一种基于手性自组装纳米传感器实现胞内端粒酶活性检测的方法与流程

文档序号:12249572阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于手性自组装纳米传感器实现胞内端粒酶活性检测的方法,其特征在于步骤为:

(1)端粒酶引物序列组装构建的手性大小金二聚体传感器:柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基TE primer序列;15nm金纳米粒子GNP修饰与linker DNA部分互补的巯基TE CS1序列;将得到的GNP-primer及GNP- CS1复合体混匀,通过linker DNA1组装得到适配体序列组装的手性大小金二聚体primer-dimer;

(2)端粒酶引物错配序列组装构建的手性大小金二聚体传感器:柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基TE mismatch序列;15nm金纳米粒子GNP修饰与linker DNA部分互补的巯基TE CS2序列;将得到的GNP-mismatch及GNP-CS2复合体混匀,通过linker DNA2组装得到错配序列组装的手性大小金二聚体mismatch-dimer;

(3)两种大小金二聚体修饰穿膜肽:将步骤(1)及(2)所得大小金二聚体分别与SH-PEG-5000和穿膜肽TAT混匀,偶联12h分别得到表面修饰有穿膜肽的手性大小金二聚体TAT-primer-dimer及 TAT-mismatch-dimer;

(4)两种大小金二聚体传感器在细胞内手性信号随时间的变化:分别将步骤(3)得到的两种穿膜肽修饰的手性大小金二聚体与一定数量的细胞共同培养不同时间点后,用胰蛋白酶消化细胞,分别得到细胞内含有不同量的手性primer-dimer及 mismatch-dimer的细胞悬液;将细胞悬液进行圆二色性表征,记录不同时间点的手性信号,绘制散点图,得到胞内最佳检测时间;

(5)基于大小金二聚体的手性信号实现胞内ATP实时检测:将步骤(3)得到穿膜肽修饰的手性TAT-primer-dimer与添加不同抑制剂和促进剂的细胞及未处理的细胞共同孵育,当存在待测物端粒酶时,传感器组装体逐渐解散,导致手性信号的变化,进而进行检测,建立胞内端粒酶活性与手性信号的标准曲线。

2.根据权利要求1所述基于手性自组装纳米传感器实现胞内端粒酶活性检测的方法,其特征在于具体步骤如下:

(1)端粒酶引物序列组装构建的手性大小金二聚体传感器:

柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中,取100μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基TE primer序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀;15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中,取100μL 2nM 15nm金纳米粒子与适配体部分互补的巯基TE CS1序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀,分别加入终浓度为50mM的NaCl溶液,充分混合后,室温孵育过夜后,离心3次除去溶液中未反应的DNA,分别重悬于100μL的5mM PB缓冲液中;

取100μL GNP-primer及50μL GNP-CS1复合体混匀,加入5μL 10μM linker DNA1组装得到端粒酶引物序列组装的手性大小金二聚体primer-dimer,再加入终浓度为50mM NaCl溶液进行老化,室温下孵育12h,再将组装体通过梯度离心纯化;

(2)端粒酶引物错配序列组装构建的手性大小金二聚体传感器:

柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中,取100μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基TE mismatch序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀;柠檬酸还原法合成的15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中,取100μL 2nM 15nm金纳米粒子与适配体部分互补的巯基TE CS2序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀,分别加入终浓度为50 mM的NaCl溶液,充分混合后,室温孵育过夜后,离心3次除去溶液中未反应的DNA,分别重悬于100μL的5mM PB缓冲液中;

取100μL GNP-mismatch及50μL GNP-CS2复合体混匀,加入5μL 10μM linker DNA2组装得到端粒酶引物错配序列组装的手性大小金二聚体mismatch-dimer,再加入终浓度为50mM的NaCl溶液进行老化,室温下孵育12 h,再将组装体通过梯度离心纯化;

(3)两种大小金二聚体修饰穿膜肽:将步骤(1)及(2)得到大小金二聚体分别与SH-PEG5000和穿膜肽TAT以1︰1000︰100的摩尔浓度混匀,室温孵育12h后,7500rpm离心20min,去除上清液,沉淀重悬于细胞培养液中,得到稳定的表面修饰有穿膜肽的手性TAT-primer-dimer及 TAT-mismatch-dimer;

(4)两种大小金二聚体传感器在细胞内手性信号随时间的变化:

将细胞接种于24孔培养板中,使每孔中的细胞数量为104个,培养24h后去掉培养液,取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的手性TAT-primer-dimer分别与104个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h;

取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的手性TAT-mismatch-dimer分别与104个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h;

之后分别用胰蛋白酶消化细胞,分别得到细胞内含有不同量的手性primer-dimer及 mismatch-dimer的细胞悬液;将细胞悬液进行圆二色性表征,记录不同时间点的手性信号,绘制散点图,得到胞内最佳检测时间;

(5)基于大小金二聚体的手性信号实现胞内端粒酶实时检测:将步骤(3)得到穿膜肽修饰的手性TAT-primer-dimer与不同量EGCG抑制端粒酶活性后的细胞及未经抑制的细胞分别共孵育6h后,当存在待测物端粒酶时,组装体逐渐解散,导致手性信号的变化,进而进行检测;然后用胰蛋白酶消化细胞,分别得到细胞内含有不同解离程度的手性primer-dimer的细胞悬液,将细胞悬液进行圆二色性表征,并建立胞内端粒酶与手性信号的标准曲线。

3.根据权利要求1所述基于手性自组装纳米传感器实现胞内端粒酶活性检测的方法,其特征在于所述TE primer序列如SEQ ID NO. 1所示,TE CS1序列如SEQ ID NO. 2所示,linker DNA1序列如SEQ ID NO. 3所示,TE mismatch序列如SEQ ID NO. 4所示,TE CS2序列如SEQ ID NO. 5所示,linker DNA2序列如SEQ ID NO. 6所示,TAT 多肽序列如SEQ ID NO. 7所示。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1