的DMEM/F12的培养液进行培养7至21天。

上述成骨分化化学诱导剂包括：地塞米松100nmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸2磷酸盐50mg/l。

实施例3抑瘤素M低剂量组(OSM-Low)的制备

将脐带间充质干细胞以2×10⁴cells/cm²密度接种于6孔培养板中，然后将培养板置于含有10％的胎牛血清、成骨分化化学诱导剂和0.1ng/ml抑瘤素M的DMEM/F12的培养液进行培养7至21天。

上述成骨分化化学诱导剂包括：地塞米松100nmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸2磷酸盐50mg/l。

实施例4抑瘤素M中剂量组(OSM-Mid)的制备

将脐带间充质干细胞以2×10⁴cells/cm²密度接种于6孔培养板中，然后将培养板置于含有10％的胎牛血清、成骨分化化学诱导剂和1ng/ml的DMEM/F12的培养液进行培养7至21天。

上述成骨分化化学诱导剂包括：地塞米松100nmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸2磷酸盐50mg/l。

实施例5抑瘤素M高剂量组(OSM-High)的制备

将脐带间充质干细胞以2×10⁴cells/cm²密度接种于6孔培养板中，然后将培养板置于含有10％的胎牛血清、成骨分化化学诱导剂和10ng/ml的DMEM/F12的培养液进行培养7至21天。

上述成骨分化化学诱导剂包括：地塞米松100nmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸2磷酸盐50mg/l。

碱性磷酸酶检测分析

为表明本发明抑瘤素M对促进间充质干细胞分化为成骨细胞的作用，将上述实施例2～5与对比例1～2进行碱性磷酸酶分析，试验结果如下表1所示：

实验方法：碱性磷酸酶分析使用ALP染色试剂盒,按试剂盒说明书操作。

(1)吸去细胞培养板里的培养液，每孔加入400μl清理液,洗涤细胞表面。

(2)吸去清理液，每孔加入400μl固定液,覆盖整个生长表面。在室温下孵育2min，小心吸去固定液。每孔加入400μl清理液，洗漆细胞表面，共清洗二次。

(3)加上200μl染色液，覆盖整个细胞表面，温下暗室里孵育15至30min，或直至可见蓝色；小心吸去染色液，加入400μl清理液，室温下孵育2min，吸去清理液后，再加入100μl清理液，显微镜下观察，拍照。

表1：碱性磷酸酶分析结果

碱性磷酸酶(ALP)是成骨分化早期标志物。ALP染色结果表明：成骨诱导第4天，Normal组未见蓝紫色染色；Control组及OSM-Low、Mid、High组均可检测到较浅的蓝紫色阳性染色，表明细胞中已有ALP的表达。成骨诱导第7天，Normal组未见蓝紫色染色；其余各组均可检测到较强的蓝紫色阳性染色，表明细胞中ALP表达增多。成骨诱导第14天，除Normal组外，其余各组均显示蓝紫色染色，OSM-Low、Mid、High组明显强于Control组，且随着OSM剂量越大颜色越深。表明OSM诱导间充质干细胞成骨分化既具有时间依赖性又具有剂量依赖性。(见图1、2)

钙离子沉积检测分析

为表明本发明抑瘤素M对促进间充质干细胞分化为成骨细胞的作用，将上述实施例2～5与对比例1～2进行茜素红染色的方法进行钙离子沉积检测分析。

实验方法：钙离子沉积检测使用茜素红染色试剂盒,按试剂盒说明书操作。将各组细胞诱导21天后弃去培养液，用PBS缓冲液洗涤2次，70％冰乙醇固定1h后蒸馏水冲洗，吸适量2％AR-S溶液完全浸泡样本，室温下染色并轻轻晃动培养板，10分钟后吸弃染液，以双蒸水清洗5次，再用PBS缓冲液晃动漂洗15分钟以除去非特异性结合的茜素红S，自然干燥后光学显微镜下观察并拍照，阳性结果为钙结节区域呈红色。

试验结果分析：除Normal组未见桔红色矿化结节出现之外，其余各组均见到桔红色矿化结节，且随着抑瘤素M剂量的增加，桔红色矿化结节的数量逐渐增多。抑瘤素M成骨诱导组诱导间充质干细胞成骨分化作用要强于Control组，表明抑瘤素M具有促进细胞基质矿化作用。成骨诱导21天，进行茜素红染色，除Normal组未见桔红色矿化结节出现之外，其余各组均见到较多的桔红色矿化结节，抑瘤素M-Low、Mid、High组桔红色矿化结节数量明显多于14天，也明显多于Control组，表明抑瘤素M诱导间充质干细胞成骨分化既具有时间依赖性又具有剂量依赖性，能增强化学诱导剂的成骨分化效率。(见图3)

免疫组化试剂盒检测分析

为表明本发明抑瘤素M对促进间充质干细胞分化为成骨细胞的作用，将上述实施例2～5与对比例1～2应用免疫组化试剂盒检测成骨分化标志蛋白OPN和OCN。

实验方法：0.25％Triton X-100溶液中孵育10min，渗透细胞膜。pH7.4TBS漂洗5min×3。3％冰乙酸室温处理30min以封闭细胞内源性酶。pH7.4TBS漂洗5min×3。滴加5％BSA封闭液，室温封闭20min，吸弃多余液体，不洗。滴加兔抗人OPN、OCN多克隆抗体(1:100稀释)，4℃孵育过夜。pH7.4TBS漂洗5min×3。PBS代替一抗作为阴性对照。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20min。pH7.4TBS漂洗5min×3。滴加试剂SABC-AP(链酶亲和素-碱性磷酸酶)，37℃孵育20min。pH7.4TBS漂洗5min×3，水洗一次。滴加显色剂BCIP/NBT，37℃孵育10～30min。显微镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。倒置显微镜观察，照相。

实验结果分析：骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)是成骨分化的晚期标志物。为了明确OSM对MSCs晚期成骨分化有作用，我们在OSM诱导第14天检测OPN和OCN的表达。Normal组未观察到阳性染色，其余各组均出现棕褐色阳性染色，且随着OSM剂量的增加，阳性染色细胞数目逐渐增多。OSM成骨诱导组染色要强于Control组，表明OSM能够增强成骨诱导分化剂的分化效率，并且具有剂量依赖性。(见图4)

蛋白质印记法检测分析

为表明本发明抑瘤素M对促进间充质干细胞分化为成骨细胞的作用，将上述实施例2～5与对比例1～2应用蛋白质印记法鉴定抑瘤素M诱导脐带间充质干细胞成骨分化。

实验方法：各组诱导14天时，细胞裂解，细胞裂解物12000g离心10min，加热5min使蛋白变性，用10％的SDS-PAGE胶进行电泳，然后转移到PVDF膜上，在含有5％的脱脂奶粉的PBST中4℃封闭1h。用1:1000稀释的一抗孵育过夜，加入HRP标记的二抗，照相。

实验结果分析：Normal组未出现相应蛋白条带，其余各组均出现目的蛋白条带，且随着抑瘤素M剂量的增加，目的蛋白量增多。抑瘤素M成骨诱导组目的蛋白量高于Control组，表明抑瘤素M能够增强成骨诱导分化剂的分化效率，并且具有剂量依赖性。(见图6)

实时定量RT-PCR鉴定

为表明本发明抑瘤素M对促进间充质干细胞分化为成骨细胞的作用，使用实时定量RT-PCR方法鉴定抑瘤素M诱导脐带间充质干细胞成骨分化。

实验方法：将已消化、离心、洗涤的间充质干细胞用培养液重悬，调整细胞密度为5×10⁴cells/ml接种10cm平皿，每平皿加入10ml细胞悬液，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养24h。待细胞完全贴壁后加入到实施例2～5与对比例1～2的诱导培养液中，处理细胞。Trizol法从不同诱导组细胞中提取总RNA，应用real-time PCR试剂盒扩增Runx2、CollagenⅠ基因片段。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段。

实验结果分析：Normal组的基因表达未见随时间延长而发生明显改变。其余各组Runx2、CollagenⅠ的基因表达均随诱导时间变化而发生变化。抑瘤素M各组基因表达量均高于Control组，表明抑瘤素M与化学诱导剂在对间充质干细胞进行成骨诱导时发生了协同刺激作用。Runx2的基因表达在诱导第7天时达到高峰，此后表达量呈下降趋势(见图5)。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。