技术实现要素：
本发明涉及用于使用耐热性芽孢杆菌属(bacillus)细菌发酵来生产乳酸或其盐的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养耐热性芽孢杆菌属细菌以获得菌种培养物；
(b)通过在好氧条件下将从步骤(a)获得的菌种培养物接种到含有初始碳源的发酵罐中来增加细菌的细胞数量；
(c)在发酵罐中在微氧条件下发酵从步骤(b)获得的菌种培养物，以获得乳酸或其盐；
其中步骤(b)包括在彼此独立的任一种以下条件下添加碳源至少一次，以增加碳源的浓度：
-当发酵罐中碳源的浓度降低至与初始浓度相比50％或以下时；
-当步骤(b)进行至少三分之一的时间时；
-当发酵罐中细菌细胞的光密度(od)增加至少10倍时。
本发明属于生物技术领域，涉及发酵方法和可产生乳酸的细菌。
背景技术：
众所周知，乳酸广泛用于塑料业、食品以及药品业和化妆品业。对于塑料业，乳酸被广泛使用，特别是用于生产聚酯，比如聚乳酸或聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)。由乳酸生产的聚合物具有可生物降解和生物相容的优点。所述聚合物可用于许多应用中，比如纺织品中的纤维、膜、肠线包装和医疗中的支架。
目前，有几种乳酸的生产方法，比如化学合成和生物技术。生物技术有几个优点，包括利用用于微生物发酵的可再生资源，比如木薯、玉米、小麦或甘蔗(cane)。此外，微生物发酵可以产生高光学纯度的乳酸。
大多数乳酸生产是糖(比如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖)或其他碳水化合物(比如淀粉或纤维素)的发酵，其中可以产生乳酸的微生物既可以是细菌和真菌两者。
众所周知，乳杆菌属(lactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)和链球菌属(streptococcus)的细菌在厌氧条件下由糖产生乳酸，导致能量节约并提供比真菌产生的产率更高的产率。然而，所述细菌属为苟养细菌，其需要维生素和必需氨基酸用于它们的生长。此外，所述细菌属不能产生将淀粉转化为糖的酶，其需要在发酵前将淀粉转化为糖的预处理步骤。这增加了生产成本。
由乳酸生产聚合物的一个问题是生产成本高。有必要开发生产成本较低、产率高、和生产力高的乳酸生产方法。此外，为了产生具有高速生长和增殖能力的健壮的微生物，有几种开发微生物和培养步骤的尝试。
降低乳酸生产成本的一个尝试是减少生产步骤，比如在乳酸生产中使用耐热性芽孢杆菌属细菌。这是因为通常乳酸生产的原料要求在发酵之前的预处理过程。可以使用几种预处理，包括机械处理、热处理、化学处理或酶处理，取决于这样的碳源的物理、化学和营养性质。所述预处理过程一般在约50℃至约100℃的范围内的高温下进行。一般的细菌不能在所述温度下生长。因此，在乳酸生产中在使用这样的碳源之前，需要额外的步骤将温度降低至室温。这导致生产过程的复杂性和较高的生产成本。
因此，如在ouyang等(appl.biochem.biotechnol.,2012,168,2387-2397)、wang等(bioresour.technol.,2011,102,8152–8158)和us8119376中公开的，使用比如凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、产酸芽孢杆菌(bacillusacidiproducens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)和地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)的耐热性芽孢杆菌属细菌的乳酸的生产方法已经有了进展。然而，发现所述文献中公开的乳酸生产导致低生产力和产率，这是工业规模生产乳酸的限制。
降低乳酸生产成本的一个尝试是消除从发酵获得的乳酸的纯化步骤。中和剂是重要的因素之一。一般地，用于生产乳酸的碳酸钙(caco3)产生乳酸钙作为副产物。因此，进一步需要酸化步骤来通过使用酸溶液(比如硫酸(h2so4))将乳酸钙转化为乳酸。这造成了生产方法的复杂性和高生产成本。此外，所述方法引起作为不期望的副产品的硫酸钙(caso4)，导致消除所述物质的问题，特别是在工业规模生产中。
us5002881和wo2006124633公开了在乳酸生产中在发酵期间使用氢氧化铵(nh4oh)作为中和剂。然而，氢氧化铵是挥发性化合物，其可能危害操作者的健康。另外，氢氧化铵是弱碱性的；因此需要大量使用以控制ph，导致分离和纯化步骤方面的困难。
ye等(bioresour.technol.,2013,132,38-44)、qin等(bioresour.technol.,2010,101,7570-7576)公开了在乳酸生产的发酵期间使用强碱性物质，比如氢氧化钠(naoh)和氢氧化钾(koh)。然而，发现所述碱性物质的使用对细菌细胞造成了负面影响，导致生产力和产率低。
由于上述原因，本发明的目的在于改进由发酵生产乳酸或其盐的方法，以提供高生产力和产率，其中所述方法可容易地进行并减少复杂的步骤。
具体实施方式
定义
除非另有说明，否则本文使用的技术术语或科学术语具有本领域普通技术人员所理解的定义。
这里提及的任何工具、设备、方法或化学品意为本领域技术人员通常操作或使用的工具、设备、方法或化学品，除非另有说明，否则它们是在本发明中具体使用的工具、设备、方法或化学品。
在权利要求书或说明书中单数名词或单数代词与“包括”一起使用是指“一个”以及“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。
在整个申请中，术语“约”用于表示在此呈现或示出的任何值可能会变化或产生偏差。这种变化或偏差可能是由于设备、方法或者来自个体操作者实施设备或方法的误差造成的。这些变化或偏差由物理性质的变化引起。
“微氧条件”意为在不进一步添加任何气体(包括空气或惰性气体)以排空现有空气的情况下空气已控制为有限的条件。
除非特别说明，否则“碳源的浓度”意为比如在特定时间发酵罐中的这样的系统中的碳源的浓度。
下文，示出本发明的实施方式而不旨在限制本发明的范围。
本发明涉及使用耐热性芽孢杆菌属细菌由发酵生产乳酸或其盐的方法。所述方法包括以下步骤：
(a)培养耐热性芽孢杆菌属细菌以获得菌种培养物；
(b)通过在好氧条件下将从步骤(a)获得的菌种培养物接种到含有初始碳源的发酵罐中来增加细菌的细胞数量；
(c)在发酵罐中在微氧条件下发酵从步骤(b)获得的菌种培养物，以获得乳酸或其盐；
其中步骤(b)包括在彼此独立的任一种以下条件下添加碳源至少一次，以增加碳源的浓度：
-当发酵罐中碳源的浓度降低至与初始浓度相比50％或以下时；
-当步骤(b)进行至少三分之一的时间时；
-当发酵罐中细菌细胞的光密度(od)增加至少10倍时。
在一个实施方式中，在任何以上条件下在步骤(b)中碳源的添加，将发酵罐中碳源的浓度增加至与初始浓度相比75％或以上。所述碳源的添加包括导致浓度大于初始浓度的添加。
优选地，碳源的添加在发酵罐中碳源的浓度降低至与初始浓度相比25％或以下的条件下进行。
优选地，碳源的添加在步骤(b)进行至少一半的时间下进行。
优选地，碳源的添加在发酵罐中的细菌细胞的光密度(od)增加至少10至50倍的条件下进行。
在一个实施方式中，步骤(b)中初始碳源的浓度可以在10g/l至20g/l的范围内，优选约15g/l。
在一个实施方式中，所述用于生产乳酸或其盐的方法可以在约45℃至约60℃的温度范围内进行，优选在约48℃至52℃的温度下进行。
在一个实施方式中，步骤(a)中的耐热性芽孢杆菌属可以选自嗜酸芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或这些细菌的混合物。
在一个实施方式中，步骤(a)中细菌细胞的初始光密度为约0.20至0.70，优选0.20至0.40。
在一个实施方式中，步骤(a)可以进行约2至5小时，优选约3至4小时。
在一个实施方式中，细菌培养基可以含有氮源，其可以选自酵母提取物、蛋白胨提取物、牛肉提取物和豆类提取物。
在一个实施方式中，细菌培养基和细菌细胞增加培养基可以含有无机氮源，其可以选自氯化铵、硝酸铵和磷酸二氢铵。用于氮源的所述无机化合物的使用有利于工业规模的乳酸生产，因为它们便宜、价格合理，并且可以进行质量控制。
在一个实施方式中，步骤(b)可以进行约2至5小时，优选约3至4小时，最优选约4小时。
在一个实施方式中，步骤(c)进一步包括添加碳源至少一次。
在一个实施方式中，步骤(c)中的碳源浓度可以在约100g/l至200g/l的范围内，优选约100g/l。
在一个实施方式中，使用碱性溶液控制步骤(c)以具有6至7的ph，优选使用碱性溶液以具有6.5的ph。
在一个实施方式中，碱性溶液可以选自氢氧化钠(naoh)、氢氧化铵(nh4oh)、氢氧化钾(koh)或其混合物，优选氢氧化钠或氢氧化钾，最优选氢氧化钠。
在一个实施方式中，用于生产乳酸或其盐的碳源是可发酵糖。
可发酵糖是可以在自然界中发现的任何糖或者源自包括糖的物质的任何糖。所述糖可以是修饰的或未修饰的。
可发酵糖可以选自但不限于单糖、二糖、三糖或其混合物。
在一个实施方式中，单糖可以选自葡萄糖、果糖、半乳糖或其混合物。
在一个实施方式中，二糖可以选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖或其混合物。
在一个实施方式中，三糖可以选自棉子糖、异麦芽三糖、麦芽三糖、黑曲霉三糖、蔗果三糖或其混合物。
优选地，可发酵糖是葡萄糖。
在一个实施方式中，步骤(b)和/或步骤(c)中的发酵罐进一步包括混合器。
在一个实施方式中，混合器具有约150rpm至450rpm的范围内的速度，优选约300rpm的速度。
在一个实施方式中，发酵罐条件从步骤(b)中的好氧条件到步骤(c)中的微氧条件的改变可以通过以下进行：停止在发酵罐中通气以便来自步骤(b)的剩余空气已经被消耗，或者在步骤(c)中在发酵期间添加氮以替换空气。
在一个实施方式中，步骤(c)中的发酵可以分批、半分批或连续进行。
在另一个实施方式中，所述乳酸或其盐的生产可以进一步包括分离和纯化从步骤(c)获得的混合物的步骤。
分离和纯化可以选自但不限于离心、过滤、膜过滤、絮凝、萃取、蒸馏、结晶、过滤、离子交换树脂或电渗析。
以下是根据本发明的性能测试，其中测试中使用的方法和设备是通常使用的方法，并不意在限制本发明的范围。
使用配备有biorad，aminexhpx-87h离子排斥有机酸(300mm×7.8mm)的shimadzu在45℃左右的温度下通过高效液相色谱，和用于检测与标准信号相比较的信号的示差折光检测器shimadzu-rid-10a分析葡萄糖和乳酸。
通过分光光度法在波长600nm处分析培养和发酵期间细菌的光密度(od)。
通过发酵期间产生的乳酸的量与使用的碳源的量的比率来计算产率。
每细菌细胞产生的乳酸的产率(yp/x)表示乳酸生产中细菌细胞的有效性，其是由产生的乳酸的量与发酵步骤后和增加细菌细胞步骤后细菌光密度之差的比率计算出的。
给出以下实施例来说明本发明，而不限制本发明的范围。
在以下实施例中，除非特别说明，用于培养细菌和增加细菌细胞的培养基具有如下组成(每升)：10g葡萄糖、15g酵母提取物、4g氯化铵(nh4cl)、5g氢氧化钙(ca(oh)2)和20ml盐水溶液。
在增加细菌细胞的步骤中多次添加碳源
为了研究在增加细菌细胞的步骤中多次添加碳源对乳酸或其盐产生的影响，使用在增加细菌细胞的步骤中不添加碳源的样品与根据本发明的乳酸生产进行比较。
对比例(在增加细菌细胞的步骤中不添加碳源)
通过在含有细菌培养基的烧瓶中加入耐热性芽孢杆菌属来进行细菌的培养，其中细菌的初始浓度为约1体积％，并且初始光密度为约0.30～0.40。样品在约50℃的温度下以约250rpm离心3小时以获得菌种培养物。然后，通过在5l发酵罐中加入菌种培养物来增加细菌细胞，该发酵罐含有初始葡萄糖浓度为约15g/l的约2.5l培养基和用来控制ph为约6.5的氢氧化钙(ca(oh)2)。增加细菌细胞的步骤在1vvm通气和300rpm混合下在约50℃的温度下进行约3小时。然后，停止通气，并且将约1l的350g/l的葡萄糖溶液加入到发酵罐中以便在发酵步骤开始时达到100g/l的初始葡萄糖浓度。通过使用表1中的各种碱性溶液来控制ph为约6.5，在约50℃的温度和约300rpm的混合速度下在微氧条件下操作发酵。进行发酵直到没有检测到葡萄糖。然后，将产物以约10,000rpm离心约5分钟。分析所得产物在发酵期间产生的乳酸和细菌的光密度。
根据本发明的实施例
将耐热性芽孢杆菌属加入含有细菌培养基的烧瓶中，其中细菌初始浓度为约1体积％，并且初始光密度为约0.30～0.40。样品在约50℃的温度下以约250rpm离心3小时以获得菌种培养物。然后，通过在5l发酵罐中加入菌种培养物来增加细菌细胞，该发酵罐含有初始葡萄糖浓度为约15g/l的约2.5l培养基和用来控制ph为约6.5的氢氧化钙(ca(oh)2)。增加细菌细胞的步骤在1vvm通气和300rpm混合下在约50℃的温度下进行约2小时。然后，加入约0.5l的90g/l的葡萄糖溶液。另外操作该增加细菌细胞的步骤2小时。然后，通过使用表1中的各种碱性溶液来控制ph为约6.5，在约50℃的温度和约300rpm的混合速度下在微氧条件下进行发酵。进行发酵直到没有检测到葡萄糖。然后，将产物以约10,000rpm离心约5分钟。分析所得产物在发酵期间产生的乳酸和细菌的光密度。
由表1，当实施例a1、a2、a3分别与对比例1a、2a和3a(其为通过使用产酸芽孢杆菌菌株的乳酸生产)比较时，可以发现包括添加碳源至少一次的增加细菌细胞的步骤导致更高的yp/x、生产力和产率。此外，可以发现，根据本发明的乳酸生产可以使用氢氧化钠和氢氧化钾溶液(其为强酸)来控制发酵期间的ph，并且产生高乳酸产率。
此外，当实施例b1、b2、b3分别与对比例1b、2b和3b比较(其为通过使用凝结芽孢杆菌菌株的乳酸生产)时，可以观察到，在增加细菌细胞的步骤中添加碳源至少一次导致yp/x极大提高。这表明利用碳源的效率有所增加。
因此，关于以上结果，可以总结出如本发明的目标中所指示的，根据本发明的乳酸生产可以提高由耐热性芽孢杆菌属的乳酸生产效率，其可以容易地进行，并且可以减少复杂步骤。
表1：由耐热性芽孢杆菌属在各种条件下的乳酸菌生产
本发明的最佳方式
本发明的最佳方式如具体实施方式中所公开的。