一种鲷鱼种质鉴定的方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及鱼类分子标记育种方法，具体涉及一种鲷鱼种质鉴定的方法及其应用。

背景技术：

真鲷Pagrosomus major属鲈形目、鲷科、真鲷属，黑鲷Spraus macrocephalus属鲈形目、鲷科、黑鲷属，它们都是我国重要的海水养殖经济鱼类。真鲷具有个体大、生长快、肉质好、色泽美、抗病能力强等特点，但对盐度、温度变化敏感，抗逆性较差；黑鲷对温度、盐度适应范围较广，但生长慢，养成周期长。通过真鲷和黑鲷杂交育种，可以获得具有双亲优良性状的杂交子代，从而提高鲷鱼养殖经济效益，推动鲷鱼养殖业的发展。在杂交后代中，正交后代(真鲷♀×黑鲷♂)和反交后代(黑鲷♀×真鲷♂)体现出不一样的生产性能，其中正交后代具有较好的杂交优势，生产性能优良。在生产中，杂交种外部形态又与亲本很相似，正交后代与反交后代也容易混淆，因此，生产上很容易造成鲷鱼种质混杂，导致生产性能下降和种质退化。

技术实现要素：

解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种快速、准确的检测方法，且为鲷鱼的品种鉴定、种质资源保护和育种等提供重要依据，本发明提供了一种鲷鱼种质鉴定的方法及其应用。

技术方案：一种鲷鱼种质鉴定的方法，包含以下步骤：

(1)以鲷鱼基因组DNA为模板，采用引物A进行特异性扩增，鉴别真鲷、黑鲷及二者的杂交后代；所述引物A的序列为SEQ ID NO：1～2；

(2)以步骤(1)鉴别获得的杂交后代基因组DNA为模板，采用引物B进行特异性扩增；所述引物B的序列为SEQ ID NO：3～4；

(3)酶切步骤(2)的扩增产物，鉴别正交后代和反交后代。

引物序列如表1所示：

表1鲷鱼种质鉴定的引物序列

优选的，步骤(3)酶切过程采用的是限制性内切酶MspI。

优选的，步骤(3)酶切的体系为：扩增产物10μL，灭菌双蒸水18μL，10×buffer Tango 2μL，酶10～20U，37℃酶切12h。

优选的，步骤(1)和步骤(2)的扩增体系为：总体积20μL，其中含10×反应缓冲液2μL，Mg²⁺2mmol/L，dNTP 200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板100ng～200ng，用灭菌双蒸水补足至20μL。

优选的，步骤(1)扩增反应的条件为：94℃2min；94℃30s，57℃退火30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

优选的，步骤(2)扩增反应的条件为：94℃2min；94℃30s，55℃退火30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

优选的，步骤(1)的扩增产物采用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。

优选的，步骤(3)酶切产物采用3％琼脂糖凝胶进行电泳分离。

所述鲷鱼种质鉴定的方法在鲷鱼育种中的应用。

有益效果：(1)本发明所述鲷鱼种质鉴定的方法能够在分子水平快速、准确的鉴定鲷鱼的种质；(2)所述方法能够清楚鉴别真鲷、黑鲷及二者正反交后代，为鲷鱼的品种鉴定、种质资源保护和育种等提供重要依据。

附图说明

图1是真鲷、黑鲷及正反交后代鉴定结果图；

其中，M为分子量标准，1～10为真鲷，11～19为正交后代，20～29为黑鲷，30～35为反交后代；

图2是杂交后代鉴定结果图；

其中，M为分子量标准，1～12为正交后代，13～23为反交后代；

图3为实施例3中真鲷、黑鲷及二者杂交后代鉴定结果图；

其中，M为分子量标准，1～12、35～37为杂交后代，13～24为真鲷，25～34为黑鲷；

图4为实施例3杂交后代鉴定结果图；

其中，M为分子量标准，1～12为正交后代，13～25为反交后代。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1引物A可行性分析

种质确定的真鲷、黑鲷各10尾，正交后代(真鲷♀×黑鲷♂)9尾，反交后代(黑鲷♀×真鲷♂)6尾，共35个样品，从江苏省海洋水产研究所吕四基地采得。

每尾鱼取30μL血细胞抽提基因组DNA，分别以提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物A的正义引物序列为：5′AACACTTATCGCACGGCTCAG3′，反义引物序列为：5′CCCTCTGAGATCTTCACCTCCA 3′；PCR体系总体积20μL，其中含10×反应缓冲液2μL，Mg²⁺2mmol/L，dNTP 200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板100ng～200ng，用灭菌双蒸馏水补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃2min；94℃30s，57℃退火30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。每个样本取PCR反应产物3μL采用8.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果。

如图1所示，真鲷有1条255bp的条带，黑鲷有1条271bp的条带，真鲷和黑鲷的杂交后代(正交和反交)都有2条条带，分别为255bp和271bp。因此，引物A可将真鲷、黑鲷及其杂交后代区别开来。

实施例2引物B结合酶切可行性分析

种类确定的正交后代(真鲷♀×黑鲷♂)12尾，反交后代(黑鲷♀×真鲷♂)11尾，共23个样品，从江苏省海洋水产研究所吕四基地采得。

每尾鱼取30μL血细胞抽提基因组DNA，分别以提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物B的正义引物序列为：5′GCATAACACTGAAGCTGTTAAGATGG3′，反义引物序列为：5′CAATGTTTATCACTGCTGAGTACCCT 3′；PCR体系总体积20μL，其中含10×反应缓冲液2μL，Mg²⁺2mmol/L，dNTP 200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板100ng～200ng，用灭菌双蒸馏水补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃2min；94℃30s，55℃退火30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。每个样本取PCR反应产物7μL用1.5％的琼脂糖进行电泳检测，结果都扩出1条235bp左右的目的条带。在剩余的PCR反应产物中，每个样品配制酶切体系：PCR反应产物10μL，灭菌双蒸馏水18μL，10×buffer Tango 2μL，MspI酶15U，37℃酶切12h后，酶切产物用3％的琼脂糖电泳拍照记录电泳结果。如图2所示，正交后代都有2条条带，分别为141bp和93bp，反交后代都有1条条带，235bp。因此，引物B结合酶切的方法能将正交后代和反交后代区别开来。

实施例3鲷鱼种质鉴定

待检真鲷12尾，黑鲷10尾，真鲷和黑鲷杂交鲷15尾，从江苏省海洋水产研究所吕四基地采得。

剪取每尾鱼尾鳍并抽提基因组DNA，采用如实施例1所述的方法进行PCR扩增、电泳检测。如图3所示，真鲷都有1条255bp的条带，黑鲷都有1条271bp的条带，真鲷和黑鲷杂交鲷都有2条条带，分别为255bp和271bp，所检测的12尾真鲷，10尾黑鲷都为纯种，没有种质混杂。

15尾杂交鲷再采用如实施例2所述的方法进行PCR扩增、检测、再酶切，酶切产物用3％的琼脂糖电泳拍照记录电泳结果。如图4所示，15尾杂交鲷中有12尾有2条条带，分别为141bp和93bp，为正交鲷鱼(真鲷♀×黑鲷♂)，有3尾只有1条235bp的条带，为反交鲷鱼(黑鲷♀×真鲷♂)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

江苏省海洋水产研究所

<120> 一种鲷鱼种质鉴定的方法及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacacttatc gcacggctca g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctctgaga tcttcacctc ca 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcataacact gaagctgtta agatgg 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caatgtttat cactgctgag taccct 26