本发明涉及药物领域，具体涉及一种具有BRD4蛋白抑制作用的化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
Brd(Bromodomain)是一类能够特异性识别组蛋白中乙酰化赖氨酸的保守蛋白结构域，又称溴结构域蛋白，其通过与乙酰化赖氨酸结合促使染色质重塑因子和转录因子等相关蛋白富集在特定的基因转录位点，调节基因的转录表达。Brd4蛋白是溴结构域蛋白家族中的一员，研究显示，Brd4蛋白除了能够通过与组蛋白的乙酰化赖氨酸结合进而调节细胞周期和生长之外，还具有一定的激酶活性，如Brd4能够直接导致RNA拓扑异构酶II的C端磷酰化。
在肿瘤发生发展方面，大量研究表明，Brd4蛋白与多种肿瘤的密切联系，比如睾丸中的核蛋白基因染色质与Brd4的编码区形成融合型原癌基因导致中线癌发病；黑色素瘤细胞会表达较多的Brd4蛋白帮助其增殖，抑制Brd4可以使黑色素瘤细胞的生长明显放慢；恶性外周神经鞘膜瘤细胞会异常高度表达Brd4蛋白，抑制Brd4会导致该肿瘤细胞的死亡；肝癌组织表达比正常组织高的Brd4，而抑制Brd4可以抑制肝癌细胞的增殖作用；在造血系统肿瘤包括AML、Burkitt淋巴瘤、多发性骨髓瘤、B细胞急性淋巴性白血病的模型中，通过干扰Brd4余癌基因MYC的结合，可以抑制癌基因MYC的表达等。
在艾滋病发生发展方面，Brd4可以像艾滋病毒复制过程中的反式激活蛋白Tat一样，将P-TEFb蛋白募集至众多细胞基因的启动子区域，促进转录。由于Brd4具有对Tat依赖性的HIV-1转录的抑制作用，因此，能够抑制Brd4的小分子药物，可以激活HIV-1的潜伏，结合高效抗逆转录病毒治疗(HAART)，使得彻底根除HIV-1变成可能。Brd4抑制剂JQ1就是这样的一种小分子，并且已被证明可以在多种细胞模型中激活HIV-1潜伏。
在炎症发生发展方面，溴结构域蛋白由于可以募集其它核因子通过RNA聚合酶的作用调控下游基因的表达，已被认为是许多炎症相关疾病作用的靶点，研究表明，Brd4可以直接与转录因子结合，调节下游基因NF-kB的转录，进而促进炎症的发生。文献显示，Brd4抑制剂JQ1可以抑制巨噬细胞中与NF-kB通路相关的炎症细胞因子的表达，抑制LPS导致的牙龈炎，在小鼠模型中，JQ1还可以抑制基质金属蛋白酶的表达，缓解关节肿胀、减轻关节炎症等。
溴结构域蛋白家族由于在抗炎和抗肿瘤等方面的潜在价值，已引起了各大制药公司和科研机构的极大关注，Brd4在肿瘤尤其是其在难治性肿瘤、炎症、HIV潜伏中的重要作用，已使其日益成为表观遗传领域的重要靶标之一。以Brd4蛋白为靶标，寻找选择性好、安全、高效的小分子化合物，以治疗肿瘤、炎症、艾滋病、心血管等疾病，是当前研究的热点。通过小分子化合物，干扰Brd4蛋白Bromodomain结构域，实现对肿瘤、炎症、艾滋病等疾病的靶向治疗，具有广阔的开发应用前景。目前，已报道的Brd4蛋白抑制剂JQ1和IBET151，能够有效阻断Bromodomain结构域介导的乙酰化调控，抑制多种癌症的发生发展。也有少量溴结构域蛋白抑制剂如OTX-015和RVX-208已进入临床研究阶段。然而，目前发现的Brd4蛋白抑制剂并不多，迫切需要寻找更多的Brd4抑制剂，为癌症的治疗提供新选择。
技术实现要素：
本发明提供了一类具有BRD4蛋白抑制作用的化合物及其制备方法和应用。
一种具有BRD4蛋白抑制作用的化合物，为式I结构；
式I中，R1为氢、羟基、甲氧基、硝基、卤素或氨基；R2为氢、羰基、羟基、异戊烯基、羟基异戊烯基、烷氧基、硝基、卤素或氨基；R3为氢、羟基、硝基、卤素或氨基；R4为氢、羟基、硝基、卤素或氨基；R5为异戊烯基、羟基异戊烯基、硝基、卤素或氨基；R6为氢、异戊烯基、羟基异戊烯基、硝基、卤素或氨基。prenyl为异戊烯基，Oprenyl为羟基异戊烯基。
式I的化合物包括：
verruculogen TR-2：R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝CH2(OH)C(CH3)2，R6＝H；
12β-hydroxyverruculogen TR-2：R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝β-OH，R4＝H，R5＝CH2(OH)C(CH3)2，R6＝H；
12β-hydroxy-13α-methoxyverruculogen：R1＝OCH3，R2＝OCH3，R3＝β-OH，R4＝H，R5＝CH2(OH)C(CH3)2，R6＝H；
12β-hydroxy-13α-ethoxyverruculogen：R1＝OCH3，R2＝OCH2CH3，R3＝β-OH，R4＝H，R5＝CH2(OH)C(CH3)2，R6＝H；
12β-hydroxy-13α-butoxyethoxyverruculogen TR-2：R1＝OCH3，R2＝OC2H4OC4H9，R3＝β-OH，R4＝H，R5＝CH2(OH)C(CH3)2，R6＝H；
12α-hydroxy-13α-prenylverruculogen TR-2：R1＝OCH3，R2＝Oprenyl，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝CH2(OH)C(CH3)2，R6＝H；
cycloprostatin C：R1＝H，R2＝α-OH，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6＝H；
12,13-dihydroxyfumitremorgin C：R1＝OCH3，R2＝α-OH，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6＝H；
cyclotryprostatin B：R1＝OCH3，R2＝α-OH，R3＝β-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6＝H；
hydrocycloprostatin A：R1＝H，R2＝H，R3＝β-OH，R4＝OH，R5＝prenyl，R6＝H；
hydrocycloprostatin B：R1＝OCH3，R2＝α-OH，R3＝β-OH，R4＝OH，R5＝prenyl，R6＝H；
neofipiperzine C：R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝CH2(OH)C(CH3)2，R6＝prenyl；
fumitremorgin B：R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6＝prenyl；
prenylcycloprostatin B：R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6＝prenyl；
25-hydroxyfumitremorgin B：R1＝OCH3，R2＝OH，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6为CH＝C(CH3)2OH；
13-prenyl fumitremorgin B：R1＝OCH3，R2＝Oprenyl，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6＝prenyl；
12β-hydroxy-13α-butoxyethoxyfumitremorgin B：R1＝OCH3，R2＝OC2H4OC4H9，R3＝β-OH，R4＝H，R5＝prenyl，R6＝prenyl。
另一种具有BRD4蛋白抑制作用的化合物，为式II结构；
式II中，R1为氢、羟基、甲氧基、硝基、卤素或氨基；R2为氢、羰基、羟基、异戊烯基、羟基异戊烯基、烷氧基、硝基、卤素或氨基；R3为氢、羟基、硝基、卤素或氨基；R4为氢、羟基、硝基、卤素或氨基；R5为氢、羟基、硝基、卤素或氨基；R6为氢、羟基、硝基、卤素或氨基。式II的化合物包括：
12β-hydroxy-13α-methoxyverruculogen：R1＝OCH3，R2＝OCH3，R3＝β-OH，R4＝H，R5＝H，R6＝H；
fumitremorgin A：R1＝OCH3，R2＝Oprenyl，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝H，R6＝H；
26α-hydroxyfumitremorgin A：R1＝OCH3，R2＝Oprenyl，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝OH，R6＝H；
25-hydroxyfumitremorgin A：R1＝OCH3，R2＝Oprenyl，R3＝α-OH，R4＝H，R5＝H，R6＝OH。
式II的化合物中，25-hydroxyfumitremorgin A对BRD4蛋白具有较好的抑制作用，同时又是一种全新的化合物。
另一种具有BRD4蛋白抑制作用的化合物，为式III结构；
式III中，R1为氢、羟基、甲氧基、硝基、卤素或氨基；R2为氢、羟基、异戊烯基、羟基异戊烯基、硝基、卤素或氨基；R3为氢、羰基、羟基、硝基、卤素或氨基；R4为氢、羟基、硝基、卤素或氨基；R5为氢、羟基、硝基、卤素或氨基；R6为氢、羟基、异戊烯基、羟基异戊烯基、硝基、卤素或氨基。
式III的化合物包括：
spirotryprostatin C：R1＝OCH3，R2＝prenyl，R3＝α-OH，R4＝α-OH，R5＝H，R6＝prenyl；
spirotryprostatin D：R1＝OCH3，R2＝prenyl，R3＝α-OH，R4＝α-OH，R5＝OH，R6＝prenyl。
一种具有BRD4蛋白抑制作用的化合物的制备方法，步骤包括：
1)将海洋真菌单独或者和细菌共同接种于固体培养基中，20-35℃下，静置培养20-60天，得到发酵产物；
2)将所得的发酵产物，用有机溶剂提取，经浓缩、分离纯化得到具有BRD4蛋白抑制作用的化合物，为单体或混合物。
步骤1)中，所述的海洋真菌、细菌均采用市售产品，海洋真菌采用北京北纳创联生物技术研究院出售的青霉菌Penicillium brefeldianum ATCC74184，细菌采用北京北纳创联生物技术研究院出售的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BNCC136102，或者采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的CICC 10024。
所述的固体培养基，由以下重量份的组分组成：
谷物 100份；
海水或海水与水的混合物 100～300份。
所述的液体培养基，采用以下重量份的组分原料，煮15～25分钟取滤液：
谷物 100份；
海水或海水与水的混合物 100～300份。
所述的谷物为大米、燕麦、小麦等中的一种或两种以上(包括两种)。
所述的海水或海水与水的混合物由质量百分数30％～100％的海水和质量百分数0％～70％的水组成。
步骤2)中，所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种或两种以上。
分离纯化具体包括：经硅胶柱层析、大孔树脂或凝胶柱层析初步分离，再经硅胶柱层析、C18反相柱层析纯化；分离纯化过程由薄层色谱、高效液相色谱检识所需的组分。初步分离采用硅胶柱层析、大孔树脂、凝胶柱层析三种方式中选取一种即可。
本发明采用BRD4bromodomain 1TR-FRET assay kit(Cisbio)进行活性评价试验，本发明提供的化合物能在不同程度抑制BRD4蛋白，可用于制备BRD4蛋白抑制剂。
所述的BRD4蛋白抑制剂在制备用于预防和治疗与BRD4蛋白抑制剂有关的疾病的药物中的用途，所述的疾病包括非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤、外周神经鞘膜瘤等癌症。
即所述的具有BRD4蛋白抑制作用的化合物可用于制备抗癌药物，可用于预防和治疗癌症，所述的癌症为非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤或者外周神经鞘膜瘤。特别适合用于外周神经鞘膜瘤、肝癌。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明中，所述的具有BRD4蛋白抑制作用的化合物能在不同程度抑制BRD4蛋白，可用于制备BRD4蛋白抑制剂，用于预防和治疗与BRD4蛋白抑制剂有关的疾病，疾病包括非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤、外周神经鞘膜瘤等癌症，具备广阔的应用前景。
具体实施方式
菌种来源
采用市售产品，北京北纳创联生物技术研究院出售的青霉菌Penicillium brefeldianum ATCC74184和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BNCC136102。
实施例1
将海洋真菌(青霉菌Penicillium brefeldianum ATCC74184)接种于大米培养基(大米-75％海水，质量比1:1，75％海水是由质量百分数75％的海水和质量百分数25％的水)，培养40天。所得培养物用乙酸乙酯提取，提取物经硅胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇100:0、100:1、50:1，所得组分经薄层色谱检识，硅胶柱层析纯化，得到fumitremorgin A、13-prenyl fumitremorgin B、spirotryprostatin C。两个化合物在20μM浓度对BRD4蛋白的抑制率分别为52％、57％和50％，阳性药JQ1抑制率为86％。
实施例2
将海洋真菌(青霉菌Penicillium brefeldianum ATCC74184)和细菌(巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BNCC136102)接种于大米培养基(大米-75％海水，质量比1:1.5，75％海水是由质量百分数75％的海水和质量百分数25％的水)，培养30天。所得培养物经乙酸乙酯提取，提取物经硅胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇100:0、100:1、50:1，所得组分经薄层色谱检识，硅胶柱层析和反相制备液相纯化，得到12β-hydroxyverruculogen TR-2、12α-hydroxy-13α-prenylverruculogen TR-2、neofipiperzine C、fumitremorgin B、prenylcycloprostatin B、13-prenyl fumitremorgin B、12β-hydroxy-13α-butoxyethoxyfumitremorgin B、fumitremorgin A、12β-hydroxy-13α-methoxyverruculogen、26α-hydroxyfumitremorgin A、25-hydroxyfumitremorgin A。以上化合物在浓度为20μM对BRD4蛋白的抑制率分别如表1所示：
表1
实施例3
人非小细胞肺癌HI975细胞抑制率实验。取取正常培养的处于对数期的细胞，3×104个/mL铺96孔板，加入药物培养24h后CCK8检测细胞活力。细胞存活率(％)＝实验组OD值/不加药组OD值×100％。药物在浓度为10μM时对肿瘤细胞的抑制率分表1中本发明的化合物均在25％～50％，具有明显的抑制人非小细胞肺癌HI975细胞的作用。
实施例4
将海洋真菌(青霉菌Penicillium brefeldianum ATCC74184)和细菌(巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium BNCC136102)接种于大米培养基(大米-75％海水，质量比1:2，75％海水是由质量百分数75％的海水和质量百分数25％的水)，培养30天。所得培养物乙酸乙酯提取，提取物经硅胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇100:0、100:1、50:1、25:1，所得组分经薄层色谱检识，硅胶柱层析和反相制备液相纯化，得到以下化合物：
化合物12β-hydroxy-13α-ethoxyverruculogen TR-2，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表2所示：
表2 NMR数据(溶剂CDCl3)
化合物12β-hydroxy-13α-butoxyethoxyverruculogen TR-2，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表3所示：
表3 NMR数据(溶剂CDCl3)
化合物hydrocycloprostatin A，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表4所示：
表4 NMR数据(溶剂DMSO)
化合物hydrocycloprostatin B，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表5所示：
表5 NMR数据(溶剂DMSO)
化合物25-hydroxyfumitremorgin B，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表6所示：
表6 NMR数据(溶剂DMSO)
化合物12β-hydroxy-13α-butoxyethoxyfumitremorgin B，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表7所示：
表7 NMR数据(溶剂CDCl3)
化合物12β-hydroxy-13α-methoxyverruculogen，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表8所示：
表8 NMR数据(溶剂CDCl3)
化合物26α-hydroxyfumitremorgin A，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表9所示：
表9 NMR数据(溶剂CDCl3)
化合物25-hydroxyfumitremorgin A，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表10所示：
表10 NMR数据(溶剂CDCl3)