植物体系表达人源化抗AGR2单克隆抗体18A4的质粒构建的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及植物表达体系表达人源化抗AGR2单克隆抗体18A4的质粒构建。
背景技术：
：AGR2是通过转录组和蛋白组筛选研究新发现的一种与多种腺癌发生发展和恶化相关的蛋白质。AnteriorGradientHomolog2(AGR2)蛋白最早是Aberger等人在研究非洲爪蟾神经发展中进行基因差异性表达筛选时发现，人AGR2是Thompson和Weigel在研究雌激素受体阳性乳腺癌的基因分化表达时发现的。多项研究发现，AGR2在大部分腺癌中均有过量表达，这些腺癌包括乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌，并且AGR2的过量表达与多种肿瘤表征有关，这些表征包括肿瘤生长、细胞性状转化、细胞迁移、转移和化药抗性。已有文献报导，AGR2蛋白可作为乳腺癌前期的检测指标，同时也成为了多种癌症中最具有潜力的靶点蛋白。18A4蛋白是将AGR2蛋白注射小鼠进行单克隆抗体实验后所获得的抗体之一。前期实验已验证18A4蛋白可有效的抑制多种肿瘤细胞的生长迁移等表征，并且我们实验室对此蛋白及其人源化蛋白已申请了国际专利。多项研究成果表明，18A4抗体可潜在成为靶向治疗肿瘤的生物药剂。因此，找到快速、大批量、低成本、安全有效且可规模化的生产人源化抗体18A4的实验方法刻不容缓。我们实验室前期采用CHO细胞生产人源化18A4蛋白，目前该细胞株及其作用已申请了中国专利。然而，近几年采用植物细胞生产重组蛋白渐渐形成了趋势。相对传统的表达人源化重组药用蛋白的其他体系，采用植物生产体系有着诸多优势，包括生产所需成本低、扩大规模快、不存在人的病原体和能够准确地折叠和组装复杂的蛋白质等。植物来源的亲和素与β-葡萄糖醛酸苷显示了其在商业应用上的成功，这些蛋白已经可以从Sigma公司以低于同种天然蛋白的价格获得。这也显示出，在植物上进行分子农场生产的产品具有和现有市场竞争的能力。经济而又安全的植物体系有朝一日可能会在生产药用蛋白方面优于其它蛋白生产体系，尤其是动物细胞培养体系。此外，第一支来自于植物的重组药用蛋白Elelyso用于治疗戈谢病已经被美国FDA批准进入商用过程，这是首个被FDA批准的基于植物细胞表达系统的药物，采用悬浮培养的胡萝卜细胞生产。它的成功展现出了采用植物体系作为人源化重组蛋白表达平台的巨大潜力。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗AGR2单克隆抗体植物表达载体及其应用。为了实现上述目的及其相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种T-DNA元件，所述T-DNA元件包括从5’端到3’端方向排列的抗体轻链克隆位点、IRES序列、抗体重链克隆位点。所述抗体轻链克隆位点用于插入抗体轻链序列。所述抗体重链克隆位点用于插入抗体重链序列。所述IRES序列如SEQIDNO.8所示，具体为：CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC。优选地，所述T-DNA元件包括从5’端到3’端方向排列的CPMV5’UTR序列、抗体轻链克隆位点、3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列、抗体重链克隆位点。所述抗体轻链克隆位点用于插入抗体轻链序列。所述抗体重链克隆位点用于插入抗体重链序列。优选地，所述CPMV5’UTR序列SEQIDNO.20所示，具体为：TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。优选地，所述3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列如SEQIDNO.23所示，具体为：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTCCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACATATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。本发明的第二方面，提供一种用于转染植物细胞的抗体表达载体，所述表达载体包括抗体基因表达单元，所述抗体基因表达单元包括从5’端到3’端方向排列的启动子序列、T-DNA元件序列和终止子序列。所述启动子用于启动目的基因的表达。启动子的类型与目的基因是否能表达及表达量息息相关。所述启动子优选CaMV35S启动子。所述启动子序列如SEQIDNO.5所示，具体为：TGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACA。优选地，所述T-DNA元件包括从5’端到3’端方向排列的抗体轻链克隆位点、IRES序列、抗体重链克隆位点。所述抗体轻链克隆位点用于插入抗体轻链序列。所述抗体重链克隆位点用于插入抗体重链序列。所述IRES序列如SEQIDNO.8所示，具体为：CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC。优选地，所述T-DNA元件包括从5’端到3’端方向排列的CPMV5’UTR序列、抗体轻链克隆位点、3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列、抗体重链克隆位点。所述抗体轻链克隆位点用于插入抗体轻链序列。所述抗体重链克隆位点用于插入抗体重链序列。优选地，所述CPMV5’UTR序列SEQIDNO.20所示，具体为：TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。优选地，所述3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV序列如SEQIDNO.23所示，具体为：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTCCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACATATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。所述终止子用于终止目的抗体基因的表达。所述终止子优选CaMV终止子。所述终止子序列如SEQIDNO.6所示，具体为：TTTCTCCATAAATAATGTGTGAGTAGTTTCCCGATAAGGGAAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCCAGATC。优选地，所述表达载体中还包括抗性基因。所述抗性基因用于表达载体所在宿主的筛选。例如，抗性基因可以是KanR，亦即卡那霉素抗性基因。优选地，所述表达载体中还包括选择性标记基因。所述选择性标记基因用于后期对于转染后的植物细胞的筛选。例如EGFP-puromycin。优选地，所述表达载体中还包括引物的结合位点。所示引物的结合位点用于PCR引物的结合或应用于表达载体的测序。优选地，所述表达载体是由pGreenII0800质粒改造获得。优选地，所述表达载体是在pGreenII0800质粒的左border位点和右border位点之间插入前述T-DNA元件，构建获得。本发明第三方面公开了前述表达载体的制备方法，可采用本领域技术人员公知的常规方法来制备。例如，所述方法包括步骤：在pGreenII0800质粒的左border位点和右border位点之间插入前述T-DNA元件，构建获得所述表达载体。本发明的第四方面提供了前述表达载体在植物体系表达人源抗体中的用途。本发明的第五方面，提供了一种人源抗体表达试剂盒，所述试剂盒包括用于转染植物细胞的双元载体，所述双元载体包括前述转染植物细胞的抗体表达载体和辅助质粒。优选地，所述辅助质粒是pSoup。本发明第六方面提供了一种表达人源抗体的方法，包括如下步骤：(1)重组载体构建：将抗体轻链序列和抗体重链序列分别插入至前述转染植物细胞的抗体表达载体的T-DNA元件中，构建获得重组载体；(2)转化与表达：将步骤(1)所得重组载体和辅助质粒转化感受态细胞，再将感受态细胞注射入植物叶子中，培养表达，获得人源抗体。优选地，所述感受态细胞为农杆菌。本发明一优选实施例中，所述农杆菌型号为GV3101。优选地，所述辅助质粒为pSoup。优选地，所述人源抗体为人源化抗AGR2单克隆抗体。进一步优选地，抗体轻链序列如SEQIDNO.7所示，具体为：ATGGACATGAGGGTTCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGAGATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACCTTATCTCTCTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCAAGAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGCCAGGCCCCCAGACTCCTCATCTATCTTGCATCTAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCTAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACACTCACCATCAGCAGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCTGTGTATTACTGTCAGCACATTAGAGAGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG。抗体重链序列如SEQIDNO.9所示，具体为：ATGGCCACAACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACTATGACACTACTAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACAATGACTGTGGACAAGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGATGATGGGATATGGTTCCCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGACACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG。本发明的第七方面，提供一种人源化抗体，由采用前述表达人源抗体的方法获得。优选地，所述人源化抗体为人源化抗AGR2单克隆抗体。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明可将目的基因有效转染至植物细胞中，并能够有效表达目的蛋白，且转染方法简单高效。附图说明图1：PCR反应所得18A4片段1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中1为1kbMarker，2、3列为延伸温度为65℃时的PCR产物，4、5列为延伸温度为70℃时的PCR产物。图2：PCR反应所得pGreenII0800片段1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中M为1kbMarker，1～6分别为梯度温度55.4、57.2、60.1、63.1、66.2、67.2℃对应的PCR产物。图3：质粒pGDS18A4OverlapPCR反应产物1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中1为1kbMarker，2为最终的OverlapPCR反应产物。图4：酶切鉴定反应1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中1为1kbMarker，2为质粒pGreenII0800(对照)，3为质粒18A4Hu(对照)，4～13为挑选的克隆酶切鉴定后的结果。图5：成功构建质粒pGDS18A41％琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中1为1kbMarker，2～8为所得最终质粒pGDS18A4。图6：使用SnapGeneViewer软件画出的pGDS18A4质粒结构示意图。图7：片段CAMV.CPMV，Tnos和3’UTR的PCR反应产物2％琼脂糖凝胶电泳检测示意图；其中1为5000bpMarker，2为片段CAMV.CPMV(904bp)，3为片段Tnos(252bp)，4为片段3’UTR(183bp)。图8：片段3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV5’UTR的PCR反应产物1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中1为1kbMarker，2为PCR反应产物条带。图9：质粒pGDS18A4cpmv.3I酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳检测示意图；其中M为1kbMarker；1和6为质粒pGDS18A被BglII和HindIIII酶消化后的结果，做为阴性对照；2～5为所挑选的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被BglII酶消化后的结果，7～10为所挑选的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被HindIII酶消化后的结果。图10：温室中按照正确的培养方法培养4-5周后的烟草示意图。图11：菌液注射至烟草叶子背面的操作示意图。图12：用构建的质粒转化到烟草叶子中3天后绿荧光的表达情况示意图，其中左图为初始质粒，右图为优化后的质粒转化至烟草叶子中的绿荧光表达情况。图13：人源化抗体18A4SDS-PAGE检测结果示意图；其中，1为蛋白Marker，2和3为没有转化过质粒的烟草叶子裂解液(作为阴性对照)，4为转化质粒pGDS18A4后烟草叶子裂解液，5～8为转化不同克隆质粒pGDS18A4cpmv3I后烟草叶子裂解液。图14：人源化抗体18A4westernblotting实验荧光二抗检测结果示意图；其中，1为人IgG蛋白(作为阳性对照)，2为蛋白Marker，3和4为未转化质粒的烟草叶子裂解液(作为阴性对照)，5为转化质粒pGDS18A4cpmv.3I后烟草叶子裂解液。具体实施方式在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。实施例1：植物体系表达人源化抗AGR2单克隆抗体18A4的质粒(pGDS18A4)的构建1.实验方法1)OverlapPCR反应的两对引物设计先使用PrimerPremier5软件对两部分片段分别在接口位置设计引物。再将两段引物拼接起来成为一条长的引物，那么这条长的引物就同时包含了18A4和pGreenII0800载体两部分片段。使用同样方法分别在两个接口位置设计两对长引物。引物序列见表1：表1overlapPCR反应的引物序列(primersequence)2)片段18A4的PCR反应片段18A4即为质粒pGDS18A4的T-DNA部分，此部分包含抗体的轻链、IRES1、抗体重链、IRES2和EGFP-puromycin融合蛋白，大小为4840bp。以p15-Agtuzumab表达载体为模板，表1中的18A4HuFN、18A4HuRN为引物进行PCR反应。PCR反应采用两步法，循环参数为98℃20s，95℃1min，70℃/65℃5.5min，25个循环，hold4℃。反应体系见表2：表2PCR反应各组分ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul10uMPrimerforward1.5ul10uMPrimerreverse1.5ulTemplateDNA(ng)5ngKODFX1ulddH2OTo50ul3)片段pGreenII0800载体部分的PCR反应片段pGreenII0800载体部分即为质粒pGDS18A4的载体部分。此部分包含了pSaORI、LeftBorderRepeat(LB)、CaMV35Spromoter、KanR、pUcORI、RightBorderRepeat(RB)、CaMVTerminator，大小为3198bp。以pGreenII0800质粒为模板，表1中的PG0800FN、PG0800RN为引物进行PCR反应。PCR反应采用两步法，循环参数为98℃20s，95℃1min，55-68℃3.3min，25个循环，hold4℃。本次PCR反应使用梯度温度，设定55.4、57.2、60.1、63.1、66.2、67.2℃6个梯度。反应体系与上一步片段18A4的PCR反应体系相同，见表2。4)片段18A4与片段pGreenII0800的overlapPCR反应将上述所得片段18A4与片段pGreenII0800以一定比例混合，再加入反应所需的酶，Buffer和dNTPs进行最终的OverlapPCR反应。反应的循环参数为98℃30s，72℃10min，15个循环，72℃20min。最终所得质粒pGDS18A4的大小应为8032bp。具体反应体系见表4。表4OverlapPCR反应各组分ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul片段18A41ug片段pGreenII08005ugKODFX1ulddH2OTo50ul5)质粒的转化、抽提、酶切鉴定及测序取上述所得OverlapPCR反应产物5ul加到50ul的感受态细胞(DH5α)中，轻轻摇匀，冰浴30min。42℃热激90s，快速转到冰浴2-3min，注意不要摇动管。向管中加入500ul的LB培养基，150rmp，37℃，摇45min。将菌液全部涂到含100ug/mlKanamycin的LB平板上。将平板正置直至液体全部吸收。倒置平板，于37℃培养16h。挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有卡那霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃，150rpm，摇床培养12～16h。使用北京索莱宝生物科技有限公司的质粒小抽试剂盒进行质粒抽提。所得最终质粒当中应含有三个BglII的酶切位点，故使用BglII酶对所得质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定体系见表5。表5质粒pGDS18A4酶切鉴定反应各组分最后将挑选酶切鉴定中获得的正确的质粒送公司测序进行最终的验证。2.实验结果PCR反应所得18A4片段1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。其中1为1kbMarker，2、3列为延伸温度为65℃时的PCR产物，4、5列为延伸温度为70℃时的PCR产物。从结果可得，延伸温度为65℃时不能得到18A4片段，将延伸温度提高至70℃时可得到大小正确的18A4片段，大小为4840bp。PCR反应所得pGreenII0800片段1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。其中1～6分别为梯度温度对应的PCR产物，结果可知此步PCR反应中温度对产物影响不大，6个梯度温度均能得到正确大小的pGreenII0800片段，大小为3198bp。OverlapPCR反应1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示。其中1为1kbMarker，2为最终的OverlapPCR反应产物，大小为8032bp。酶切鉴定结果1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示。最终的pGDS18A4质粒中含有三个BgLII的酶切位点，所切出来的片段大小应为4450bp、2495bp和2087bp。结果可知克隆5、20、24的酶切鉴定结果正确。将这三个克隆质粒进行测序。最后的测序结果显示，这三个克隆即为构建成功的pGDS18A4质粒，且不含有任何突变。成功获得pGDS18A4质粒。具体地，CaMV35Spromoter的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具体为：TGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACA。CaMVTerminator的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具体为：TTTCTCCATAAATAATGTGTGAGTAGTTTCCCGATAAGGGAAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCCAGATC。T-DNA部分，抗体轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，具体为：ATGGACATGAGGGTTCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGAGATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCCACCTTATCTCTCTCTCCAGGGGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCAAGAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGCCAGGCCCCCAGACTCCTCATCTATCTTGCATCTAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCTAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACACTCACCATCAGCAGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCTGTGTATTACTGTCAGCACATTAGAGAGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAACTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG。IRES1的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，具体为：CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC。抗体重链的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，具体为：ATGGCCACAACCATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACATGGACTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACTATGACACTACTAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACAATGACTGTGGACAAGTCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGATGATGGGATATGGTTCCCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGCACACTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGACACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAG。IRES2的核苷酸序列与IRES1的核苷酸序列相同。pGDS18A4质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测如图5所示。质粒大小为8032bp。使用SnapGeneViewer软件画出的pGDS18A4质粒结构如图6所示。实施例2：优化质粒pGDS18A4.CPMV.3I的构建1.实验方法CPMV(Cowpeamosaicvirus)是豇豆花叶病毒，此病毒为RNA病毒，由两条RNA链组成。其中RNA-2上的5’UTR和3’UTR可保护该病毒在侵入宿主细胞后RNA不被降解，从而达到提高RNA翻译、蛋白表达的效果。pGDS18A4.CPMV.3I的优化即为将初始质粒pGDS18A4中的IRES1替换为3’UTR、Tnos、CAMV-CPMV，并在轻链前插入CPMV5’UTR。本实施例中优化质粒的构建同样使用OverlapPCR反应。具体构建步骤如下：(1)片段3’UTR、Tnos、CAMV-CPMV、5’UTR的PCR反应先在NCBI网站上查到CPMV病毒的5’UTR、Tons、3’UTR的序列并合成出来。以合成出来的序列为模板进行PCR扩增反应。其中CAMV-CPMV5’UTR片段大小为904bp，3’UTR片段大小为183bp，Tnos片段大小为252bp。PCR反应的循环参数为98℃1min，95℃30s，55℃30s，68℃Xmin(1min/1kb)，20个循环，68℃10min。PCR反应所需引物序列见表6。表6片段3’UTR、Tnos、CAMV-CPMV5’UTR的PCR反应引物序列(2)质粒pGDS18A4.CPMV.3I的OverlapPCR反应反应所需的引物见表7，反应体系见表8。表7OverlapPCR反应引物序列(primer)表8OverlapPCR反应各组分ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul片段1ugvector片段5uginsertKODFX1ulddH2OTo50ul(3)转化、质粒抽提、酶切鉴定及测序本实施例质粒的转化及抽提步骤见质粒pGDS18A4的转化、抽提。质粒pGDS18A4cpmv3I含有4个BglII酶切位点，2个HindIII酶切位点，故用这两种酶对这种质粒进行酶切鉴定。酶切鉴定体系见表9。表9质粒pGDS18A4cpmv3I酶切鉴定反应各组分最后将挑选酶切鉴定中获得的正确的质粒送公司测序进行最终的验证。2.实验结果片段CAMV.CPMV，Tnos和3’UTR的PCR反应产物2％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图7所示。其中1为5000bpMarker，2为片段CAMV.CPMV(904bp)，3为片段Tnos(252bp)，4为片段3’UTR(183bp)。从琼脂糖凝胶电泳检测结果来看，PCR反应所得到的条带单一，说明PCR产物较纯，反应较好。片段3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV5’UTR的PCR反应产物1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图8所示。其中1为1kbMarker，2为PCR反应产物条带。条带单一，较纯，因此无需纯化，可直接用于下一步的OverlapPCR反应。质粒pGDS18A4cpmv.3I酶切鉴定1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图9所示。其中M为1kbMarker。1和6为质粒pGDS18A被BglII和HindIIII酶消化后的结果，做为阴性对照。2～5为所挑选的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被BglII酶消化后的结果，7～10为所挑选的克隆pGDS18A4cpmv.3I3A7，3A11，31K，31L被HindIII酶消化后的结果。质粒pGDS18A4cpmv.3I应有4个BglII的酶切位点，2个HindIII的酶切位点，故克隆31K，31L的酶切鉴定结果正确，进行下一步测序。将质粒pGDS18A4cpmv.3I31K，31L进行测序，测序结果与理论序列结果完全一致，即成功构建了优化质粒pGDS18A4cpmv.3I。具体地，CPMV5’UTR的核苷酸序列SEQIDNO.20所示，具体为：TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。3’UTR的核苷酸序列SEQIDNO.21所示，具体为：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATT。Tnos的核苷酸序列SEQIDNO.22所示，具体为：CCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTG。3’UTR+Tnos+CAMV-CPMV的核苷酸序列如SEQIDNO.23所示，具体为：TAACTCTGGTTTCATTAAATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTTGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTCCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACATATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAATTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCATGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAATGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGAA。实施例3：烟草叶子中人源化抗体18A4的表达1.实验方法1)烟草的培养：将烟草种子种进肥沃的土壤里，生长所需条件为温度24℃，湿度40％～65％，光照周期为14h光照/10黑暗(需在温室中进行培养)。当烟草长至4-5周后即可使用。注：烟草不可培养至过老，否则影响目标蛋白的表达。2)质粒pGDS18A4、pGDS18A4cpmv.3I转化至烟草叶子中的转化方法：本次实验采用的是农杆菌介导的转化，先将目标质粒转化至农杆菌中，再将农杆菌注射进烟草叶子中，由农杆菌浸染烟草叶子，从而达到最终转化的目的。而本次实验采用的农杆菌型号为GV3101，质粒载体pGreenII0800的辅助质粒为pSoup。具体操作步骤如下：各取5ul的2种目标质粒质粒分别加入含50ulGV3101农杆菌感受态细胞的1.5ml离心管中，再依次加入5ul质粒pSoup，混匀，置于冰上30min。将离心管转移至液氮中4min。然后37℃水浴4min。再向离心管中加入300ulLB培养基，30℃220rpm，摇3h。摇床期间准备4块含有利福平，四环素和卡那霉素的LB固体培养板，所需抗生素的终浓度分别为利福平100ug/ml，四环素15ug/ml，卡那霉素100ug/ml。摇床结束后，取离心管中300ul农杆菌培养液进行涂板。将平板倒置于培养箱中，28℃培养2-3天。培养板上会长出农杆菌的单克隆，用20ul的白色小枪头挑取单克隆后置于5ml含有上述3种抗生素的LB液体培养基中进行过夜摇床培养，条件为30℃，220rpm，16h。次日，将5ml农杆菌培养液进行离心，4000rpm，5min。弃上清。用MS培养基调菌液浓度，此步骤需要使用分光光度计，浓度调整至OD600nm为0.6。再加入0.5M的MES缓冲液和0.2uMAS(乙酰丁香酮)，混匀后黑暗室温静置3h。取上述液体使用1ml注射器注射至烟草叶子的背面，即完成烟草叶子转化的全过程。将烟草放置避光处培养2-3后，使用荧光显微镜检测烟草叶子中的绿荧光表达情况，拍照保存结果。3)Westernblotting检测烟草叶子中人源化抗体18A4的表达：样品的处理：剪取100mg烟草叶子，使用研磨仪对烟草叶子进行粉碎处理。向烟草粉末中加入200ul含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液和10％的蛋白上样缓冲液，混匀后，置于95℃水浴锅，5min，进行蛋白变性处理。蛋白胶的制备：人源化抗体18A4蛋白的大小约为150KDa，故需制备12％的蛋白胶。制备蛋白胶的过程详见《分子克隆实验指南-下册》1713页(蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。SDS-PAGE：将样品上样后，盖上盖子，启动电泳仪(浓缩胶80V，大约30min；分离胶120V)，启动后可看见两块胶中间会出现大量气泡，即说明已启动；注意如果两块胶中间的runningbuffer没有加满，则会发生短路。进入分离胶后，可看见marker的条带开始分离，但所需蛋白大小的条带在分离胶中明显可见、并与其他条带分开时，就可以停止电泳。转膜：打开盖子，将支架取出，倒掉缓冲液，去除固定架，将两块玻璃板分开后用刀片切去压缩胶的部分，在一个大皿中倒入1×blottingbuffer，将分离胶放入其中。裁减适当大小的6张滤纸(比胶大，比海绵层小都可以)，放入上述大皿中，使其浸湿。裁减同胶一样大的硝酸纤维素膜(用白色纸保护的)，放入上述大皿中，使其浸湿。将转移器材打开，黑色一面朝下，将海绵浸湿，覆盖在黑面上，俩手拿着一张滤纸的上沿将滤纸提起，从另一端起，慢慢将滤纸放在海绵上，注意两者之间不要产生气泡，如有气泡，用一根试管加点blottingbuffer，然后滚动着将气泡赶去，如上再放上两片滤纸，总共三层。之后，将胶以放滤纸的方法放在滤纸上，如果胶的边缘部分有些卷边，则可以用刀片切去一小部分。同样注意不要产生气泡。在胶的一个角上用铅笔做上标记，以表示其为正面，并说明膜的内容，双手提起膜，将做标记的一面向下，由下向上缓慢将膜覆盖在胶上，去除两者之间的气泡。同上述方法放上三张滤纸，盖上海绵，再将转移盒合上。将转移盒放入转移槽中，注意正负极方向，将blottingbuffer倒入其中，直至覆盖住胶和膜所在的位置。转膜条件为4℃(冰水浴)，300mA，0.5-1.5h。封闭：加封闭液(TNET中加5％脱脂奶粉，在磁力搅拌器上搅拌约1h，保证奶粉充分溶解)室温封闭1h(需置于摇床上，轻轻摇晃)。孵育抗体：本次实验使用的荧光二抗是goatanti-humanIgG800，将其溶于含有2.5％BSA的TNET中(1：20000稀释)。将已配制好的抗体倒入密封袋中，同时将上一步封闭好的膜转移至含有抗体的密封袋中，去除密封袋中的气泡。将密封袋置于摇床上，轻轻摇晃，室温孵育1h。蛋白膜的检测：使用扫膜仪进行扫膜，保存结果图片。2.实验结果按照正确的培养方法培养4-5周后的烟草如图10所示，其叶子大小适中。将菌液注射至烟草叶子背面的操作如图11所示，注意注射时候不可太用力，以免造成对烟草叶子的损伤。所构建的2种质粒转化到烟草叶子中3天后绿荧光的表达情况如图12所示。其中左图为初始质粒，右图为优化后的质粒。由结果可知，初始质粒的绿荧光表达量较低，而优化后的质粒pGDS18A4.cpmv3I的绿荧光表达量明显提高。人源化抗体18A4SDS-PAGE检测结果如图13所示。其中，1为蛋白Marker，2和3为没有转化过质粒的烟草叶子裂解液(作为阴性对照)，4为转化质粒pGDS18A4后烟草叶子裂解液，6～9为转化不用克隆质粒pGDS18A4cpmv3I后烟草叶子裂解液。由结果可以看出，优化后质粒pGDS18A4cpmv3I的抗体蛋白表达量明显提高。人源化抗体18A4westernblotting实验荧光二抗检测结果如图14所示。其中，1为人IgG蛋白(作为阳性对照)，2为蛋白Marker，3和4为未转化质粒的烟草叶子裂解液(作为阴性对照)，5为转化质粒pGDS18A4cpmv.3I后烟草叶子裂解液。由结果可知，质粒pGDS18A4cpmv.3I能明显看到人源化抗体18A4的轻链和重链的表达条带。且优化质粒pGDS18A4cpmv.3I的抗体蛋白表达量明显提高。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。SEQUENCELISTING<110>上海交通大学<120>植物体系表达人源化抗AGR2单克隆抗体18A4的质粒构建<130>165020<160>25<170>PatentInversion3.3<210>1<211>46<212>DNA<213>Artificial<220><223>18A4HuFN<400>1acagcccaagctctagccaccatggacatgagggttcctgctcagc46<210>2<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>18A4HuRN<400>2cgaattctctagaattacacgcgtataatgtatgctatacgaagttattcag52<210>3<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>PG0800FN<400>3ctgaataacttcgtatagcatacattatacgcgtgtaattctagagaattcg52<210>4<211>46<212>DNA<213>Artificial<220><223>PG0800RN<400>4gctgagcaggaaccctcatgtccatggtggctagagcttgggctgt46<210>5<211>346<212>DNA<213>Artificial<220><223>CaMV35Spromoter<400>5tgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctat60ctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattg120cgataaaggaaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacc180cccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagt240ggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgca300agacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggaca346<210>6<211>177<212>DNA<213>Artificial<220><223>CaMVTerminator<400>6tttctccataaataatgtgtgagtagtttcccgataagggaaattagggttcttataggg60tttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatac120ttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatc177<210>7<211>723<212>DNA<213>Artificial<220><223>抗体轻链<400>7atggacatgagggttcctgctcagctcctgggactcctgctgctctggctcccaggtgcc60agatgtgagattgtgctgacacagtctcctgccaccttatctctctctccaggggagagg120gccaccctgagctgcagggccagcaagagtgtcagtacatctggctatagttatatgcac180tggtaccaacagaaaccaggccaggcccccagactcctcatctatcttgcatctaaccta240gaatctgggatccctgctagattcagtggcagtgggtctgggacagacttcacactcacc300atcagcaggctggaacctgaggacttcgctgtgtattactgtcagcacattagagagctt360cctcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatct420gtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc480ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctc540caatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagc600ctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaactctacgcctgc660gaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt720tag723<210>8<211>587<212>DNA<213>Artificial<220><223>IRES1<400>8cccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtg60tgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccg120gaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaagg180aatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagaca240aacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcct300ctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgcca360cgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaa420ggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggta480cacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacgg540ggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaacc587<210>9<211>1422<212>DNA<213>Artificial<220><223>抗体重链<400>9atggccacaaccatggactggacctggagcatccttttcttggtggcagcagcaacaggt60gcccactcccaggtccagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggagcttca120gtgaaggtttcctgcaaggcttctggatacacattcactgactacaacatggactgggtt180cgacaggcccctggacagggccttgagtggattggagatattaatcctaactatgacact240actagctacaaccagaagttccagggcagagtgacaatgactgtggacaagtccacgagc300acagcctacatggagctcagcagcctgagatctgaggacactgcagtctattactgtgca360agatcgatgatgggatatggttcccctatggactactggggtcaaggcacactggtcacc420gtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagc480acctctgggggcacagcagccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtg540acggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtccta600cagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggac660acccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaa720gttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactc780ctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcc840cggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag900ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag960cagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg1020aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa1080accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc1140cgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccc1200agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg1260cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaag1320agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac1380cactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag1422<210>10<211>54<212>DNA<213>Artificial<220><223>LC3UTRF<400>10gagcttcaacaggggagagtgttagtaactctggtttcattaaattttctttag54<210>11<211>51<212>DNA<213>Artificial<220><223>cp3utrtnosr<400>11gaacgatcggggaaattcgagctggaataaaattaaaatctttttgtgtcc51<210>12<211>51<212>DNA<213>Artificial<220><223>CP3UTRTnosF<400>12ggacacaaaaagattttaattttattccagctcgaatttccccgatcgttc51<210>13<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>TnosCAMVR<400>13ctttgacatttttggagtaggggtaccactgatagtttaattcccgatctag52<210>14<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>TnosCAMVF<400>14c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