本发明属于遗传检测领域，特别涉及一种用于检测胃癌易感性的试剂盒及其SNP标志物。
背景技术：
胃癌是严重危害人类健康的疾病，居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。胃癌的发生主要与环境、幽门螺旋杆菌和遗传因素有关。近年来，某些基因的单核苷酸多态性在胃癌易感性研究中被受关注。
采用单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphsm，SNP)作为基因组标志的关联分析方法是目前最常用的疾病的遗传易感基因检测方法之一。SNP是指基因组水平上由单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1％，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。SNP遗传稳定性强，易于检测，位于基因内部的SNP能直接影响到蛋白质的结构或表达水平，进而影响到组织、器官乃至生理功能。
对常见疾病相关多种遗传标识进行早期检测和系统评估将有助于对疾病的早期预防、诊断和治疗。目前，研究已经发现大量与各种常见疾病相关的遗传学标识，然而，由于缺乏有足够的灵敏度和可以对多种疾病相关标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验的方法，使得这些常见疾病的遗传学标识无法广泛应用。此外，目前常见疾病遗传标识缺乏系统、有效的整合，大大制约了常见疾病早期预防、诊断和治疗方面的发展。现有检测只有单一种疾病或一类疾病的遗传标识检测，检测范围有限，且某些常见疾病尚无早期检测的方法。
目前，一些传统医学手段，如组织细胞检测存在着其固有的缺陷，取材位置不当、组织细胞标本材料不足或认为经验不足等都将导致胃癌误诊。其他技术例如影像学虽然已被广泛应用于胃癌的检查和诊断，但其在疾病胃癌程度的定性上仍存在着很大的局限性。
综上所述，研发一种用于通过多个易感位点检测胃癌易感性的试剂盒对胃癌发病风险的预测、预防、诊断提供依据具有重要意义。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出了一种用于检测胃癌易感性的SNP标志物、SNP标志物的PCR扩增引物和单碱基延伸引物及其试剂盒，本发明的28个SNP位点为胃癌的患病风险评估、诊断参考提供重要依据。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
一种用于检测胃癌易感性的SNP标志物，所述SNP标志物包括28个SNP位点，所述28个SNP位点为rs16861205、rs10773989、rs1044471、rs3212986、rs187116、rs121964871、rs26160、rs17690554、rs1880481、rs2072454、rs1799793、rs11466306、rs889312、rs2279744、rs3732183、rs2303428、rs1801133、rs4072037、rs4648068、rs2274223、rs2076167、rs3734254、rs13361707、rs2294008、rs2976392、rs1478604、rs11536889和rs9841504。
上述的SNP标志物的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，
所述检测rs16861205的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：3；
所述检测rs10773989的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：6；
所述检测rs1044471的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：9；
所述检测rs3212986的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：12；
所述检测rs187116的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：15；
所述检测rs121964871的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：18；
所述检测rs26160的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：21；
所述检测rs17690554的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：24；
所述检测rs1880481的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：27；
所述检测rs2072454的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：30；
所述检测rs1799793的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：33；
所述检测rs11466306的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：36；
所述检测rs889312的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：39；
所述检测rs2279744的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：42；
所述检测rs3732183的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：45；
所述检测rs2303428的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：48；
所述检测rs1801133的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：51；
所述检测rs4072037的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：54；
所述检测rs4648068的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：57；
所述检测rs2274223的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：60；
所述检测rs2076167的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：63；
所述检测rs3734254的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：66；
所述检测rs13361707的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：69；
所述检测rs2294008的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：72；
所述检测rs2976392的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：75；
所述检测rs1478604的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：78；
所述检测rs11536889的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：81；
所述检测rs9841504的PCR扩增引物的序列分别为SEQ ID NO：82和SEQ ID NO：83，以及单碱基延伸引物的序列为SEQ ID NO：84。
一种用于检测胃癌易感性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2所述SNP标志物的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，用于检测外周血DNA中28个SNP位点为rs16861205、rs10773989、rs1044471、rs3212986、rs187116、rs121964871、rs26160、rs17690554、rs1880481、rs2072454、rs1799793、rs11466306、rs889312、rs2279744、rs3732183、rs2303428、rs1801133、rs4072037、rs4648068、rs2274223、rs2076167、rs3734254、rs13361707、rs2294008、rs2976392、rs1478604、rs11536889和rs9841504。
上述的一种用于检测胃癌易感性的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、酶切反应缓冲液、去离子水。
本发明所述的试剂盒是以本发明人基于多个国际和国内大样本量的胃癌人群和正常人群胃癌易感基因筛查结果的前期研究为基础，通过本发明人自主设计的胃癌SNP筛选流程，从NCBI-pubmed数据库中筛选符合条件的SNP位点：1)查找与胃癌相关的文献，通过影响因子和发表年限进行过滤；2)查看候选文献的摘要，进一步排除与胃癌SNP研究无关的文献；3)阅读文献，找到胃癌对应的SNP位点；4)以选取的SNP位点和胃癌为关键词再一次查阅文献；5)判断选取的SNP位点是否与胃癌密切相关，选取与胃癌最密切相关的SNP位点、对应OR值以及突变碱基；6)将上一步骤获得的SNP位点，通过Sequenom公司软件Typer 4.0进行在线评估，获得最终的28个SNP位点列表。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于检测胃癌易感性的检测方法与试剂盒，还达到了以下效果：本发明的28个SNP位点经过文献论证，具有较高的实用性，可用于胃癌的早期评估和大规模筛查，并且该28个位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高，为胃癌的患病风险评估、诊断参考提供重要依据，以实现对胃癌疾病的早期评估。
以下便结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。
实施例1 用于检测胃癌易感性相关的SNP位点
其中，rs16861205位于基因ADIPOQ区域，rs10773989和rs1044471位于基因ADIPOR2区域，rs321298位于基因CD3EAP区域，rs187116位于基因CD44区域，rs121964871、rs26160和rs17690554位于基因CDH1区域，rs1880481位于基因CTNNB1区域，rs2072454位于基因EGFR区域，rs1799793位于基因ERCC2区域，rs11466306位于基因FAM136A区域，rs889312位于基因MAPK3K1区域，rs2279744位于基因MDM2区域，rs3732183和rs2303428位于基因MSH2区域，rs1801133位于基因MTHFR区域，rs4072037位于基因MUC1区域，rs4648068位于基因NFKB1区域，rs2274223位于基因PLCE1区域，rs2076167和rs3734254位于基因PPARD区域，rs13361707位于基因PRKAA1区域，rs2294008和rs2976392位于基因PSCA区域，rs1478604位于基因THBS1区域，rs11536889位于基因TLR4区域，rs9841504位于基因ZBTB20区域。
实施例2 检测胃癌易感性的试剂盒
一、试剂盒的制备：
1、设计和合成所述28个SNP位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物详见表1
表1待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物
2、试剂盒还包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、酶切反应缓冲液、去离子水。
二、试剂盒的检测方法：
1、DNA的提取
1.1口腔拭子DNA提取
1)将口腔拭子放在2ml离心管中，加入400μl PBS。
2)加入20μl QIAGEN Protease和400μlBuffer AL。立即涡旋15s混匀。为了保证有效的裂解，样品和Buffer AL必须立即并充分混合。
3)56℃孵育10min。短暂离心。
4)加入400μl乙醇(96-100％)到样品中，涡旋混匀。短暂离心以使管盖上无液体。
5)将液体转移至离心柱，8000rpm(6000×g)离心1min。
6)柱子放入新的2ml EP管，加500μl Buffer AW1，8000rpm离心1min，弃EP管和废液。
7)柱子放入新的2mlEP管，加500μl Buffer AW2，14000rpm(20,000×g)离心3min，丢弃EP管和废液。
8)将柱子放入新的2mlEP管，14000rpm空管离心1min，丢弃EP管。
9)将柱子放入新的1.5mlEP管，加120μl Buffer AE，室温孵育5min，8000rpm离心1min，-20℃保存。
1.2全血DNA提取
1)向1.5ml EP管中加入20μl QIAGEN Protease。
2)向管中加200μl全血样品。注：先加入酶的目的是保证酶与血液的混匀。
3)加200μl Buffer AL，涡旋混匀15s。
4)56℃孵育10min，短暂离心。注：延长孵育时间不能增加产量或提高质量。
5)加入200μl无水乙醇，涡旋15s后，短暂离心以使管盖上无液体。
6)继续口腔拭子5～10步骤。
2、PCR扩增
2.1在一个新的1.5mlEP管中配制PCR扩增反应体系，见表2
表2 PCR扩增反应体系
以上试剂混匀后每孔各加2μl。
2.2每孔依次加入DNA 10ng/ul 1μl，0.25uM Primer Mix 2μl，总体积5μl。
2.3在兼容96孔板的PCR仪上设定PCR反应条件为：94℃4min，94℃20s，56℃30min，72℃1min，45个循环；72℃3min；4℃保持。将96孔PCR反应板放置于PCR仪上，启动PCR反应。
3、PCR产物碱性磷酸酶处理
3.1在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
3.2配制碱性磷酸酶处理反应体系，见表3
表3碱性磷酸酶处理反应体系
以上试剂混匀后每孔加2μl。
3.3在兼容96孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：37℃40min；85℃5min；4℃保持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
4单碱基延伸
4.1在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应。
4.2配制单碱基延伸反应体系，见表4
表4单碱基延伸反应体系
以上试剂混匀后每孔加1.06μl
4.3每孔加入iPLEX Extend Primer Mix0.94μl，总体积9μl。
4.4在兼容96孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：94℃30s，94℃5s，52℃5s，80℃5s；52℃5s，80℃5s4个循环；94℃5s，52℃5s，80℃5s 39个循环；72℃3min；4℃维持。启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
5、树脂纯化
5.1将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
5.2加16μl水到延伸产物的对应孔内；
5.3将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转15min，使树脂与反应物充分接触；
5.4 3000rpm 5min离心使树脂沉入孔底部。
6、芯片点样
启动MassARRAY NanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至96孔固体支持物上，制作出芯片。
7、质谱检测
将芯片使用MALDI-TOF(matrix-assistedlaser desorption/ionization-time offlight)，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用TYPER4.0软件(Sequenom)分型并输出结果，分析受试者胃癌发生风险，以实现对疾病的早期评估。
实施例3 与胃癌密切相关的28个SNP位点引用的文献，见表5
表5与胃癌密切相关的28个SNP位点引用的文献
实施例4 根据实施例3中引用的文献得出28个SNP位点与胃癌的关联，见表6
表6 28个SNP位点与胃癌的关联分析结果
实施例5 28个SNP位点的验证
采用上述实施例2中试剂盒的质谱检测方法分析28个SNP位点，检测结果使用TYPER4.0软件(Sequenom)分型并输出结果，其OR值与实施例4中表6的28个SNP位点与胃癌的关联分析结果相同，说明该28个位点具有较高的实用性，可用于胃癌的早期评估和大规模筛查，由于质谱分析技术具有检出成功率高、技术重现性好、性价比高，因此本发明采用的是质谱检测分析该21个位点检出成功率高、技术重现性好、性价比高，为胃癌的患病风险评估、诊断参考提供重要依据，以实现对胃癌疾病的早期评估。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市核子基因科技有限公司
<120> 一种用于检测胃癌易感性的试剂盒及其SNP标志物
<130>
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg ccactctaac cttcagcatc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg tctgaagcct aatcctgctc 30
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacaaccagg atgcct 16
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg aaagcagcaa gaaccaaacg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg ctgtctgcca ttgtttctgc 30
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agaaccaaac gactcatt 18
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg ttgggaatat ggcaagggtc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg ccaccttttg ctggagattg 30
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcctcagtta ttttcctcc 19
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg cactgaattc agagtctggg 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg tttagttcct cagtttcccg 30
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggacaagaag cggaag 16
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg tttcgcaaga accacttccc 30
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg gggataagag agtaactgc 29
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acctaaatcg aaggtgc 17
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgttggatg gaaagcacag cctgtcaaag 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgttggatg ctggacttac ttagcaaagc 30
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
actgcaaatt cctgccatt 19
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgttggatg acaggcaaac cacatcaagg 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acgttggatg ggacaaatta gccaagttag 30
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggtccttctc caactttc 18
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acgttggatg agattacagg catgagccac 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acgttggatg ccaccacatt tccagtcaag 30
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tccacgtttt gactga 16
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acgttggatg gctgtcattt ctcccataac 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acgttggatg cccgtgctta attcttagtc 30
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cccataacac tcattctaat tta 23
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgttggatg ttctcccaca gaaatcctgc 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgttggatg agtcactgct gactatgtcc 30
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ccctgcccta tgcaa 15
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
acgttggatg tgcgaggaga cgctatcag 29
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
acgttggatg ccatctggcc aaccccgtg 29
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
accctgcagc acttcgt 17
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
acgttggatg atcagtctgt cttctcgacc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
acgttggatg gactatgtgt ccaataatgc 30
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gtctcgacca gatttcaatt 20
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acgttggatg agatgatctc tgagatgccc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acgttggatg tatgggaagg agtcgttgag 30
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
atgcccctgc tggagaaagg 20
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
acgttggatg tcacactagt gacccgtcag 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
acgttggatg agttcagggt aaaggtcacg 30
<210> 42
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gacctcccgc gccg 14
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
acgttggatg ggtgttaaat ttaccaaccc 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
acgttggatg cattcacatc atgttagagc 30
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
caacccattt ccaagtc 17
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
acgttggatg ggtttagttg ccgtattggg 30
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
acgttggatg catcagtgta cagtttagga c 31
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gccgtattgg ggtgtata 18
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
acgttggatg tgcacgcctt cacaaagcag 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
acgttggatg cttgaaggag aaggtgtctg 30
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gctgcgtgat gacgaaatcg 20
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
acgttggatg gccgaaatct ccttttctcc 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
acgttggatg tttacagtta ccacagcccc 30
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tgcatgacca gaacc 15
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
acgttggatg gtcacacatt gcctaacaag 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
acgttggatg caatctccaa acaatgttag 30
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cgctaattgt tagagattcc a 21
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
acgttggatg tccacaactg caaaacgaag 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
acgttggatg tccatcgaaa caccctgaac 30
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
aagatcttcg aagtgaatg 19
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
acgttggatg ataccagagg ctgagaagag 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
acgttggatg tagatgtgct tggagaaggc 30
<210> 63
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
gggctgactg caaa 14
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
acgttggatg tgtatctagc tggctccacg 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
acgttggatg tggagcctgt aggtaaagtg 30
<210> 66
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
cccctgaaac tgcc 14
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
acgttggatg ccaagggcat tccaaatacc 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
acgttggatg ataagggaat ctgggaggag 30
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
aatacccatg agccac 16
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
acgttggatg tataaagtca cctgaggccc 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
acgttggatg atcaacaggg caagcagcac 30
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
acagcccacc agtgacca 18
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
acgttggatg atctttctgg ccatctgtcc 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
acgttggatg agatgctggg tgattgttgg 30
<210> 75
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
catctgtccg catct 15
<210> 76
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
acgttggatg ggagtagagg ttgctcctg 29
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
acgttggatg tttaaaagcg cgcggctcct 30
<210> 78
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
gctcctggag agcg 14
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
acgttggatg ctgtttcctg ttgggcaatg 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
acgttggatg accccattaa ttccagacac 30
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
atgaccacat tttgggaa 18
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
acgttggatg cattttgccc atacctctcc 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
acgttggatg tcactgttaa ggagcagttg 30
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
tccctttttc cctatatatt ttta 24