本发明属于生物技术与饲料行业领域，更具体地，涉及一种转化解脂耶氏酵母及其构建方法与应用。
背景技术：
：脂肪酶(lipase)是一类典型的羧酸水解酶，因能催化水解、酯化、转酯化等多种反应类型而广泛应用于食品、医药、能源、环境等领域，但脂肪酶在饲料方面的应用开发相对其它饲用酶仍处于起步阶段。绝大多数微生物脂肪酶为碱性脂肪酶，对动物肠胃的酸性pH与消化酶环境的耐受性低，在动物肠胃环境下难以发挥催化活力。以解脂耶氏酵母脂肪酶为代表的饲用脂肪酶具有耐受肠胃环境、生物安全性好、pH及温度性能优越等诸多饲用酶所需特点，具有很高的开发应用潜力。现有技术可利用生物载体等进行脂肪酶的单产，如阎金勇等利用毕赤酵母表达生产脂肪酶，如吴兰等利用解脂耶氏酵母生产胞外脂肪酶；然而其产量不高，脂肪酶产量低于1000U/ml，菌体的干重通常低于20g/L，蛋白质含量低于50％。现有技术通常采取物理化学工艺、或者发酵工艺的优化实现目标产物的产量的提高，然而仅能实现单目标产物的提高，且提高辐度有限。技术实现要素：针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种转化解脂耶氏酵母，其目的在于实现饲料用脂肪酶与单细胞蛋白的联产，以同时提高两种目标产物的含量。为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种转化解脂耶氏酵母，包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，用于实现饲料用脂肪酶与单细胞蛋白的联产。优选地，所述转化解脂耶氏酵母的蛋白质含量为60％～70％。优选地，在5％碳源的YPD液体培养基、装液量10％、转速250rpm、培养温度28℃、以及培养时间84h的培养条件下，所述转化解脂耶氏酵母的干重为32g/L～39g/L，饲料用脂肪酶的产量为3200U/ml～5900U/ml。按照本发明的另一方面，提供了一种上述转化解脂耶氏酵母的构建方法，包括以下步骤：(1)将饲料用脂肪酶基因连接至表达载体上，获得重组质粒；所述饲料用脂肪酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；(2)将重组质粒线性化，并转化解脂耶氏酵母的营养缺陷型感受态细胞；(3)筛选转化后的营养缺陷型感受态细胞，获得所述转化解脂耶氏酵母。优选地，所述表达载体为pINA1317载体或pINA1297载体。优选地，所述营养缺陷型为尿嘧啶营养缺陷型。作为进一步优选地，所述步骤(3)中的筛选方法为：利用无氨基酸培养基培养转化后的营养缺陷型感受态细胞。作为更进一步优选地，所述无氨基酸培养基为YNBD(Yeastnitrogenbase-glucose)无氨基酸固体培养基，其包括6g/L～8g/L酵母氮碱，10g/L～15g/L葡萄糖以及15g/L～20g/L琼脂，而不包括氨基酸。按照本发明的另一方面，还提供了一种上述转化解脂耶氏酵母在饲料用脂肪酶与单细胞蛋白的联产中的应用。优选地，所述应用的方法为：将所述转化解脂耶氏酵母在YPD液体培养基中20℃～30℃发酵12h～240h。优选地，所述YPD液体培养基包括2％～5％的碳源。作为进一步优选地，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、油酸、橄榄油、甘油或糖蜜。作为进一步优选地，所述发酵的条件为：将转化解脂耶氏酵母置于装液量10％～30％的培养瓶中，在200rpm～300rpm的转速下以摇床培养。总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：1、通过基因工程的方法，建立了饲料用脂肪酶的表达与单细胞蛋白的生产之间的协同促进关系，以大量表达的饲料用脂肪酶促进了转化解脂耶氏酵母对油脂碳源的利用，从而促进单细胞蛋白的生物合成，从而突破了两种目标产物之间的相互制约，最终实现两种目标产物(饲料用脂肪酶与单细胞蛋白)的高产；经验证，转化解脂耶氏酵母的蛋白质含量为60％～70％，转化解脂耶氏酵母菌体的干重为32g/L～39g/L，饲料用脂肪酶的产量可达3200U/ml～5900U/ml；2、本发明的转化解脂耶氏酵母能在一次发酵过程中获得两种目标产物，且该两种目标产物饲料用脂肪酶与单细胞蛋白可以同时作为饲料添加剂应用于饲料生产，减小了饲料生产的生产程序，降低了生产成本；本发明的生物安全性好，生产成本低，能耗低，条件温和等明显优势，极具农业应用前景；3、解脂耶氏酵母具备饲料用生物安全性，可以利用YPD液体培养基中的多种碳源进行发酵，节约了生产成本。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本发明提供了一种转化解脂耶氏酵母，包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，用于实现饲料用脂肪酶与单细胞蛋白的联产。上述转化解脂耶氏酵母的构建方法包括以下步骤：(1)将饲料用脂肪酶基因连接至pINA1317载体或pINA1297载体等表达载体上，获得重组质粒；所述饲料用脂肪酶基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；所述表达载体的基因序列包括启动子hp4d，信号肽XPR2pre，终止子XPR2t，以及筛选标记Ura3d1或Ura3d4；(2)将重组质粒线性化，生成由启动子、信号肽、SEQIDNO:1以及终止子终成的表达框，并转化解脂耶氏酵母Y.lipolytica的尿嘧啶营养缺陷型感受态细胞；(3)利用无氨基酸培养基培养转化后的营养缺陷型感受态细胞，筛选出转化成功的营养缺陷型感受态细胞，即获得所述转化解脂耶氏酵母；所述无氨基酸培养基可以采用YNBD(Yeastnitrogenbase-glucose)固体培养基，其包括6～8g/L酵母氮碱，10g/L～15g/L葡萄糖以及15g/L～20g/L琼脂，而不含氨基酸。上述转化解脂耶氏酵母直接在YPD液体培养基中20℃～30℃发酵12h～240h，即可实现饲料用脂肪酶与单细胞蛋白的联产；YPD液体培养基包括2％～5％的碳源；解脂耶氏酵母的生长条件非常广泛，碳源可利用葡萄糖、蔗糖、油酸、橄榄油、甘油或糖蜜等，甚至粗甘油等廉价碳源也可实现较好的发酵效果；发酵的条件优选为：培养瓶装液量10％～30％，摇床转速200rpm～300rpm。例如，在5％碳源的YPD液体培养基、装液量10％、转速250rpm、培养温度28℃、以及时间84h的培养条件下，所述转化解脂耶氏酵母的干重为32g/L～39g/L，饲料用脂肪酶的产量为3200U/ml～5900U/ml，蛋白质含量为60％～70％。实施例1(1)以来源于解脂耶氏酵母脂肪酶家族中的脂肪酶lip(具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列)为目标脂肪酶基因，以pINA1317为载体，通过酶切酶连构建重组质粒pINA1317-lip；(2)线性化所述得到重组质粒，由hp4d启动子，XPR2pre信号肽，lip基因与XPR2t终止子组成的表达框(hp4d-XPR2pre-lip-XPR2t)；将重组质粒转化ura缺陷型Y.lipolytica感受态细胞；(3)以Ura3d1为筛选标记，通过YNBD选择性培养基(6.7g/L不含氨基酸的酵母氮碱，10g/L葡萄糖，20g/L琼脂)筛选获得实施例1解脂耶氏酵母重组工程菌株。实施例2将实施例1获得的解脂耶氏酵母重组工程菌株在以5％糖蜜为碳源的培养基中发酵，摇瓶装液量10％，摇床转速250rpm，培养温度28℃，培养时间为84h，脂肪酶产量达到3200U/ml，菌体干重达到33g/L，菌体蛋白质含量达到61％。实施例3(1)以来源于解脂耶氏酵母脂肪酶家族中的脂肪酶lip(具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列)为目标脂肪酶基因，以pINA1297为载体，通过酶切酶连构建重组质粒pINA1297-lip；(2)线性化所述重组质粒得到由hp4d启动子，XPR2pre信号肽，lip基因与XPR2t终止子组成的表达框(hp4d-XPR2pre-lip-XPR2t)；将重组质粒转化ura缺陷型Y.lipolytica感受态细胞；(3)以Ura3d4为筛选标记，通过YNBD选择性培养基(6.7g/L不含氨基酸的酵母氮碱，10g/L葡萄糖，20g/L琼脂)筛选获得实施例3解脂耶氏酵母重组工程菌株。实施例4将实施例3获得的解脂耶氏酵母重组工程菌株在以5％糖蜜为碳源的培养基中发酵，摇瓶装液量10％，摇床转速250rpm，培养温度28℃，培养时间为84h，脂肪酶产量达到5900U/ml，菌体干重达到39g/L，菌体蛋白质含量达到60.6％。实施例5将实施例3获得的解脂耶氏酵母重组工程菌株在以5％粗甘油为碳源的培养基中发酵，摇瓶装液量10％，摇床转速250rpm，培养温度28℃，培养时间为84h，脂肪酶产量达到4500U/ml，菌体干重达到32g/L，菌体蛋白质含量达到62.6％。为对说明书内容进行简化，故将实施例6-实施例8的培养条件列至表1中，最后获得的脂肪酶产量和菌体干重与碳源比例、摇床转速、培养温度与培养时间正相关，与装液量负相关；而菌体蛋白质含量则与实施例2、实施例4与实施例5类似。表1实施例6-实施例8的培养条件培养条件实施例6实施例7实施例8碳源2％的蔗糖3％的蔗糖4％的粗甘油装液量10％20％30％摇床转速200rpm230rpm300rpm培养温度20℃28℃30℃培养时间12h24h240h本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>华中科技大学<120>一种转化解脂耶氏酵母及其构建方法与应用<130>无<160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>993<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaagaacctaaacatcctcctcacagcttcggctactctggcagcagctgtacccact60gccatctctccttctgaggctgcagtcctccagaagagagtcttcacttctaccgtgacc120actcccattgaccaggacgattacaacttctttcaaaagtatgcccgtcttgcaaacatt180ggatactgtgtcggtcctctgaccctgatcttcccgcccttcacctgtggtctgcagtgt240gcctacttccccaatgttgagctgatccaggagttcgacgatccacttctcctgtctgat300gtctccggatacctggctgtggaccacaactcgcagcaaatctacctggtgatccgagga360acccactctctggaggacgtcatcacagacctccgagtcacccaggctcctctcactaac420gttgatctcgctgctaacatctctgccactgccacttgcgaagactgccttgttcacagc480ggtttcatgcagtcctacaacgacaccttcaacctgattggcccgaagcttgactctgtc540attgctcagtaccccaactacgagattgccgtcacccgccactctctgggtggagctgcc600gccgtgctgttcggaatcaacctcaaggtcaacggtcacgatcccctcgttgtcactctc660ggacagcctattgctggaaacgctggcgttgccaactcggttgacacactcttctttggc720caggagaaccccgatgtctctaaggtgacccgtgaccgaaagctctaccgaatcacccac780cagggagatatcgtgcctcagattcccttctgggccggctaccagcactgctctggagaa840gtcttcatcgactggcctctgatcctccctcctctctccaccgtgctcatgtgtgaaggc900cagagcaactcccagtgttctgcaggcaacactctg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