一种快速鉴定烟粉虱钠离子通道基因突变T929V的引物及其应用的制作方法

本发明涉及一种快速鉴定烟粉虱Para钠离子通道基因突变T929V的引物及其应用，特别涉及烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)Para钠离子通道基因突变T929V的鉴定引物及其在拟除虫菊酯类杀虫剂抗性监测中的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

烟粉虱B.tabaci是一种重要的大田及温室害虫，能够通过直接取食、分泌蜜露以及传播植物病毒对600多种植物造成危害。由于具有快速的适应能力，烟粉虱已对包括有机磷类、氨基甲酸酯类等各类杀虫剂产生了高水平抗性，是唯一被科技界冠以“超级害虫”称号的害虫。

拟除虫菊酯类杀虫剂是人类利用化学手段模拟天然除虫菊素的化学结构而仿生合成的一类化合物。该类杀虫剂作为一类神经毒剂，主要作用于昆虫的钠离子通道,延长钠离子通道开放时间，延迟钠通道的失活过程，产生持久活化，导致重复后放和神经传导的阻断，引起害虫兴奋过度，最终使其肌肉瘫痪并导致死亡。

拟除虫菊酯类杀虫剂作为一类广谱性杀虫剂，具有高效、低毒和低残留的特性，在农业、林业和卫生害虫防治中广泛应用。但该类杀虫剂作为单剂使用时抗性风险极高，极易引发害虫的击倒抗性(Knock-down resistance，kdr)。通过药理学实验证明钠离子通道有选择地改变杀虫剂的结合部位能够降低钠离子对拟除虫菊酯类杀虫剂的亲和力，引起害虫神经敏感性的改变。目前已在14种昆虫的Para直向同源钠离子通道中发现了20个突变位点，其中有5个突变位点为kdr突变位点，7个位点为超击倒抗性(super-kdr)突变位点(其中包括T929V突变)。在烟粉虱中也已证实钠离子通道蛋白在929位的苏氨酸到缬氨酸(T929V)的突变与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性密切相关。

中国专利文献CN105132568A(申请号201510603063.0)公开了一种快速鉴定烟粉虱钠离子通道基因突变L925I的引物及其应用。快速鉴定钠离子通道基因突变位点L925I为野生型烟粉虱的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；快速鉴定钠离子通道基因突变位点L925I为突变型烟粉虱的引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。虽然该技术方案向突变型正向引物3’端第三个碱基引入了错配碱基G，从而提高了引物的特异性，但该方法并不能完全适用于所有的烟粉虱钠离子通道基因突变位点的特异引物的设计。

因而，设计特异性的检测引物用于检测钠离子通道基因突变位点T929V仍然是目前研究的热点。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种快速鉴定烟粉虱钠离子通道基因突变位点T929V的引物及其应用。

一种快速鉴定钠离子通道基因突变位点T929V为野生型烟粉虱的引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述引物在鉴定钠离子通道基因突变位点T929V为野生型烟粉虱中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有93bp的一条条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为野生型的纯合或杂合烟粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无93bp的条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为纯合突变型的烟粉虱。

所述步骤(2)中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0补至25μl；

所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性2分钟；94℃变性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，进行35个循环；72℃延伸2分钟。

一种快速鉴定钠离子通道基因突变位点T929V为突变型烟粉虱的引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述引物在鉴定钠离子通道基因突变位点T929V为突变型烟粉虱中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有93bp的一条条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为突变型的纯合或杂合烟粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无93bp的条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为纯合野生型的烟粉虱。

所述步骤(2)中PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0补至25μl；

所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性2分钟；94℃变性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，进行35个循环；72℃延伸2分钟。

上述步骤(1)中提取温室白粉虱和烟粉虱基因组DNA和步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)。

本发明所述T929V突变位点指烟粉虱Para钠离子通道基因片段(GenBank登录号:AJ440727.1)自5’末端起第73和74位核苷酸为A和C，烟粉虱钠离子通道基因片段(野生型)核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明所述烟粉虱Para钠离子通道蛋白的T929V突变位点，为烟粉虱Para钠离子通道蛋白(GenBank登录号：CAD29437.1)自N端起第25位氨基酸为苏氨酸，所述烟粉虱Para钠离子通道蛋白(野生型)氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

有益效果

本发明首次公开了检测烟粉虱对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的点突变的两对检测引物及检测方法，采用两对引物进行检测，不仅有助于提高检测的准确率，并且有助于快速、灵敏地检测田间烟粉虱对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性发生发展动态，为抗药性的治理提供技术支持，便于及时调整烟粉虱防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。

附图说明

图1为采用T929V突变位点专用野生型引物对和专用突变型引物对PCR扩增929纯合野生型和纯合突变型模板的电泳图；

图中：WT，MT分别所示为纯合野生型个体的DNA模板和纯合突变型个体的DNA模板；

图2为实施例2检测结果电泳图；

图中：T929V专用野生型引物对WF(SEQ ID NO：1)+R(SEQ ID NO：2)用以检测929位点野生型的烟粉虱；T929V专用突变型引物对MF(SEQ ID NO：3)+R(SEQ ID NO：2)用以检测存在929位点突变的烟粉虱；

图3为对比例的检测结果电泳图；

图中：T929V专用突变型引物对MF(SEQ ID NO：3)+R(SEQ ID NO：2)用以检测存在929位点突变的烟粉虱；T929V专用突变型引物对F1(SEQ ID NO：4)+R(SEQ ID NO：2)用以检测存在929位点突变的烟粉虱；T929V专用突变型引物对F2(SEQ ID NO：5)+R(SEQ ID NO：2)用以检测存在929位点突变的烟粉虱；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

对2014年采自山东省寿光、济南、青岛市三地的田间种群烟粉虱钠离子通道929位的突变情况进行测序检测，纯合野生型个体的DNA模板，标记为WT；纯合突变型个体的DNA模板，标记为MT。

实施例中所述材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

烟粉虱钠离子通道基因T929V野生型和突变型模板的测序验证

根据NCBI所公布的烟粉虱钠离子通道基因(Genbank:DQ205209.1)设计特异性引物，对929位突变进行PCR扩增，回收专一目的片段后直接进行PCR测序。

PCR扩增的引物：

上游引物：GGCCAACTTTGAATCTGTT；

下游引物：AAACTTTCCGCACCTCTG。

PCR扩增体系：基因组DNA溶液2μl，10M上游引物1μl，10M下游引物1μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0补至25μl；

PCR扩增条件：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。

根据以上所述，从三个田间种群中分别随机测序检测15头田间种群烟粉虱个体DNA序列。挑选出929位的野生型纯合个体(WT)和突变型的纯合个体(MT)。从纯合野生型个体和纯合突变型个体中分别随机选取5个模板，进行PCR法验证试验。

引物设计

引物核苷酸序列如表1所示，根据突变体烟粉虱钠离子通道基因的序列设计allele specific-PCR引物，专用野生型引物对3’端最后两个碱基与突变前的碱基一致(SEQ ID NO.1)，专用突变型引物对3’端最后两个碱基与突变后的碱基一致(SEQ ID NO.3)。此外，为了增加allele specific-PCR方法的特异性，向突变型正向引物3’端第四个碱基引入了错配碱基G。PCR法检测的下游引物使用共同的下游引物R(SEQ ID NO.2)。但为了不受到DNA内含子多态性的影响，PCR法检测的下游引物设计在了突变位点所在外显子的3’末端。

表1.检测烟粉虱钠离子通道929位是否发生突变所使用的引物

PCR法验证T929V突变位点专用野生型引物对和专用突变型引物对

1、模板：纯合野生型模板WT和纯合突变型模板MT。

2、引物：如表1所示

3、PCR反应体系：

基因组DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0补至25μl；

所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性2分钟；94℃变性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，进行35个循环；72℃延伸2分钟。

结果如图1所示。由图1可以看出，在该反应体系和循环条件下，T929V专用野生型引物只对野生型模板进行扩增，扩增产物片段为93bp；T929V专用突变型引物只对突变型模板进行扩增，扩增产物片段为93bp。

上述专用野生型引物和突变型引物能很好地区分等位基因，因此选用这些专用引物对用于T929V等位基因突变的检测，即可以特异性地检测烟粉虱是否对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性。

实施例2

一种快速鉴定钠离子通道基因突变位点T929V为野生型烟粉虱的引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种快速鉴定钠离子通道基因突变位点T929V为突变型烟粉虱的引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

利用上述引物鉴定烟粉虱钠离子通道基因突变位点T929V基因型的方法，步骤如下：

(1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，分别利用引物核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物、核苷酸序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2的引物对基因组DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

所述PCR扩增的扩增体系为：

基因组DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0补至25μl；

所述PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性2分钟；94℃变性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，进行35个循环；72℃延伸2分钟；

(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

经野生型烟粉虱的引物扩增后，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有93bp的一条条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为野生型的纯合或杂合烟粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无93bp的条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为突变型的纯合烟粉虱；

经突变型烟粉虱的引物扩增后，当PCR产物电泳图谱显示被测样品有93bp的一条条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为突变型的纯合或杂合烟粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无93bp的条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为野生型的纯合烟粉虱；

当既有经野生型烟粉虱的引物扩增后的93bp的条带又有经突变型烟粉虱的引物扩增后的93bp的条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点T929V为突变型的杂合烟粉虱。

检测结果如图2所示。该结果与测序检测结果一致。

对比例1

引物设计

引物核苷酸序列如表2所示，根据突变体烟粉虱钠离子通道基因的序列设计allele specific-PCR引物，专用突变型引物对3’端最后两个碱基与突变后的碱基一致(SEQ ID NO.3)。此外，为了增加allele specific-PCR方法的特异性，向突变型正向引物3’端第四个碱基引入了错配碱基G。同样为验证该引物的特异性，另外设计两条上游引物F1(3’端第三个碱基引入了错配碱基C)和F2(仅3’端最后两个碱基与突变后的碱基一致)。PCR法检测的下游引物使用共同的下游引物R(SEQ ID NO.2)。

表2.检测烟粉虱钠离子通道929位是否发生突变所使用的引物

PCR法对比不同突变型引物检测T929V突变位点的灵敏性

1、模板：纯合野生型模板WT和纯合突变型模板MT。

2、引物：如表1所示

3、PCR反应体系：

基因组DNA溶液2μl，10M上游引物0.5μl，10M下游引物0.5μl，5U/μl rTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer(缓冲液)2.5μl，10mM dNTP 2μl，ddH₂0补至25μl；

所述步骤(2)中PCR扩增的扩增条件如下：

94℃预变性2分钟；94℃变性15秒，54℃退火10秒，72℃延伸10秒，进行35个循环；72℃延伸2分钟。

结果如图3所示。由图3可以看出，在该反应体系和循环条件下，F1+R引物对不能有效检测突变型模板。F2+R引物对虽然能够对突变型模板进行扩增，但同样能够对野生型模板进行扩增。仅有MF+R引物对只对突变型模板进行扩增。