1.一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法,其特征在于:采用多重RT-PCR,其中所采用的分子标记分别为:
用于检测黄瓜花叶病毒的引物对:CMV-F/CMV-R:
CMV-F如SEQ ID NO.1所示:5′-AACCYGGKTACACGTTCACATCTAT-3′,
CMV-R如SEQ ID NO.2所示:5′-GGAATKCGTTGRTGCTCG-3′,
用于检测西瓜花叶病毒的引物对:WMV-F/WMV-R:
WMV-F如SEQ ID NO.3所示:5′-CCACGACTACAAAAGATAACAAA-3′,
WMV-R如SEQ ID NO.4所示:5′-GTGCCTCTCAGTATTTTCGG-3′,
用于检测小西葫芦花叶病毒的引物对:ZYMV-F/ZYMV-R:
ZYMV-F如SEQ ID NO.5所示:5′-TCAGGCACTCAGCCAACT-3′,
ZYMV-R如SEQ ID NO.6所示:5′-TCCATCAAGGCCAAACAAC-3′。
2.根据权利要求1所述的利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法,其特征在于:具体步骤如下:
(1)提取感病西葫芦叶片总RNA;
(2)反转录成cDNA;
(3)用3对RT-PCR引物进行多重RT-PCR;
(4)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得病毒基因扩增产物条带,判定西葫芦是否感染病毒病;
其中步骤(3)中多重RT-PCR扩增体系为25μL,其中包括1μL的模板cDNA、2μL的引物对、浓度为1.0mmol/L的dNTPs、酶活为1U的Taq DNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+;
多重RT-PCR反应程序为95℃预变性3min,95℃变性30s、55℃退火复性30s、72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸5min。
3.根据权利要求1所述的利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法,其特征在于:
步骤(4)中判定标准为:若西葫芦叶片染毒,则扩增黄瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为439bp,扩增西瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为615bp,扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为744bp。