本发明涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，特别涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的生物制备方法。
背景技术：
β-烟酰胺单核苷酸是一种近年来受到广泛研究和关注的保健品，也是用来合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I）的关键中间体。据报道β-烟酰胺单核苷酸在抗衰老（参见J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2016;62(4):272-276），治疗糖尿病（Cell Metab. 2011 Oct 5; 14(4): 528–536）等方面有巨大潜力，在日本和美国均有相关的保健品上市销售。
传统的β-烟酰胺单核苷酸生产方法是以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到（参见Chem. Commun. 1999, 729–730），得率低，产品纯度低，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重，其中三氯氧磷是比较危险的试剂。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是提供一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，该方法可以较低的成本、较短的周期生产出高纯度的β-烟酰胺单核苷酸产品，并且对环境污染相对传统方法大为减少。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，该方法以烟酰胺核糖为底物，在ATP等磷酸供体存在下，在烟酰胺核糖激酶和/或含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下反应生成β-烟酰胺单核苷酸。
优选地，本发明所用的烟酰胺核糖激酶来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
更优选地，烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列可以与序列表中的序列2具有至少80%的一致性。进一步地，烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列与序列表中的序列2具有至少90%的一致性。更进一步地，烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列与序列表中的序列2完全一致。
根据本发明，可以使所述反应在温度4℃~50℃以及pH 5.0~9.0的水相体系中进行。优选地，使所述反应在温度30℃~45℃以及pH 7.5~8.5的水相体系中进行。
更优选地，使反应在温度33℃下进行。
更优选地，使反应在pH 8.0下进行。
根据一个具体优选方面，使反应在pH 8.0的三乙醇胺缓冲液中进行。
根据本发明，所述的反应在含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下进行，所述的重组细胞可以且优选为微生物细胞，其中微生物可以且优选为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母等。
根据一个具体和优选方面，所述方法实施如下：将反应所用的全部原料加入到反应釜中，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应。反应完毕后，通过提纯处理即可获得达到使用要求的β-烟酰胺单核苷酸产品。一个具体的提纯方法是经包括树脂分离在内的后处理，按照该提纯方法，可获得纯度高达95%以上的β-烟酰胺单核苷酸产品。
本发明采用上述技术方案，相比现有技术具有如下优点：
本发明提供的酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法具有重要的应用价值。目前的化学方法产生的污染严重，所涉及的反应物在储存和使用时都有危险性。化学方法反应得到的产品杂质多，难于纯化。相比之下，采用本发明的酶法合成方法能够提供纯度更高的产品，对环境更友好，便于纯化，因而能更经济的用于保健品、医药等领域，而且将会进一步扩大其应用范围。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。
根据本发明，所用的烟酰胺核糖激酶可以酶冻干粉形式存在或存在于重组细胞中。
烟酰胺核糖激酶的获得方法如下：
利用分子克隆技术、基因工程技术获得烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌（或其它微生物菌）表达菌株，然后将重组大肠杆菌发酵，制备得到含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞，或者制备得到烟酰胺核糖激酶的冻干粉。
本发明所述的分子克隆技术和基因工程技术均是已知的。分子克隆技术可参见《分子克隆实验指南》第三版（J.沙姆布鲁克著,2005）。
采用基因工程技术构建本发明重组菌株的表达步骤如下：
（1）根据Genbank NM_001182967.1序列优化密码子后基因合成所需的基因片段，连入pET30a载体，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点；
（2）将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG诱导目的蛋白表达，得到烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌表达菌株。
利用含有烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌表达菌株制备含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞，或者烟酰胺核糖激酶的冻干粉的步骤如下：
以1%比例将含有烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌表达菌株接种到4ml液体LB培养基中，37 ℃振荡培养（200 rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50 ml液体LB培养基，37 ℃振荡培养（200 rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4 mM IPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000 rpm，10 min），用5 ml 20 mmol/L三乙醇胺缓冲液（pH8.0）重悬细胞，获得所述重组细胞，或进一步于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000 rpm，10 min），收集上清液冻干，获得所述冻干粉。
以下结合具体的实施例对本发明作更为详细的描述。
实施例1：制备含烟酰胺核糖激酶的重组大肠杆菌细胞
根据序列表中的序列1及序列2，基因合成烟酰胺核糖激酶基因片段，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，连入pET30a载体（苏州金唯智生物技术有限公司生产），转化BL21（DE3）菌株。
以1%比例将烟酰胺核糖激酶菌种接种到4 ml液体LB培养基，37 ℃振荡培养（200 rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50 ml液体LB培养基，37 ℃振荡培养（200 rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4 mM IPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000 rpm，10 min），用5 ml 20 mmol/L三乙醇胺缓冲液（pH8.0）重悬细胞，获得含烟酰胺核糖激酶的重组细胞用于催化。
实施例2：制备烟酰胺核糖激酶冻干粉
将实施例1中制得的烟酰胺核糖激酶的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000 rpm，10 min），收集上清液冻干，获得烟酰胺核糖激酶的冻干粉。
实施例3：以烟酰胺核糖为底物酶法合成β-烟酰胺单核苷酸
在本实施例中，按照实施例2方法制备的烟酰胺核糖激酶冻干粉被用于催化合成β-烟酰胺单核苷酸。
在反应体系中依次加入1 L 20 mmol/L三乙醇胺缓冲液（pH8.0）、终浓度18mM 烟酰胺核糖、终浓度20mM的ATP、终浓度20mM的MgCl2、烟酰胺核糖激酶冻干粉5 g混合均匀后置于33 ℃水浴，300 rpm搅拌反应24 h。反应结束后用高效液相色谱检测烟酰胺核糖转化率为90%以上。经离子交换树脂分离、冻干等后处理纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸 4.9g，纯度大于95%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州汉酶生物技术有限公司
<120> 一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 1
atgacgagca aaaaagtgat cctggtcgca ctgtccggtt gctcctctag cggcaaaacc 60
actattgcga aactgacggc gtcgctgttt accaaagcta ccctgattca tgaagacgac 120
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tctcgtaaag gctaccagac gctggactct ttctgggtag acccgccgta ctatttcgac 540
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actccgattg ctaaaccgct gtcctgggtt tgccaggaaa tcctgaaact gtgcaaagat 720
taa 723
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 2
Met Thr Ser Lys Lys Val Ile Leu Val Ala Leu Ser Gly Cys Ser Ser
1 5 10 15
Ser Gly Lys Thr Thr Ile Ala Lys Leu Thr Ala Ser Leu Phe Thr Lys
20 25 30
Ala Thr Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Tyr Lys His Asp Asn Glu Val
35 40 45
Pro Val Asp Ala Lys Tyr Asn Ile Gln Asn Trp Asp Ser Pro Glu Ala
50 55 60
Leu Asp Phe Lys Leu Phe Gly Lys Glu Leu Asp Val Ile Lys Gln Thr
65 70 75 80
Gly Lys Ile Ala Thr Lys Leu Ile His Asn Asn Asn Val Asp Asp Pro
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Phe Thr Lys Phe His Ile Asp Arg Gln Val Trp Asp Glu Leu Lys Ala
100 105 110
Lys Tyr Asp Ser Ile Asn Asp Asp Lys Tyr Glu Val Val Ile Val Asp
115 120 125
Gly Phe Met Ile Phe Asn Asn Thr Gly Ile Ser Lys Lys Phe Asp Leu
130 135 140
Lys Ile Leu Val Arg Ala Pro Tyr Glu Val Leu Lys Lys Arg Arg Ala
145 150 155 160
Ser Arg Lys Gly Tyr Gln Thr Leu Asp Ser Phe Trp Val Asp Pro Pro
165 170 175
Tyr Tyr Phe Asp Glu Phe Val Tyr Glu Ser Tyr Arg Ala Asn His Ala
180 185 190
Gln Leu Phe Val Asn Gly Asp Val Glu Gly Leu Leu Asp Pro Arg Lys
195 200 205
Ser Lys Asn Ile Lys Glu Phe Ile Asn Asp Asp Asp Thr Pro Ile Ala
210 215 220
Lys Pro Leu Ser Trp Val Cys Gln Glu Ile Leu Lys Leu Cys Lys Asp
225 230 235 240
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州汉酶生物技术有限公司
<120> 一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法
<130> 2010
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 1
atgacgagca aaaaagtgat cctggtcgca ctgtccggtt gctcctctag cggcaaaacc 60
actattgcga aactgacggc gtcgctgttt accaaagcta ccctgattca tgaagacgac 120
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taa 723
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 2
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