一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法与流程

本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法。

背景技术：

西葫芦是世界性大宗蔬菜之一，也是我国主要瓜类蔬菜。每年西葫芦种植面积约在500万亩以上，其中山东、山西、云南、西北等地区为我国重要的西葫芦优质产区。西葫芦病毒病是一种普遍发生且危害性很大的病害。侵染西葫芦的病毒主要有以下3种：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)，而且在田间病毒会经常发生复合感染。

目前检测西葫芦病毒病的方法有双抗体夹心法(DAS-ELISA)和硝酸纤维素膜法(NCM-ELISA)法、血清抗原检测等方法；但这些方法操作复杂、费用高、需要时间较长。

除此之外，现有技术中也有采用多重RT-PCR对其他作物同时检测多种病毒感染情况的技术方案，但是这些方案中所采用的引物一般均为特异性引物，难以多种变种同时检测，检测效率低下，同时很多现有技术中会采用多组特异性引物，以求检测更多的病毒，但是这样反而会导致引物之间相互影响，检测的准确率严重下降，可信度也大幅下降，检测成本反而更高。

为了保证西葫芦生产的产量和质量，准确鉴定西葫芦病毒病，西葫芦生产上急需一种较为准确、灵敏和快速的病毒检测方法。

技术实现要素：

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法，该方法运用根据3种病毒核苷酸保守区序列设计的引物进行多重RT-PCR，可检测感病西葫芦叶片组织中是否受到CMV、WMV和ZYMV 3种病毒的复合侵染，具有鉴定过程简单、步骤少、设备要求低、费用少、时间短和精确性高等优点。

本发明的具体技术方案如下：

发明人首先针对三种病毒设计了三组引物对如下：

用于检测黄瓜花叶病毒的引物对：CMV-F/CMV-R：

CMV-F如SEQ ID NO.1所示：5′-AACCYGGKTACACGTTCACATCTAT-3′，

CMV-R如SEQ ID NO.2所示：5′-GGAATKCGTTGRTGCTCG-3′，

用于检测西瓜花叶病毒的引物对：WMV-F/WMV-R：

WMV-F如SEQ ID NO.3所示：5′-CCACGACTACAAAAGATAACAAA-3′，

WMV-R如SEQ ID NO.4所示：5′-GTGCCTCTCAGTATTTTCGG-3′，

用于检测小西葫芦花叶病毒的引物对：ZYMV-F/ZYMV-R：

ZYMV-F如SEQ ID NO.5所示：5′-TCAGGCACTCAGCCAACT-3′，

ZYMV-R如SEQ ID NO.6所示：5′-TCCATCAAGGCCAAACAAC-3′。

本发明所涉及的上述引物为针对西葫芦病毒：黄瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒专门设计的兼并引物或特异引物，与现有技术中单独出现过的特异性引物相比，检测范围更大，可以检测上述病毒的多种变种或小种，更好的反映西葫芦的患病情况，确定是否感染的就是病毒病，从而帮助使用者确定相应的对策；由于现在农业生产中感染西葫芦的病毒主要就是上述三种病毒，因此发明人主要选取了上述三组引物进行检测，且由于上述病毒感染时一般是混合侵染，采用上述方法能够取得最佳的检测效果，避免了采用过多对引物检测造成的相互影响。

在上述引物的基础上，发明人进一步公开了利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法,具体步骤如下：

(1)提取感病西葫芦叶片总RNA；

(2)反转录成cDNA；

(3)用3对RT-PCR引物进行多重RT-PCR；

其中步骤(3)中多重RT-PCR扩增体系为25μL，其中包括1μL的模板cDNA、2μL的引物对、浓度为1.0mmol/L的dNTPs、酶活为1U的Taq DNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg²⁺；

多重RT-PCR反应程序为95℃预变性3min，95℃变性30s、55℃退火复性30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；

(4)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判定西葫芦是否感染病毒病；

步骤(4)中判定标准为：若西葫芦叶片感染病毒病，则扩增黄瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为439bp，扩增西瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为615bp，扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为744bp。

步骤(1)和(2)的技术方案均采用现有技术，发明人在此不再赘述；

综上所述，本发明提供了一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法，该方法运用根据3种病毒核苷酸保守区序列设计的特异性引物进行多重RT-PCR，可检测感病西葫芦叶片组织中是否受到CMV、WMV和ZYMV 3种病毒的复合侵染，具有鉴定过程简单、步骤少、设备要求低、费用少、时间短和精确性高等优点。

附图说明

图1为检测人工接种黄瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、小西葫芦花叶病毒及同时接种三种病毒病的西葫芦凝胶电泳图；

其中，M为Marker，1为阳性质粒PCR对照，2为健康西葫芦对照，3、4为人工接种ZYMV的西葫芦样品，5、6为人工接种WMV的西葫芦样品，7、8为人工接种CMV的西葫芦样品，9、10为同时接种CMV、WMV、ZYMV的西葫芦样品；

图2为RT-PCR检测田间发病西葫芦凝胶电泳图；

其中，M为Marker，1为阳性质粒PCR对照，2为健康西葫芦对照，3-8为田间感病西葫芦样品；

图3为人工接种田间侵染三种病毒的西葫芦凝胶电泳图；

其中，M为Marker，1为阳性质粒PCR对照，2为健康西葫芦对照，3-8为感病西葫芦样品；

图4为人工接种三种黄瓜花叶病毒的西葫芦凝胶电泳图；

其中，M为Marker，1为阳性质粒PCR对照，2为健康西葫芦对照，3和4为接种CMV1西葫芦样品，5和6为接种CMV2西葫芦样品，7和8为接种CMV3西葫芦样品。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

实施例1

以健康植株为对照，检测分别人工接种黄瓜花叶病毒病、西瓜花叶病毒病和小西葫芦花叶病毒及同时接种3种病毒的西葫芦植株(利用石英砂摩擦侵染病毒的烟草叶片，然后将带病毒的汁液摩擦接种到西葫芦子叶上。方法参考方荣祥院士相关文章记载)，验证方法可靠性。

1、采取健康和人工接种病毒后的西葫芦叶片，迅速液氮冷冻后存-80℃；

2、总RNA的提取

分别称取样品各0.5g放入-80℃深冻研钵中加液氮充分研磨，迅速转入到液氮预冷的无RNase的无菌1.5mLeppendorf管中，加入1mL4℃预冷的Trizol提取液中，充分混匀后静置5min，4℃，12,000g离心5min。上清用200μL氯仿抽提一次，4℃，12,000g离心15min。上清加入等体积异丙醇，颠倒混匀后静置10min，于4℃，12,000g离心15min。弃上清液，沉淀用70％预冷的乙醇洗涤一次，充分干燥后溶于30μL DEPC处理的ddH₂O中-20℃保存备用。

3、cDNA第一链的合成

使用天根FastQuant cDNA第一链合成试剂盒。将模板RNA在冰上解冻，取2μg模板RNA，按照说明书基因组DNA的去除体系配置混合液，42℃孵育3min，以除去基因组DNA；按说明书加入反转录体系混合液，42℃孵育15min，95℃灭活3min，置冰上待用。

4、RT-PCR反应

本实施方式中使用3对引物，分别是用于检测黄瓜花叶病毒的引物对：CMV-F(SEQ IDNO.1)/CMV-R(SEQ ID NO.2)；用于检测西瓜花叶病毒的引物对：WMV-F(SEQ ID NO.3)/WMV-R(SEQID NO.4)；用于检测小西葫芦花叶病毒的引物对：ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)。

PCR反应体系为25μL，其中包括10×PCR Buffer 2.5μL，0.5mM dNTPs，以0.5μL上述cDNA或已知片段质粒为模板，引物各5μM，1U Taq DNA聚合酶，无菌超纯水补齐至25μL；

扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃；

5、电泳检测

取5μL PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，110V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到感染CMV的西葫芦扩增出439bp条带，感染WMV的西葫芦扩增出615bp条带，感染ZYMV的西葫芦扩增出744bp条带及同时接种三种病毒的西葫芦样品扩增出三条相应条带，参见图1。可见人工接种与检测结果对应。

实施例2 RT-PCR检测田间发病西葫芦病毒病侵染种类

1、从田间采取6个感病西葫芦样品叶片及健康西葫芦叶片，迅速液氮冷冻后存-80℃；

2、总RNA的提取

分别称取样品各0.5g放入-80℃深冻研钵中加液氮充分研磨，迅速转入到液氮预冷的无RNase的无菌1.5mLeppendorf管中，加入1mL4℃预冷的Trizol提取液中，充分混匀后静置5min，4℃，12,000g离心5min。上清用200μL氯仿抽提一次，4℃，12,000g离心15min。上清加入等体积异丙醇，颠倒混匀后静置10min，于4℃，12,000g离心15min。弃上清液，沉淀用70％预冷的乙醇洗涤一次，充分干燥后溶于30μL DEPC处理的ddH₂O中-20℃保存备用。

3、cDNA第一链的合成

使用天根FastQuant cDNA第一链合成试剂盒。将模板RNA在冰上解冻，取2μg模板RNA，按照说明书基因组DNA的去除体系配置混合液，42℃孵育3min，以除去基因组DNA；按说明书加入反转录体系混合液，42℃孵育15min，95℃灭活3min，置冰上待用。

4、RT-PCR反应

本实施方式中使用3对引物，分别是用于检测黄瓜花叶病毒的引物对：CMV-F(SEQ ID NO.1)/CMV-R(SEQ ID NO.2)；用于检测西瓜花叶病毒的引物对：WMV-F(SEQ ID NO.3)/WMV-R(SEQ ID NO.4)；用于检测小西葫芦花叶病毒的引物对：ZYMV-F(SEQ ID NO.5)/ZYMV-R(SEQ ID NO.6)。

PCR反应体系为25μL，其中包括10×PCR Buffer 2.5μL，0.5mM dNTPs，以0.5μL上述cDNA或已知片段质粒为模板，引物各5μM，1U Taq DNA聚合酶，无菌超纯水补齐至25μL；

扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃；

5、电泳检测

取5μL PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在0.5×TAE缓冲液环境中，110V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到2条或3条特异性条带，得到每种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图2。

可见田间感病西葫芦样品均为混合侵染，本发明所提供的方法针对混合侵染的检测效果可信度较高。

实施例3

人工接种实施例2中检测到三种病毒的西葫芦汁液观察表型及电泳检测，验证方法准确性

1、将实施例2中检测到三种病毒的西葫芦病叶用石英砂研磨后，人工接种到健康的一周大的西葫芦子叶上，两周后统计发病情况。

2、采取接种后的西葫芦叶片及健康西葫芦叶片，按实施例2中操作检测发病情况，电泳结果如图3所示，均检测到三条特异性条带，即受三种病毒侵染。

综上所述，与常规的接种方法检测比较，该检测方法准确、可靠、省时省力。

实施例4

以健康植株为对照，分别人工接种黄瓜花叶病毒病3个小种至健康西葫芦子叶上检测系统的可靠性。

1、将携带三种黄瓜花叶病毒小种的烟草叶片用石英砂研磨后，人工接种到健康的一周大的西葫芦子叶上。

2、两周后，采取接种后的西葫芦叶片及健康西葫芦叶片，按实施例2中操作检测发病情况，电泳结果如图4所示，均检测到439bp特异性条带，即3种黄瓜花叶病毒均可被检测到，可见本发明所提供的引物和方法可以实现多种小种的检测。

<110>李兴盛

<120>一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法

<160>6

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aaccyggkta cacgttcaca tctat 25

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggaatkcgtt grtgctcg 18

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccacgactac aaaagataac aaa 23

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtgcctctca gtattttcgg 20

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcaggcactc agccaact 18

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tccatcaagg ccaaacaac 19