本发明属于基因工程领域，主要是涉及一种在酵母菌中实现高准确率定点基因敲除的方法。
背景技术：
酵母菌是真菌界中的一类单细胞真核微生物的统称，目前已鉴定种有1500多个，约占已鉴定真菌种类数的1％左右。酵母菌细胞直径约2～6μm，长度5～30μm，有的则更长，个体形态有球状、卵圆、椭圆、柱状和香肠状等，在自然界分布广泛。多数酵母可以分离于富含糖类的环境中，比如一些水果表面、发酵谷物、植物分泌物、甚至昆虫体内。多数酵母喜欢在偏酸性的潮湿的含糖环境中生长，在有氧和无氧环境下都能生存，属于兼性厌氧菌。
酵母菌是人类文明史中被应用的最早的微生物，以酿酒酵母为代表的酵母菌在食品、医药、饲料等行业均有广泛应用。同时由于酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，因此酵母被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。自1996年酿酒酵母基因组测序工作完成以来，酵母菌作为模式生物被广泛采用，在遗传学、功能基因组学、蛋白质组学、细胞周期、信号转导、蛋白质加工以及遗传性疾病研究等方面发挥了巨大的作用。
定点基因敲除是酵母功能基因研究中常采用的技术手段，基于基因同源重组原理实现，在酵母功能基因研究中被广泛采用。目前在进行酵母定点基因敲除时，通常采用线型双链DNA作为外源DNA，其两个末端可为平端、短5’突出粘端(常见为4bp突出粘端)、或短3’突出粘端(常见为4bp突出粘端)。由于通常细胞中非同源重组效率远高于同源重组，因此在酵母中实现高准确率定点基因敲除并非易事。采用常见线型双链DNA进行同源基因克隆时，同源基因克隆准确率通常低于50％。以酿酒酵母BY4743菌株为例，当外源DNA为平端结构、同源序列长度为500bp时，同源基因克隆准确率为20％左右；当采用抑制非同源重组突变体BY4743Δyku70时，克隆准确率提高到40％左右。因此，如能建立新的高效方法，将定点基因敲除准确率提高到80％以上，则针对每个克隆试验随机挑选2-3个转化子即可有效获得目标基因克隆，筛选工作量将大幅降低。本发明针对高准确率定点基因敲除问题，公开一种新型DNA结构及其介导的高准确率酵母定点基因敲除方法。该方法可有效提高酵母定点基因敲除准确率，为酵母遗传学研究、功能基因研究及基因工程菌株培育提供高效技术手段。本发明设计关键创新点-“线型3’突出长粘端双链DNA”结构及其应用尚未见报道
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种在酵母菌中实现高准确率定点基因敲除的技术方法。酵母定点基因敲除基于基因同源重组原理，通过外源DNA在基因组中的定点插入实现定点基因敲除。在定点基因敲除过程中，外源DNA的3’单链末端对目标DNA区段的入侵是实现同源基因克隆的分子基础。当以平端或短粘端线型双链DNA为外源DNA时，进入细胞后需经胞内核酸酶处理形成3’端长单链末端，然后发生单链入侵，进而实现基因同源重组。由于外源DNA在细胞内形成3’端长单链末端的效率低下，导致定点基因敲除效率低下，进而导致定点基因敲除准确率低下。本发明在体外制备了携带3’端长单链末端的外源DNA，即“线型3’突出长粘端双链DNA”，解决了细胞内形成携带3’端长单链末端效率低下的问题，从而实现了高准确率定点基因敲除，具体表现为酵母中的高准确率定点基因敲除。
在酵母菌中实现高准确率定点基因敲除的方法，其特征在于，采用聚合酶链式反应或全基因合成的方法获得目标敲除基因上下游序列后，将上下游序列按与原基因相反方向连接，并插入到载体质粒上构建环状克隆载体，对环状克隆载体进行线性化处理得到线型双链DNA，将线型双链DNA经由5’→3’核酸外切酶处理，形成线型3’突出长粘端双链DNA后转化酵母菌细胞。
进一步地，所述线型3’突出长粘端双链DNA两端各携带1段与目标敲除基因上游或下游序列相同的同源序列。
所述同源序列的长度为100-1000bp，经核酸酶处理后3’端单链粘端长度为100-1000nt。
本发明中“线型3’突出长粘端双链DNA”的制备方法为：两端各携带长度为100-1000bp目标基因上游或下游同源序列的线型双链DNA，经5’→3’核酸外切酶消化处理后形成，酶用量为50-5000U/nmol线型双链DNA载体，处理温度25-60℃，处理时间为1min-1h。所述5’→3’核酸外切酶是T5核酸外切酶、T7核酸外切酶或λ核酸外切酶，也可以是任何具有5’→3’外切活性的核酸酶。
所述线型3’突出长粘端双链DNA的两个3’突出粘端的延伸方向均指向目标基因的编码区，即两个3’突出粘端相向而行共同指向目标敲除基因区段。
线型3’突出长粘端双链DNA转化酵母菌细胞的方法是电击介导法、聚乙二醇介导法、氯化锂介导法、醋酸锂介导法、或原生质体介导法，也可以是其他任何可以介导外源DNA进入酵母菌细胞的方法。
本发明将“线型3’突出长粘端双链DNA”进入酵母细胞后高准确率介导定点基因敲除，最终实现定点基因敲除准确率(即酵母菌转化子中正确克隆的百分比)，准确率达到45～92％。
本发明以“线型3’突出长粘端双链DNA”为核心创新点的高准确率酵母定点基因敲除方法，包括以下步骤：
第一步，目标敲除基因上下游序列克隆：采用聚合酶链式反应或全基因合成的方法获得。克隆序列为目标敲除基因的上游序列和下游序列，为便于陈述，上游序列称为“序列A”，下游序列称为“序列B”，二者长度均为100～1000bp。
第二步，环状克隆载体构建：将序列A和序列B按与原基因相反方向连接(即，反向插入)，并插入到载体质粒上，获得环状克隆载体，同时在序列A和B之间设计单酶切位点，便于后续线性化处理。
第三步，环状克隆载体线性化：以序列A和B之间单酶切限制性内切酶，对环状克隆载体进行线性化处理，参照说明书进行酶切过夜，确保酶切彻底，并用回收试剂盒对酶切产物进行回收。可采用凝胶电泳后回收目标片段，也可采用乙醇或异丙醇沉淀法，以及试剂盒回收法进行线性化质粒回收。
第四步，核酸外切酶处理形成“线型3’突出长粘端双链DNA”：将第三步回收酶切产物进行定量测定，并按照100ng/μL的浓度稀释到酶切反应缓冲液中，然后于冰浴上添加5’→3’核酸外切酶，酶用量为50-5000U/nmol线型双链DNA载体，处理温度25-60℃，处理时间为1min-1h。处理产物即为“线型3’突出长粘端双链DNA”。所述5’→3’核酸外切酶可以是T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶中任何一种，但不局限于上述几种，其他具有5’→3’外切活性的核酸酶均适用。
第五步，“线型3’突出长粘端双链DNA”转化酵母菌细胞：根据不同酵母菌生理特性选择合适的转化方法，将“线型3’突出长粘端双链DNA”转入到酵母菌细胞中。酵母菌转化方法可以是菌落转化法、聚乙二醇介导转化、原生质体转化、氯化锂介导转化、醋酸锂介导转化、电击转化法等中任何一种，但不局限于上述几种，其他能将外源DNA导入酵母菌中的方法均适用。
第六步，转化子筛选与鉴定：挑取拟转化子，经放大培养后，提取基因组DNA进行PCR鉴定和DNA测序分析，最终获得正确定点基因敲除转化子。定点基因敲除准确率(即酵母菌转化子中正确克隆的百分比)可达到45～92％。
有益效果
本发明技术方法简便、易操作，配套试剂采购容易，能够在酵母菌中实现高准确率定点基因敲除，在提高酵母菌定点基因敲除工作效率，减少劳动力和物力支出等方面具有显著意义。
附图说明
图1外源DNA(“线型3’突出长粘端双链DNA”)结构示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本发明适用于已知的常见酵母菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、假丝酵母(Candida spp.)等，但不局限于上述酵母。为叙述实施例方便，本发明以酿酒酵母gim2.198菌株为例进行详细实施方式和具体操作过程介绍。酿酒酵母gim2.198，分类命名：酿酒酵母，拉丁学名：Saccharomyces cerevisiae，保藏号：gim2.198，基因敲除菌株，G418抗性阳性，尿嘧啶营养缺陷型，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。定点基因敲除载体采用酿酒酵母低拷贝质粒YCplac33(全长5603bp，携带ura3基因，可恢复尿嘧啶营养缺陷型)，由东华大学黄志伟博士馈赠。目标敲除基因为酿酒酵母必须基因tor2基因，两个同源片段(序列A和序列B)分别为tor2基因上游启动子附近区和下游终止子区域，在YCplac33上的插入位点为HindⅢ酶切位点。序列A和序列B之间连接点酶切位点设计为NotⅠ酶切位点。序列A和序列B的获取方式为PCR扩增克隆，序列A和序列B与YCplac33在HindⅢ酶切位点和NotⅠ酶切位点连接上采用诺唯赞多片段无缝克隆试剂盒“MultiS One Step Cloning Kit”完成。携带序列A和序列B的新载体命名为YCplac33-AB，YCplac33-AB经NotI酶切线性化后又经T5核酸外切酶处理形成的“线型3’突出长粘端双链DNA”命名为YCplac33-AB-T5。酿酒酵母转化方法为聚乙二醇(PEG)介导转化法。以SC-ura-固体平板为筛选培养基。转化子鉴定采用PCR扩增和DNA测序法进行。
具体实施例陈述如下：
实施例1
步骤1：tor2基因上游(序列A1)和下游(序列B1)各1000bp同源序列克隆。
采用聚合酶链式反应法(PCR)克隆，所用DNA聚合酶为NEB生产的高保真DNA聚合酶(Phusion DNA Polymerase)，扩增模板为酿酒酵母gim2.198基因组DNA，引物为根据酿酒酵母S228C序列设计合成的寡核苷酸,PPF1、PPR1、PTF1和PTR1，序列信息如下：
PPF1:5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC TTTTCATATGGGGAAAGTAA-3’
PPR1:5’-GAAGATGCGGCCGCTGTTAC AAGAAAGCGGAGGGAGAAGA-3’
PTF1:5’-GTAACAGCGGCCGCATCTTC CTCTTCCGCAATTCCAGCAG-3’
PTR1:5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG TTTTAATGTATTGAAAATCA-3’
引物PPF1和PPR1用于克隆tor2上游1kb区，PTF1和PTR1用于克隆tor2下游1kb区，PCR反应体系如下：
5×HF反应缓冲液(Mg2+浓度为7.5mM)10μL，ddH2O 31.5μL，dNTP mix(每种10mM)1.0μL，上游引物(10μM)2.5μL，下游引物(10μM)2.5μL，模板DNA(500ng/μL)2.0μL，Phusion DNA polymerase(DNA聚合酶,2U/μL)0.5μL。
PCR扩增条件为：(1)预变性98℃1min，(2)变性98℃10sec，(3)退火55℃20sec，(4)延伸72℃45sec，(5)最后延伸72℃7min，(6)反应结束4℃保持。
上述步骤(2)到(4)循环35次，反应终了即可获得分别含有tor2基因上游(序列A)和下游(序列B)的PCR产物，将PCR产物以AxyPrepTMPCR Cleanup Kit试剂盒纯化获得目标片段，调节浓度到20ng/μL，于-20℃下储存备用。
步骤2：携带序列A1和序列B1的环状克隆载体YCplac33-AB-1的构建。
将质粒YCplac33以限制性内切酶HindⅢ酶切过夜，并以AxyPrepTMPCR Cleanup Kit试剂盒纯化获得YCplac33酶切产物，调节浓度到50ng/μL，并于-20℃下冻存备用。采用诺唯赞多片段无缝克隆试剂盒“MultiS One Step Cloning Kit”进行序列A、序列B与YCplac33酶切产物的连接反应，插入方向与其在原基因组上方向相反(即，反向插入)。反应体系如下：
5×反应缓冲液4.0μL，ddH2O 11.0μL，YCplac33酶切产物(约50ng/μL)1.0μL，序列A1(约20ng/μL)1.0μL，序列B1(约20ng/μL)1.0μL，重组酶MultiS 2.0μL。
将上述组分混合均匀，于37℃下反应30min，反应完成后立即于冰水浴中冷却5min。取连接产物10μL与100μL大肠杆菌DH-5α化学法感受态细胞混合均匀，冰浴处理30min后，于42℃水浴热激90sec，然后加入900μL液体LB培养基(酵母抽提物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)在37℃下震荡培养45min(180转/min)，取200μL涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上(氨苄青霉素浓度为75μg/mL)，37℃下倒置培养过夜，最后挑取单克隆进行测序验证获得正确克隆YCplac33-AB-1，并冻存于-80℃。
步骤3：“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-1的制备。
提取正确克隆YCplac33-AB-1的质粒，并以限制性内切酶NotI，按1U/μg酶量37℃下酶切过夜。采用与步骤1相同的PCR cleanup回收试剂盒对酶切产物进行回收，并以T5核酸外切酶处理，以获得“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-1：酶反应缓冲液为配套的10×缓冲液，酶用量为1.15U/μg YCplac33-AB-1酶切产物(相当于5000U/nmolYCplac33-AB-1酶切产物)，处理温度为60℃，处理时间为24h，所得3’端单链粘端长度为100bp。该处理产物编号为YCplac33-AB-T5-1，可直接用于后续酵母转化。
步骤4：转化酿酒酵母。
(1)酵母感受态制备：用接种环蘸取-80℃冻存gim2.198菌种，涂布于YPDA培养基上，于28℃下培养48h，然后挑取1个单克隆于5.0mL液体YPDA培养基中30℃下180转/min震荡培养过夜。然后吸取0.5mL过夜培养菌种接种到25.0mL新鲜YPDA液体培养基中，于30℃下180转/min继续震荡4h。然后以2000×g离心力离心收集菌体，以25.0mL冰浴预冷的无菌超纯水(电阻为18.2MΩ)轻柔震荡重悬细胞。重复2000×g离心收集菌体，并以25.0mL浓度为0.1M的无菌醋酸锂溶液重悬细胞1次，将细胞悬液分装到24个无菌离心管中，于2000×g下离心收集菌体并置于冰上待用，即为酿酒酵母感受态细胞。
(2)外源DNA转化酵母感受态细胞：
向酿酒酵母感受态细胞中依次加入质量百分比浓度为50％的聚乙二醇(PEG3350)溶液，240μL；1mol/L醋酸锂溶液，36μL；鲑鱼精DNA(2mg/mL，100℃加热10min，然后于冰浴冷却2min后使用)，20μL；外源DNA YCplac33-AB-T5-1，14μL；ddH2O，50.0μL。混合均匀后于30℃下孵育30min，继续加入30μL分析纯二甲基亚砜并立即混合均匀，在42℃下孵育13min，然后于2000×g下离心30sec收集细胞，最后涂布到选择培养基SC-ura-上(无尿嘧啶SC培养基)，并于30℃下倒置培养2d获得再生克隆。
筛选培养基SC-ura-的配制方法为(1L)：无氨基氮源(含硫酸铵)6.7g，腺嘌呤硫酸盐0.02g，缬氨酸0.15g，异亮氨酸0.03g，精氨酸0.02g，组氨酸0.02g，亮氨酸0.1g，赖氨酸0.03g，甲硫氨酸0.02g，苯丙氨酸0.05g，苏氨酸0.02g，色氨酸0.02g，酪氨酸0.03g，天冬氨酸0.04g，丝氨酸0.04g，谷氨酸0.01g，葡萄糖20.0g，Fe(NH4)2(SO4)2 3μg，琼脂20.0g。121℃灭菌30min，葡萄糖单独灭菌后加入，丝氨酸、谷氨酸和Fe(NH4)2(SO4)2各自单独过滤灭菌。
步骤5：转化子鉴定。
(1)菌落PCR鉴定：随机挑取100个菌落进行PCR鉴定，聚合酶为EX Taq，引物为PF1和PR1通用引物，序列如下:
PF1:5’-TCGCAGTTGTTATCAGCCTCAGAC-3’和PR1:5’-CTGGAACAACTCTAGATGATAACAC-3’。
PCR反应体系如下：
10×EX Taq反应缓冲液(Mg2+浓度为7.5mM)5μL，ddH2O 26.5μL，dNTP mix(每种10mM)1.0μL，PF1引物(10μM)2.5μL，PR1引物(10μM)2.5μL，酵母菌落悬液2.0μL，EX Taq(DNA聚合酶,5U/μL)0.5μL。
PCR扩增条件为：预变性94℃5min，变性94℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃10min，最后延伸72℃10min，反应结束4℃保持。变性-退火-延伸循环25次，反应终了采用琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测。
(2)阳性转化子鉴定：将(1)中PCR鉴定阳性克隆的PCR产物进行DNA测序，测序表明为tor2序列缺失的菌株即为基因敲除菌株。
步骤6：获得定点基因敲除转化子，统计定点基因敲除准确率。
步骤5中测序结果表明携带YCplac33载体序列，缺失tor2基因编码区序列的克隆即为正确克隆。正确克隆数与100的比值即为基因敲除准确率。本实施例中基因敲除准确率为45％。实施例2
步骤1：tor2基因上游(序列A2)和下游(序列B2)各100bp同源序列克隆。
克隆方法同实施例1，引物为PPF2、PPR1、PTF1和PTR2，序列信息如下：
PPF1:5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC TTTTCATATGGGGAAAGTAA-3’
PPR2:5’-GAAGATGCGGCCGCTGTTAC AAAGGGAAAA TATACCGGGT-3’
PTF2:5’-GTAACAGCGGCCGCATCTTC GTAACGTCACGCTCGGAACT-3’
PTR1:5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG TTTTAATGTATTGAAAATCA-3’
引物PPF1和PPR2用于克隆tor2上游100bp区，PTF2和PTR1用于克隆tor2下游100bp区，PCR反应体系除引物PPR2替换PPR1，PPF2替换PPF1外，各相应组分用量同实施例1。PCR扩增条件除延伸时间改为20sec外，余皆同实施例1，PCR产物纯化方法同实施例1。
步骤2：携带序列A2和序列B2的环状克隆载体YCplac33-AB-2的构建。
质粒YCplac33的HindⅢ酶切反应及产物纯化方法同实施例1。序列A2、序列B2与YCplac33酶切产物的连接反应方法同实施例1，最后获得正确克隆YCplac33-AB-2(A2和B2的插入方向均为反向插入)，并冻存于-80℃。
步骤3：“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-2的制备。
提取正确克隆YCplac33-AB-2的质粒，并进行NotI，酶切方法同实施例1。采用与步骤1相同的PCR cleanup回收试剂盒对酶切产物进行回收，并以T5核酸外切酶处理，以获得“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-2：酶反应缓冲液为配套的10×缓冲液，酶用量为0.01U/μg YCplac33-AB-2酶切产物(相当于50U/nmol YCplac33-AB-2酶切产物)，处理温度为25℃，处理时间为1min，所得3’端单链粘端长度为100bp。该处理产物编号为YCplac33-AB-T5-2，可直接用于后续酵母转化。
步骤4：转化酿酒酵母。
(1)酵母感受态制备：同实施例1。
(2)外源DNA转化酵母感受态细胞：除外源DNA替换为YCplac33-AB-T5-2外，其余操作均与实施例1相同。
步骤5：转化子鉴定。
(1)菌落PCR鉴定：鉴定方法同实施例1。
(2)阳性转化子鉴定：同实施例1。
步骤6：获得同源克隆转化子，统计同源基因克隆准确率。
步骤5中测序结果表明携带YCplac33载体序列，缺失tor2基因编码区序列的克隆即为正确克隆。正确克隆数与100的比值即为基因敲除准确率。本实施例中基因敲除准确率为64％。实施例3
步骤1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同实施例1，引物为PPF3、PPR1、PTF1和PTR3，序列信息如下：
PPF1:5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC TTTTCATATGGGGAAAGTAA-3’
PPR3:5’-GAAGATGCGGCCGCTGTTAC TATATATTTA TTACCGTCAT-3’
PTF3:5’-GTAACAGCGGCCGCATCTTC CGGTAACAGGACAACAGCCA-3’
PTR1:5’-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG TTTTAATGTATTGAAAATCA-3’
引物PPF1和PPR3用于克隆tor2上游500bp区，PTF3和PTR1用于克隆tor2下游500bp区，PCR反应体系除引物PPR3替换PPR1，PPF3替换PPF1外，各相应组分用量同实施例1。PCR扩增条件除延伸时间改为30sec外，余皆同实施例1，PCR产物纯化方法同实施例1。
步骤2：携带序列A3和序列B3的环状克隆载体YCplac33-AB-3的构建。
质粒YCplac33的HindⅢ酶切反应及产物纯化方法同实施例1。序列A3、序列B3与YCplac33酶切产物的连接反应方法同实施例1，最后获得正确克隆YCplac33-AB-3(A3和B3均为反向插入)，并冻存于-80℃。
步骤3：“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-3的制备。
提取正确克隆YCplac33-AB-3的质粒，并进行NotI，酶切方法同实施例1。采用与步骤1相同的PCR cleanup回收试剂盒对酶切产物进行回收，并以T5核酸外切酶处理，以获得“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-3：酶反应缓冲液为配套的10×缓冲液，酶用量为0.5U/μg YCplac33-AB-3酶切产物(相当于2500U/nmol YCplac33-AB-3酶切产物)，处理温度为42.5℃，处理时间为30min，所得3’端单链粘端长度为1000bp。该处理产物编号为YCplac33-AB-T5-3，可直接用于后续酵母转化。
步骤4：转化酿酒酵母。
(1)酵母感受态制备：同实施例1。
(2)外源DNA转化酵母感受态细胞：除外源DNA替换为YCplac33-AB-T5-3外，其余操作均与实施例1相同。
步骤5：转化子鉴定。
(1)菌落PCR鉴定：鉴定方法同实施例1。
(2)阳性转化子鉴定：同实施例1。
步骤6：获得同源克隆转化子，统计同源基因克隆准确率。
步骤5中测序结果表明携带YCplac33载体序列，缺失tor2基因编码区序列的克隆即为正确克隆。正确克隆数与100的比值即为基因敲除准确率。本实施例中基因敲除准确率为89％。
实施例4
步骤1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同实施例3。
步骤2：携带序列A3和序列B3的环状克隆载体YCplac33-AB-4的构建。
质粒YCplac33的HindⅢ酶切反应及产物纯化方法同实施例1。序列A3、序列B3与YCplac33酶切产物的连接反应方法同实施例3，最后获得正确克隆YCplac33-AB-4，并冻存于-80℃。
步骤3：“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-4的制备。
提取正确克隆YCplac33-AB-4的质粒，并进行NotI，酶切方法同实施例1。采用与步骤1相同的PCR cleanup回收试剂盒对酶切产物进行回收，并以T5核酸外切酶处理，以获得“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-4：酶反应缓冲液为配套的10×缓冲液，酶用量为0.8U/μg YCplac33-AB-4酶切产物(相当于400U/nmol YCplac33-AB-4酶切产物)，处理温度为50℃，处理时间为10min，所得3’端单链粘端长度为450bp。该处理产物编号为YCplac33-AB-T5-4，可直接用于后续酵母转化。
步骤4：转化酿酒酵母。
(1)酵母感受态制备：同实施例1。
(2)外源DNA转化酵母感受态细胞：除外源DNA替换为YCplac33-AB-T5-4外，其余操作均与实施例1相同。
步骤5：转化子鉴定。
(1)菌落PCR鉴定：鉴定方法同实施例1。
(2)阳性转化子鉴定：同实施例1。
步骤6：获得同源克隆转化子，统计同源基因克隆准确率。
步骤5中测序结果表明携带YCplac33载体序列，缺失tor2基因编码区序列的克隆即为正确克隆。正确克隆数与94的比值即为基因敲除准确率。本实施例中基因敲除准确率为92％。实施例5
步骤1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同实施例3。
步骤2：携带序列A3和序列B3的环状克隆载体YCplac33-AB-5的构建。
质粒YCplac33的HindⅢ酶切反应及产物纯化方法同实施例1。序列A3、序列B3与YCplac33酶切产物的连接反应方法同实施例3，最后获得正确克隆YCplac33-AB-5，并冻存于-80℃。
步骤3：“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-5的制备。
提取正确克隆YCplac33-AB-4的质粒，并进行NotI，酶切方法同实施例1。采用与步骤1相同的PCR cleanup回收试剂盒对酶切产物进行回收，并以T5核酸外切酶处理，以获得“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-4：酶反应缓冲液为配套的10×缓冲液，酶用量为0.8U/μg YCplac33-AB-5酶切产物(相当于400U/nmol YCplac33-AB-5酶切产物)，处理温度为55℃，处理时间为5min，所得3’端单链粘端长度为300bp。该处理产物编号为YCplac33-AB-T5-5，可直接用于后续酵母转化。
步骤4：转化酿酒酵母。
(1)酵母感受态制备：同实施例1。
(2)外源DNA转化酵母感受态细胞：除外源DNA替换为YCplac33-AB-T5-5外，其余操作均与实施例1相同。
步骤5：转化子鉴定。
(1)菌落PCR鉴定：鉴定方法同实施例1。
(2)阳性转化子鉴定：同实施例1。
步骤6：获得同源克隆转化子，统计同源基因克隆准确率。
步骤5中测序结果表明携带YCplac33载体序列，缺失tor2基因编码区序列的克隆即为正确克隆。正确克隆数与100的比值即为基因敲除准确率。本实施例中基因敲除准确率为91％。实施例6
步骤1：tor2基因上游(序列A3)和下游(序列B3)各500bp同源序列克隆。
克隆方法同实施例3。
步骤2：携带序列A3和序列B3的环状克隆载体YCplac33-AB-6的构建。
质粒YCplac33的HindⅢ酶切反应及产物纯化方法同实施例1。序列A3、序列B3与YCplac33酶切产物的连接反应方法同实施例3，最后获得正确克隆YCplac33-AB-6，并冻存于-80℃。
步骤3：“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-6的制备。
提取正确克隆YCplac33-AB-4的质粒，并进行NotI，酶切方法同实施例1。采用与步骤1相同的PCR cleanup回收试剂盒对酶切产物进行回收，并以T5核酸外切酶处理，以获得“线型3’突出长粘端双链DNA”-YCplac33-AB-T5-6：酶反应缓冲液为配套的10×缓冲液，酶用量为0.4U/μg YCplac33-AB-6酶切产物(相当于400U/nmol YCplac33-AB-6酶切产物)，处理温度为55℃，处理时间为10min，所得3’端单链粘端长度为300bp。该处理产物编号为YCplac33-AB-T5-6，可直接用于后续酵母转化。
步骤4：转化酿酒酵母。
(1)酵母感受态制备：同实施例1。
(2)外源DNA转化酵母感受态细胞：除外源DNA替换为YCplac33-AB-T5-5外，其余操作均与实施例1相同。
步骤5：转化子鉴定。
(1)菌落PCR鉴定：鉴定方法同实施例1。
(2)阳性转化子鉴定：同实施例1。
步骤6：获得同源克隆转化子，统计同源基因克隆准确率。
步骤5中测序结果表明携带YCplac33载体序列，缺失tor2基因编码区序列的克隆即为正确克隆。正确克隆数与100的比值即为基因敲除准确率。本实施例中基因敲除准确率为78％。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江科技学院
<120> 在酵母菌中实现高准确率定点基因敲除的方法
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<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
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