一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法与流程

文档序号:12346714阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法,其特征在于:采用多重RT-PCR,其中所采用的分子标记分别为:

用于检测黄瓜花叶病毒的引物对:CMV-F/CMV-R:

CMV-F如SEQ ID NO.1所示:5′-AACCYGGKTACACGTTCACATCTAT-3′,

CMV-R如SEQ ID NO.2所示:5′-GGAATKCGTTGRTGCTCG-3′,

用于检测西瓜花叶病毒的引物对:WMV-F/WMV-R:

WMV-F如SEQ ID NO.3所示:5′-CCACGACTACAAAAGATAACAAA-3′,

WMV-R如SEQ ID NO.4所示:5′-GTGCCTCTCAGTATTTTCGG-3′,

用于检测小西葫芦花叶病毒的引物对:ZYMV-F/ZYMV-R:

ZYMV-F如SEQ ID NO.5所示:5′-TCAGGCACTCAGCCAACT-3′,

ZYMV-R如SEQ ID NO.6所示:5′-TCCATCAAGGCCAAACAAC-3′。

2.根据权利要求1所述的利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法,其特征在于:具体步骤如下:

(1)提取感病西葫芦叶片总RNA;

(2)反转录成cDNA;

(3)用3对RT-PCR引物进行多重RT-PCR;

(4)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得病毒基因扩增产物条带,判定西葫芦是否感染病毒病;

其中步骤(3)中多重RT-PCR扩增体系为25μL,其中包括1μL的模板cDNA、2μL的引物对、浓度为1.0mmol/L的dNTPs、酶活为1U的Taq DNA聚合酶和浓度为2.0mmol/L的Mg2+

多重RT-PCR反应程序为95℃预变性3min,95℃变性30s、55℃退火复性30s、72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸5min。

3.根据权利要求1所述的利用分子标记快速检测西葫芦病毒病的方法,其特征在于:

步骤(4)中判定标准为:若西葫芦叶片染毒,则扩增黄瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为439bp,扩增西瓜花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为615bp,扩增小西葫芦黄花叶病毒病的引物对所扩增出的核苷酸片段长度为744bp。

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