一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法与流程

文档序号：11505934阅读：692来源：国知局

本发明提供了一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，属于基因工程、发酵工程领域。

背景技术：

植物来源的β-淀粉酶活性高，耐热性好、应用ph范围更广，目前工业上应用的β-淀粉酶大多还是通过植物提取获得的β-淀粉酶。从植物中提取β-淀粉酶目前主要有水提和油提两种方法，其中油提法(甘油)与水提法相比，具有提取时间短、酶的保存时间长等优点，但成本较高，生产中常采用水提法提取β-淀粉酶。目前商品化推广比较成功的β-淀粉酶为genencor杜邦公司生产的麦芽β-淀粉酶，是采用典型的大麦提取工艺制造方法制得。但由于β-淀粉酶在大麦中中的含量较低，提取成本偏高，且所有这些酶制剂提取物都或多或少含有其它无关淀粉水解酶，如α-淀粉酶、糖化酶等，影响其使用效果（麦芽糖浆中含有较高浓度的葡萄糖）。

微生物发酵生产的β-淀粉酶不受季节、原料等影响，可实现自动化控制批量生产，使生产出的β-淀粉酶性能稳定、均一，是β-淀粉酶产业化制造的最佳选择之一。但是由于微生物发酵生产的β-淀粉酶活性相对较低，耐热性差，产酶水平太低以及其最适作用温度偏低，一直未能实现工业化生产。国内外很早就通过物理、化学方法诱变提高产酶活力和热稳定性及改变菌种的发酵条件来提高酶活力，然而已有的微生物来源β-淀粉酶生产离工业化还有较大距离。特别是在β-淀粉酶高产菌株的构建和β-淀粉酶耐热性能等催化特征改良方面仍不成熟。

巴斯德毕赤酵母表达系统是一种甲醇营养型酵母表达系统，是一种相对较成熟的真核蛋白表达体系，被广泛用于各种外源蛋白的表达。毕赤酵母中含有强有力的aox1启动子，像大肠杆菌一样能够调控表达外源蛋白，同时作为一种真核表达系统，外源基因是通过质粒线性化后整合到自身基因组上，得到的重组菌遗传稳定性好；可以对蛋白进行恰当的翻译后，对其进行加工与修饰，促进蛋白正确折叠，因此比原核表达的蛋白更能贴近天然状态，并维持蛋白稳定的天然构象，从而使表达出的蛋白具有生物活性，而且活性较高，这对于蛋白高效表达有着十分重要的作用；不仅如此，由于分泌信号肽α-factor的存在，重组毕赤酵母表达的外源蛋白绝大部分可分泌到胞外，且自身分泌的内源蛋白少，使得外源蛋白分离纯化简便。与酿酒酵母相比，毕赤酵母表达的蛋白糖基化程度低，不会产生过度糖基化，因此对于蛋白的临床应用具有很大优势。除此之外，在应用毕赤酵母表达外源蛋白时操作简单、营养要求低、周期短、易于培养，高密度发酵技术成熟，便于工业化生产。

本发明利用分子克隆技术实施大麦β-淀粉酶在毕赤酵母中的异源表达并通过简单易行碱基突变新方法获得了耐热性能大幅度提高的新型β-淀粉酶变异体，并将该变异体在毕赤酵母中的高效表达，获得耐热型β-淀粉酶高效制造新技术。

技术实现要素：

本发明为一种新型β-淀粉酶的高效制备方法。

本发明通过ncbi公布的大麦β-淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbap基因，克隆入ppic9k载体中构建重组表达质粒ppic-bbap，在巴斯德毕赤酵母gs115中实现整合表达，并通过his+筛选、淀粉透明圈筛选及g418抗性筛选，获得了高分泌表达大麦β-淀粉酶的重组巴斯德毕赤酵母gs-bbap。对该重组酵母进行摇瓶发酵，在0.5%(v/v)甲醇诱导条件下发酵120h，分泌表达β-淀粉酶酶活水平为70~80u/ml的。获得重组β-淀粉酶的最适作用温度为55℃，最适作用ph为5.0。

通过采用非高保真的dna聚合酶在低退火温度下（45~50℃）对上述获得bbap实施易错pcr，获得的新基因bbapt克隆入ppic9k载体中构建重组表达质粒ppic-bbapt，在巴斯德毕赤酵母gs115中实现整合表达，并通过his+筛选、淀粉透明圈筛选及g418抗性筛选，获得了最适作用温度显著提高的β-淀粉酶的重组菌。获得重组β-淀粉酶的最适作用温度为65℃，最适作用ph为5.0。对该重组酵母gs-bbapt29进行摇瓶发酵，15l小试发酵和30m³大罐发酵生产。65℃条件下测定酶活力，最高酶活力达280u/ml。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，包括如下具体步骤：

（1）β-淀粉酶基因的获得：通过ncbi公布的大麦β-淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbap基因；

（2）克隆：将步骤（1）所得bbap基因克隆入ppic9k载体中构建重组表达质粒ppic-bbap；

（3）易错pcr：采用非高保真的dna聚合酶在45~50℃低退火温度下对上述获得bbap实施易错pcr，获得的新基因bbapt；

（4）表达：将步骤（3）所得新基因bbapt克隆入ppic9k载体中构建重组表达质粒ppic-bbapt，在巴斯德毕赤酵母gs115中实现整合表达；

（5）耐热新型β-淀粉酶的筛选：通过his+筛选、淀粉透明圈筛选及g418抗性筛选，再通过摇瓶发酵和酶活测定获得最适作用温度显著提高的β-淀粉酶的重组酵母gs-bbapt29；

（6）耐热新型β-淀粉酶的发酵生产：发酵培养，分离纯化得到耐热新型β-淀粉酶。

其中，步骤（4）所述巴斯德毕赤酵母是一种能高效表达、分泌β-淀粉酶的毕赤酵母基因工程菌株，其染色体dna上整合一条耐热新型β-淀粉酶编码基因。

步骤（5）所述的重组酵母gs-bbapt29的耐热新型β-淀粉酶编码基因如seqidno.1所示。

所述步骤（6）的发酵条件为：30m³大罐发酵生产，发酵培养基为bsm培养基，每升bsm培养基中加入12ml微量元素ptm1母液，发酵温度为30℃，ph维持5.0；do维持20%以上；流加甲醇诱导产酶70~96h后发酵结束；按照前述耐热型β-淀粉酶活力测定产酶水平，65℃条件下测定酶活力，最高酶活力达280u/ml。

本发明的显著优点

1、本发明获得耐热型β-淀粉酶新基因的方法具有易实施、易获得、催化活性高效等特点。

2、本发明获得耐热型β-淀粉酶新基因的方法可以为筛选高活性β-淀粉酶、耐酸或耐碱β-淀粉酶、耐热或低温β-淀粉酶等提供丰富的可筛选基因文库。

3、本发明基于毕赤酵母高效表达系统的新工艺有助于β-淀粉酶工业生产中的高效制备。

4、本发明的工业化生产过程使用的为无机盐全合成培养基，分泌表达的β-淀粉酶产品易于分离纯化和成品制备。

5、本发明的重组蛋白为工业酶制剂β-淀粉酶，进一步为大宗工业酶制剂，如淀粉酶、普鲁兰酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、rna酶等，但不局限于上述酶制剂。

附图说明

图1：ppic-bbapt质粒构建示意图；

图2：鉴定平板筛选产酶菌株；

图3：15l发酵体系下耐热型β-淀粉酶高产菌株gs-bbapt29产酶进程。

具体实施方式：

为了实现上述目的，本发明采用的实验方法如下：

1、培养基配置

大肠杆菌培养基lb培养基，培养条件200r/min，37℃；酵母培养基ypd培养基，富集培养基bmgy，诱导培养基bmmy，培养条件230r/min，28~30℃；酵母筛选固体培养基md，培养条件28~30℃。

大肠杆菌培养基：0.5%(w/v)酵母提取物，1%(w/v)胰蛋白陈，1%(w/v)nacl，ph为7.4。固体培养基则另加2%(w/v)琼脂粉。用于转化子筛选时，待灭菌冷却后另加入终浓度100μg/ml的amp。

毕赤酵母培养基：10×ynb(13.4%酵母氮源碱，含硫酸铵且不含氨基酸)：134gynb于1000ml水中，加热至ynb完全溶解后冷却，过滤除菌；

500×b(0.02%w/v生物素)：20mg生物素，溶解于100ml水中，过滤除菌；

10×d(20%w/v葡萄糖)：200gd-葡萄糖，于1000ml水中进行溶解，115℃高压灭菌15min；

10×m(5%vol甲醇)：5ml甲醇加入到95ml水中混匀；

10×g(10%vol甘油)：100ml甘油加入到900ml水中混匀；

1mol/l磷酸钾缓冲液：配制1mol/lk2hpo4和1mol/lkh2po4母液，准确量取132ml1mol/lk2hpo4和868ml1mol/lkh2po4混匀，调整ph值为6.0±0.1(ph值用磷酸或koh调节)；

ypd：10g酵母提取物，20g蛋白胨，加入900ml水中进行溶解，如制备固体培养基加入20g琼脂粉；使用时加入100ml10×20%葡萄糖，如制g418抗性筛选平板，则待灭菌冷却后另加入终浓度0.5mg/ml或2mg/ml的g418；

md：13.4%w/vynb，4×10^-5%w/v生物素，2%w/v葡萄糖；

bmgy：1%w/v酵母浸粉，2%w/v蛋白胨，l00mmol/l磷酸钾缓冲液ph6.0，1.34%w/vynb，4×10^-5%w/v生物素，1%vol甘油；

bmmy：1%w/v酵母浸粉，2%w/v蛋白胨，l00mmol/l磷酸钾缓冲液ph6.0，1.34%w/vynb，4×10^-5%w/v生物素，0.5%vol甲醇；

2、毕赤酵母染色体提取和重组质粒提取均参考《工业微生物实验技术手册》（诸葛健,王正祥.北京:中国轻工业出版社,1994.）或染色体/质粒提取试剂盒说明书描述方法进行。

3、酶活测定及所需溶液配置：

1%淀粉缓冲液：准确称量1.10g淀粉于烧杯中，加入20ml水进行溶解，将煮沸约50ml蒸馏水快速加入烧杯中搅拌，再将其缓慢煮沸至透明，冷却至室温，加入10ml0.2mol/lph5.5磷酸缓冲液，混匀定容至100ml。

0.2mol/lph5.5的磷酸缓冲液。甲液：准确称量53.65g十二水合磷酸氢二钠，加入到800ml去离子水中，完全溶解后定容到1000ml；乙液：准确称量27.80g二水合磷酸二氢钠，加入到800ml去离子水中，完全溶解后定容到1000ml；准确量取甲液6.50ml与乙液93.50ml，混匀，调整ph值为5.5±0.1(ph值用磷酸或naoh调节)。

10%ph5.50的磷酸缓冲液：准确量取0.2mol/lph5.50的磷酸缓冲液10ml，加入90ml去离子水中，混匀。

dns试剂：准确称取3,5-二硝基水杨酸1.00g，苯酚0.2g，亚硫酸钠0.05g，氢氧化钠1g，酒石酸钾钠20g，于去离子水中加热溶解，冷却至室温后定容至100ml，储于棕色瓶中，室温放置一周后方可绘制标准曲线。

1mg/ml的葡萄糖液：准确称取绝干葡萄糖50mg，用去离子水溶解定容至50ml。

按标准方法配制ph3.0~8.020mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、ph9.020mmol/ltris-hcl缓冲液、ph10.0~11.020mmol/l碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液；

4、ppic-bbapt质粒的构建

pmd-bbap为含有编码大麦β-淀粉酶的人工全合成基因序列的质粒(详细序列信息见序列附录中的seqidno.2)，ppic9k为载体质粒。以pmd-bbap质粒dna为模板，以分别添加ecori、noti酶切位点的寡核苷酸序列bba-f（见序列附录中的seqidno.3）和bba-r（见序列附录中的seqidno.4）为引物，pcr扩增出β-淀粉酶成熟肽基因序列。

pcr扩增条件设定为：95℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；30个循环；72℃，10min。

将上述pcr产物进行凝胶电泳，若出现1.46kb左右单一条带则为所需目的片段，用pcr产物纯化回收试剂盒纯化回收备用。

将ppic9k和纯化回收的目的基因片段均进行ecori/noti双酶切。

37℃酶切1h后，将酶切产物进行凝胶电泳，并使用纯化回收试剂盒纯化回收酶切产物，再次进行凝胶电泳确定正确后，将两个纯化回收产物进行连接。

从转化平板上挑转化子，于lb平板上划线培养，刮取菌体使用plasmidminikiti试剂盒提质粒，并经psti酶切后进行凝胶电泳，若ppic-bbapt质粒构建正确，酶切后凝胶电泳后出现3.96，2.56，1.8，1.24和1.1kb共5条带。

5、毕赤酵母重组菌株gs-bbapt的构建

将构建好的载体质粒ppic-bbapt用sali37℃酶切1h进行线性化。

线性化的质粒ppic-bbapt进行凝胶电泳确认，然后用纯化回收试剂盒纯化并浓缩备用。

（1）取甘油冻存管毕赤酵母细胞gs115于ypd固体平板上划线分离，30℃培养2天，至单菌落长出；采用电击转化的方法将上述线性化的质粒ppic-bbapt转入宿主细胞赤酵母细胞gs115中。

（2）电击后快速向电转杯中加入1ml预冷的1mol/l的山梨醇溶液，混匀后取200μl到600μl不等涂于md平板上；

（3）将md平板正置30min后到置于30℃恒温培养箱培养2天，至菌落长出；

6、重组酵母gs-bbapt的基因鉴定

（1）使用酚氯仿抽提法提取酵母转化子的染色体dna或按invitrogen公司（http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/invitrogen.html）毕赤酵母遗传操作手册步骤提取酵母转化子的染色体dna：

（2）以稀释后的基因组为模板，以bba-f和bba-r为引物进行pcr扩增。验证目的基因是否整合到酵母的染色体上。

7、营养缺陷型筛选

毕赤酵母菌gs115在组氨酸脱氢酶位点（his4）发生突变，表现型his-，自身不能合成组氨酸，重组载体ppic-bbapt经sali线性化整合到毕赤酵母菌gs115染色体后，产生his+mut+表现型，所有表达质粒都有his4基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的md培养基来筛选转化子，即在不含组氨酸的md平板上重组酵母菌株可以生长，而毕赤酵母原始菌gs115则不能生长。

线性化后的重组载体ppic-bbapt与酵母感受态细胞(现制现用)混匀，按照参数电转化后涂布于md(不含组氨酸)平板，通过md(不含组氨酸)培养基筛选目的基因整合入酵母染色体的转化子。

8、淀粉透明圈筛选

重组酵母在甲醇诱导下会分泌表达β-淀粉酶，通过将md平板上长出的重组转化子用灭过菌的牙签点接至含0.5%~1%淀粉与0.04%苔酚蓝的bmmy平板上，30℃培养2d，观察长出的转化子有无淀粉透明圈及透明圈大小，并筛选淀粉透明圈大的转化子进行下一步筛选。

9、高拷贝筛选

筛选高拷贝是为了使菌株能够异源表达更高浓度的蛋白，本研究采用直接g418抗性筛选法：将前两步筛选获得的转化子点至含0.5mg/ml的g418-ypd平板上，30℃培养2天，将长势良好的菌落点至2mg/ml的g418-ypd平板，30℃培养2天之后分别挑取三个长势好的转化子，分离纯化后挑单菌落转接种子培养基，进行摇瓶发酵试验。

10、摇瓶条件下重组酵母的诱导表达

按以下步骤进行：

（1）将通过三步筛选获得的单克隆挑至ypd液体培养基中，30℃230r/min培养过夜；

（2）按1%接种量接入bmgy培养基中，250r/min，30℃摇床培养至od600值约为2-4；

（3）室温5000r/min离心5min，收集菌体，重悬于bmmy培养基中至od600值为1.0，250r/min，30℃摇床培养120h；

（4）每隔24h取样并向发酵摇瓶中加入0.5%vol的甲醇诱导表达。

（5）室温13000r/min离心2min收集沉淀和上清，将上清-80℃保存备用。

11、重组菌的β-淀粉酶活力测定

耐热型β-淀粉酶活力测定采用dns法。酶活定义：1ml酶液或1g酶粉在ph5.5、60℃的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg麦芽糖即为一个酶活力单位，以u/ml表示。取9ml1.10%淀粉缓冲液于试管中，60℃预热5min，快速加1ml酶液（立即计时），60℃恒温水浴准确反应30min后迅速吸取0.5ml反应液于装有1.5mldns溶液的25ml具塞比色管中，沸水浴15min，以流动水迅速冷却，向其中加入10.5ml蒸馏水，摇匀，用721分光光度计在550nm下比色。空白用蒸馏水代替酶液。

酶活的计算公式为：u=k×n×2×20×1.9(u/ml)

k-----根据标准曲线和od值计算得出的葡萄糖mg数；

n-----稀释倍数；

2-----反应30min换算1h；

20-----将吸取0.5ml反应液换成10ml；

1.9-----葡萄糖换算成麦芽糖系数。

12、制糖试验

称取适量麦芽糊精，配置成20%的溶液。调节ph至5.0，预热后按50u/g(干基)加入β-淀粉酶或按50u/g(干基)加入β-淀粉酶和0.5u/g(干基)加入普鲁兰酶，同时采用商品酶β-淀粉酶及真菌α-淀粉酶作为对照，分别按50u/g(干基)及15u/g(干基)的加酶量密封，于恒温水浴锅中进行糖化，水浴锅温度维系在55℃，糖化反应50h。糖化结束后取样，用高效液相色谱进行分析。

13、糖液组分的高压液相色谱分析

将糖化液样本用70%的无水乙醇沉淀预处理，4℃静置4h后，离心20min，取上清液用0.45µm微孔滤膜过滤。

色谱条件：agilent氨基柱(zorbaxnh2，4.6×250mm，5µm)；示差折光检测器；流动相乙腈:水=68:32(v/v)；流速0.7ml/min；柱温室温。麦芽糖标准参照品用纯净水配制成0.5~2.5mg/ml；以保留时间定性出峰组成，以外标法通过出峰峰面积计算糖液中麦芽糖含量。麦芽糖生成率定义为单位麦芽糊精（绝干）在酶促反应后的麦芽糖生成量，用%(w/w)表示。

具体实施案例如下：

实施例1—β-淀粉酶新基因的合成

按照ncbi公布的大麦β-淀粉酶成熟肽基因碱基序列组成（基因序列信息：genbank:af300800.1），结合密码子优化网站http://www.jcat.de提供的酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）密码子偏好性数据库进行碱基序列编辑。并采用全基因组合成技术获得密码子优化后的基因片段bbap，如seqidno.1所示的碱基序列。

实施例2—新型β-淀粉酶基因文库的获得

以实施例1中获得β-淀粉酶基因作为模板克隆获得β-淀粉酶新基因。引物如附录中的bba-f和bba-r，低退火温度条件下[95℃10min；30×(94℃30s;45~50℃1min;72℃3min）；68℃10min]采用低保真的dna聚合酶扩增获得目的条带bbapt。将获得的条带克隆入表达载体ppic9k获得重组质粒ppic-bbapt。获得重组质粒在大肠杆菌jm109中保存。作为新型β-淀粉酶基因文库用于后续分泌表达型重组菌的构建和β-淀粉酶高产菌株的筛选。

实施例3—新型β-淀粉酶高产菌株的筛选

将上述重组质粒采用碱裂解法提取制备闭环质粒经sali线性化后通过电击转化的方法导入宿主菌毕赤酵母gs115中。获得相应的重组菌。并将重组菌涂布β-淀粉酶鉴定平板初步筛选获得透明圈较大的菌株。初筛获得的重组菌接种液体β-淀粉酶筛选培养基30℃好氧培养120h测定产酶情况。鉴定平板透明圈形成情况和65℃条件下酶活数据见表1。透明圈显著的菌株液体培养后冻藏管-70℃保藏用于后续发酵工艺建立和β-淀粉酶的高效制备。

表1新型β-淀粉酶重组菌透明圈形成情况

注：+/-，透明圈隐约可以看到但不清晰；+，透明圈清晰但直径小于2mm；++，透明圈清晰直径大于2mm小于3mm；+++，透明圈清晰直径大于3mm小于5mm；++++，透明圈清晰直径大于5mm

实施例4—15l发酵体系下gs-bbapt29菌种制备β-淀粉酶

将表1中酶活最高的重组菌gs-bbapt29接种到ypd种子培养基培养到对数生长期，进一步在15l发酵罐中进行发酵实验。具体操作如下：甘油管接种ypd平板，30℃培养40h；单菌落接种ypd液体培养基，250ml三角瓶装液量30ml，30℃培养温度下200r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5ml上述菌悬液接种二级种子培养基（液体ypd），500ml三角瓶装液量100ml，30℃培养温度下200r/min摇床培养16h，od600测定为10时，600ml用于发酵罐接种；

发酵罐准备：按照11l初始装液量配制发酵培养基（bsm），氨水调节ph至5.0，搅拌充分后，121℃30min灭菌。同时准备补料瓶等。并配制50%甘油5.5l用于补料。

接种：接种时，将600ml种子悬液和131.59ml微量元素ptm1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，ph维持5.0。do维持20%以上。

菌体生长阶段：发酵培养基中含4%vol的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，do会快速上升，随即进入补料生长阶段。补料生长阶段：流加50%vol甘油（每升甘油中事先添加了12ml微量元素母液）。初始流加速度为3.0~9.0ml/min。当do低于20%时停止流加。待甘油再次耗尽，do快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段。诱导产酶阶段：流加甲醇（每升甲醇中添加12ml微量元素母液）。初始流加速率为1.2~3.6ml/min。当do低于20%时停止流加。待甲醇耗尽，do快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至3.6~7.3ml/min。2h后流加甲醇速率提高至7.3~10.9ml/min。诱导70~96h后发酵结束。按照前述耐热型β-淀粉酶活力测定产酶水平，酶活力为247~270u/ml；其氨基酸序列如seqidno.5所示。

实施例5:在30m³体系下菌种gs-bbapt29发酵制备β-淀粉酶

将实施例4的工艺调整为30m³发酵体系对应的比例。分别完成种子培养，1l种子液接种15l一级种子罐，培养12h后移种3m³二级种子罐，继续培养12h后移种30m³主发酵罐，发酵培养基初始装液量为20m³培养菌体。诱导产酶70～96h后发酵结束酶活为280u/ml。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备普鲁兰酶液体成品，或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型普鲁兰酶酶成品，成品酶活为1000～1300u/g。

将实施例5的工艺调整为30m3发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后，诱导产酶。诱导70~96h后发酵结束。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备α-葡萄糖苷酶液体成品。或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型β-淀粉酶成品。

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<110>福建福大百特生物科技有限公司

<120>一种新型β-淀粉酶的高效制备方法

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<213>重组酵母gs-bbapt29的耐热新型β-淀粉酶编码基因

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