一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法与流程

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法。

背景技术：

随着我国综合国力和人民生活水平的显著提高，葡萄酒消费额度逐年上升，市场逐年扩大。正常情况下，葡萄酒中的挥发酸在0.4～0.6g/l之间，不应超过1.1g/l。其含量的变化可以看作葡萄酒酿造和储藏健康状况的“晴雨表”。过高的挥发酸含量会严重影响葡萄酒的感官品质，使葡萄酒在品尝时产生令人不愉快的灼热感和呛人的刺激气味，嗅闻时会产生刺鼻的酸味，掩盖葡萄酒的其他香气。葡萄酒中主要的挥发性有机酸是乙酸，可以占到总挥发酸的80～90％以上。因此控制乙酸的产量便可以很好的控制总挥发酸量。甘油是酿酒酵母产生的对葡萄酒感官特性影响最大的副产物。甘油不仅可以赋予葡萄酒淡淡的甜味，而且赋予葡萄酒柔润、醇厚和如履丝绒的口感，对酒体的典型性也起到重要作用。甘油在葡萄酒中的含量为3～9g/l，其含量的多少在葡萄原料相同的前提下取决于所采用的酿造技术和酿酒酵母菌株。

在酿酒酵母中，乙酸是由丙酮酸脱氢酶支路(pdh)的关键酶乙醛脱氢酶系(acdh)产生的。丙酮酸脱氢酶支路在丙酮酸脱羧酶(pdc)、乙醛脱氢酶系(acdh)和乙酰辅酶a合成酶等酶的作用下经过一系列反应将丙酮酸转化为乙酰辅酶a。acdh可将pdh中间产物乙醛氧化为乙酸。ald6p是acdh酶系中主要的细胞浆质乙醛脱氢酶，其由ald6基因编码，也是乙酸产生的关键酶；其同工酶ald4p为主要的线粒体乙醛脱氢酶，在ald6基因缺失时，由ald4基因编码并补偿由于ald6缺失造成的代谢失衡。

在葡萄酒酿造工业筛选乙酸产量低而甘油产量高的酿酒酵母菌株是广大科研工作者的主要兴趣所在。

技术实现要素：

本发明的目的旨在解决由于酿酒酵母在葡萄酒酒精发酵过程中乙酸含量过高而甘油含量偏低的问题，而提供了一种基因敲除的高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法。

本发明的第一方面，提供一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株的构建方法，按照以下步骤进行：

1)、以酿酒酵母njzcc17(专利保藏号：cgmcc3284)和njzsc5(专利保藏号：cgmccno.3732)作为出发菌株，进行单倍体分离，筛选得到两株单倍体菌株，分别命名为17a24(mata)单倍体酿酒酵母和5125(matα)单倍体酿酒酵母；

2)、采用基因敲除技术，利用pug6质粒对17a24(mata)单倍体酿酒酵母和5125(matα)单倍体酿酒酵母的ald6基因分别进行敲除；再利用psh65质粒对两端带有loxp位点的g418抗性基因kanmx分别进行敲除；得到基因改良菌株17a24-ald6△(mata)和5125-ald6△(matα)；

3)、将野生型17a24(mata)单倍体酿酒酵母和野生型5125(matα)单倍体酿酒酵母，及基因改良后的17a24-ald6△(mata)菌株和5125-ald6△(matα)菌株进行二倍体杂交融合，最后得到njz17a5和njz17a5-ald6△两株新的二倍体杂交菌株。

进一步地，上述步骤2)所述ald6基因敲除是采用pug6质粒对ald6基因进行敲除，所设计的敲除质粒的引物为：

上游引物：

5'-aacatcaagaaacatctttaacatacacaaacacatcttcgtacgctgcaggtc-3'；

下游引物：

5'-tttgtgtatatgacggaaagaaatgcaggttggtacattagcataggccactagtggatctg-3'；

pcr扩增条件为：94℃×4min，一个循环；94℃×30s,62℃×30s，72℃×1min，30个循环；72℃×10min，一个循环；pcr扩增体系(50μl)的组成为：模板dna1μl，10×pcr反应缓冲液(mg²⁺plus)5.0μl，10μm引物(上下游)各1μl，10mmdntps4μl，taqdna聚合酶5u/μl，ddh2o37.75μl，混匀。

本发明的第二方面，提供一种由上述方法构建的高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株。

在本发明的一个实施例中，对二倍体杂交菌株njz17a5-ald6△的乙酸、甘油、乙醛及其他主要酿造特性与初始菌株njzcc17和njzsc5进行了比较发酵研究，发现ald6敲除菌株的甘油产量提高了近30％，而乙酸和挥发酸的量减少了近50％，对葡萄酒风味有不利影响的乙醛和乙酸乙酯含量降低了近50％和60％，而对葡萄酒(尤其是白葡萄酒)风味有利的物质异戊醇和2-苯乙醇产量分别提高了16％左右。

本发明的第三方面，提供该高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株在葡萄酒发酵中降低乙酸产量且提高甘油产量的应用。

本发明的第四方面，提供该高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株在葡萄酒发酵中提高异戊醇和2-苯乙醇的产量并降低挥发性物质的产量的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本申请以酿酒酵母njzcc17(专利保藏号：cgmccno.3284)和njzsc5(专利保藏号：cgmccno.3732)作为出发菌株，获得的基因敲除杂交酿酒酵母njz17a5-ald6△(mata/matα)，在酒精发酵过程中生成乙醛从而转化为乙酸的能力降低，因此乙酸产量降低，而碳代谢流更多地转向生成并积累甘油。由于乙酸含量的降低，因此导致乙酸乙酯含量的降低。而由于碳氮代谢流的转变下，这些物质的代谢和积累也发生了改变。而对葡萄酒(尤其是白葡萄酒)风味有利的物质异戊醇和2-苯乙醇产量分别提高。杂交酿酒酵母njz17a5-ald6△(mata/matα)除了上述优点之外，还保留了两株亲本株本来的优点，比如起酵速度快、h2s产量低、发酵过程中产生泡沫少、糖和酒精耐受度高、不产生有机胺、发酵结束后残糖低等。因此，为葡萄酒酿造工业提供了一种降低乙酸产量的同时又能提高甘油产量的新方法。

附图说明

图1为酿酒酵母njzsc5诱导生孢显微照片；

图2为酿酒酵母njzcc17诱导生孢显微照片；

图3为酿酒酵母单倍体5125显微照片；

图4为酿酒酵母单倍体17a11显微照片；

图5为pug6的质粒图谱；

图6为ald6线性敲除质粒(1753bp)电泳图谱：左边为线性敲除质粒，中间为阴性对照，右边为d2000marker；

图7为psh65的质粒图谱；

图8为17a24-ald6△(mata)和5125-ald6△(matα)杂交融合后再次诱导生孢的显微照片；

图9为17a24(mata)和5125(matα)杂交融合后再次诱导生孢的显微照片；

图10为njz17a5-ald6△、njz17a5、njzcc17及njzsc5在发酵条件下co2失重比较。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的半合成发酵培养基配方如下：

葡萄糖，200g/1000ml；酵母抽提物，10g/1000ml；硫酸铵，1g/1000ml；磷酸钾，1g/1000ml；硫酸镁，1g/1000ml；121℃，灭菌15min后用浓度为10g/1000ml的无菌柠檬酸溶液调节ph值至3.5。

下述实施例中yepd培养基配方如下：

葡萄糖，20g/1000ml；蛋白胨，20g/1000ml；酵母抽提物，10g/1000ml；自然ph值，121℃，灭菌15min。固体培养基加入20g/1000ml琼脂，微波炉加热完全融化后灭菌。

下述实施例中mcclary培养基培养基配方如下：

葡萄糖，1g/1000ml；kc1，1.8g/1000ml；无水乙酸钠，8.2g/1000ml；酵母膏，2.5g/1000ml；琼脂，20g/1000ml。

下列实施例中齐氏苯酚复红染色液配方如下：

a液，碱性复红0.3g在研钵中研磨后，逐渐加入95％乙醇，继续研磨使其溶解，配成a液；b液，苯酚5g，加入95ml双蒸水充分溶解，配成b液。混合a液和b液即成。用前将此混合液稀释5-10倍。

下列实施例中吕氏美兰溶液配方如下：

a液，美兰(亚甲基兰)5g溶于100ml95％酒精中，取30ml备用；b液，koh0.01g溶于100ml双蒸水中。a液30ml与b液100ml混合，过滤后使用。

下列实施例中酸性脱色液配方如下：浓盐酸(比重1.19)3％(v/v)加入97％(v/v)浓度为95％的酒精，混匀备用。

下列实施例中ph5.8pb磷酸缓冲液(0.2m)配方如下：

母液a(0.2mna2hpo4)，称取71.6gna2hpo4.12h2o，定容至1000ml；母液b(0.2mnah2po4)，称取31.2gnah2po4.2h2o，定容至1000ml。用时分别取a液和b液8ml和92ml，混匀备用。

下列实施例中pbs高渗缓冲溶液配方如下：

每升ph5.8pb磷酸缓冲液(0.2m)加入52.185g氯化钾(或145.6g)山梨醇，溶解均匀后用0.22μm微孔滤膜过滤灭菌。

下列实施例中10％蜗牛酶裂解液配方如下：

0.5g蜗牛酶加入5ml(10％浓度)ph5.8pb磷酸缓冲液(0.2m)中溶解，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌。

下列实施例中0.1％β-巯基乙醇配方如下：

99.9mlph5.8pb磷酸缓冲液(0.2m)中加入0.1mlβ-巯基乙醇。

下列实施例中单倍体制备反应体系配方如下：

吸取1ml培养24h的酿酒酵母菌悬液加入至无菌10ml离心管中，6-8℃条件下5000rpm离心3min，除去上清液，用0.9％生理盐水洗涤菌体两次，分别加入0.7mlpbs高渗缓冲溶液、0.2ml10％蜗牛酶(反应终浓度2％)和0.1ml0.1％β-巯基乙醇(反应终浓度0.01％)。

下列实施例中按照下述方法检测模拟发酵中各菌株的酿造特性：

co2失重：称量法(m.s.pérez-coello1,a.i.brionespérez,j.f.ubedairanzoandp.j.martinalvarez.characteristicsofwinesfermentedwithdifferentsaccharomycescerevisiaestrainsisolatedfromthelamancharegion.foodmicrobio.1999,16(6):563-573)；

残糖含量：菲林试剂法(gb/t15038-2006)；

酒精含量：比重瓶法(gb/t15038-2006)；

挥发酸的量：滴定法，具体步骤按gb/t15038-2006所规定程序操作；

乙醛产量：试剂盒法，乙醛测定试剂盒(acetaldehydeassaykit，megazyme公司，爱尔兰)；

甘油产量：试剂盒法，甘油测定试剂盒(glycerolassaykit，megazyme公司，爱尔兰)；

乙酸含量的检测为hplc法，具体步骤为按gb/t15038-2006所规定程序操作；

挥发性香气物质含量采用spme-gc-ms：用agilent6890气相色谱(gc)和agilent5975质谱(ms)联用仪(agilent，美国)检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件为：毛细管柱hp-innowaxpolyethyleneglycol60m×0.25mm×0.25μm(j&wscientific，美国)载气为高纯氦气，流速1ml/min；顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，插入气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2min。质谱借口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式ei，离子能量70ev，质量扫描范围20-450amu(张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[d].中国农业大学博士学位论文.2007)。

【实施例1】酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)njzcc17(cgmccno.3284)和njzsc5(cgmccno.3732)单倍体菌株的分离、纯化及其交配型鉴定

将实验室保存的njzcc17和njzsc5两株菌在yepd琼脂培养基上在28℃条件下培养48h，连续活化两次。将活化好的菌株挑取单菌落转接到国际通用生孢子培养基(mcclary培养基)上诱导生孢，28℃条件下培养7d，在显微镜下观察子囊孢子的形成情况，采用血球计数板统计酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢率。培养7d后在显微镜下观察两株亲本菌株产孢率均在70％以上。

产孢率(％)＝子囊孢子数量/总细胞数。

取干净载玻片1张，滴加少许蒸馏水，用接种环取菌少许涂片，自然干燥；在灯焰上通过火焰2～3次，冷却；滴加稀释的石炭酸复红液，在火焰上方加热5～10min至冒气为止，冷却，水洗；加酸性酒精脱色10～20s，水洗；滴加美兰染色液染色1min，水洗，干燥；在高倍显微镜下观察，子囊孢子为红色，菌体为青蓝色(如图1和图2)。

待孢子大量生成时(生孢率>70％)，从生孢培养基上取适量已形成子囊孢子的菌体，用无菌生理盐水制成孢子悬液。取无菌的1.5ml离心管1只，加入1ml孢子悬液，离心5min(5000r/min)收集菌体，加入20mg/ml的蜗牛酶液1ml，30℃水浴2h，使子囊壁破裂释放出单孢子，然后52℃水浴处理10min，用以杀死营养体细胞，迅速冷却菌悬液，用微量移液器将菌悬液吹吸几次，将孢子打散(或者倒入装有玻璃珠的无菌离心管中，加适量无菌生理盐水和无菌液体石蜡，振荡20min)，迅速稀释3个稀释度，涂布于yepd培养基上，28℃培养2～3d至长出明显菌落。将平板上各个菌落按上述方法在yepd培养基和生孢培养基中再培养，28℃培养7d后染色并镜检、拍照。放大倍数为10×l00，凡不形成子囊孢子的基本确定为单倍体细胞，产孢者为双倍体细胞。对所有在产孢培养基上分离到的单菌落进行染色，选取无红色子囊孢子者再一次进行纯化鉴定。鉴定结果为亲本酿酒酵母njzsc5得到6株单倍体菌株，分离编号为5111、5123、5125、5124、5412和5441；njzcc17得到4株单倍体菌株，分离编号分别为17a11、17a21、17a22和17a24。

分别挑取鉴定好的单倍体酿酒酵母和单倍体标准菌株cicc1810单菌落接入到10mlyepd培养基中静置培养24h，然后用漩涡振荡器振荡均匀后，分别吸取0.1ml菌悬液加入到yepd液体培养基中继续培养24h。将培养好的酵母菌稀释至适当梯度，涂布于生孢培养基上诱导产孢，28℃培养7d后染色并镜检，有红色子囊孢子生成者为mata交配型，全部为青蓝色营养细胞者为matα交配型。结果显示，以酿酒酵母njzsc5为亲株分离得到的6株单倍体菌株(5111、5123、5125、5124、5412和5441)均为matα交配型；而以njzcc17为亲株分离得到的4株单倍体菌株(17a11、17a21、17a22和17a24)均为mata交配型。

接种单菌落于5ml冻存管中加入2-3ml液体或固体yepd培养基(固体培养基做成约45°斜面)，28℃培养24h。待长好后分别加入0.5ml甘油，或在斜面培养基上加入适量高度的无菌液体石蜡。加甘油者置于-80℃冰箱，加石蜡者室温保藏，可保存约一年。

通过筛选选择17a24(mata)和5125(matα)(如图3和图4)进行后续的基因操作。

【实施例2】酿酒酵母单倍体菌株ald6基因的敲除

利用plasimidminikiti(omega，usa)质粒提取试剂盒对含有pug6质粒(如图5)的dh5α大肠杆菌进行质粒提取，并将其浓度稀释至20～50ng/μl，-20℃冰箱中保存备用作为模版dna。根据yeastgenome中ald6基因(genbank号：856044)的序列设计一对构建敲除质粒的引物，54bp的上游引5'-aacatcaagaaacatctttaacatacacaaacacatcttcgtacgctgcaggtc-3'和62bp的下游引5'-tttgtgtatatgacggaaagaaatgcaggttggtacattagcataggccactagtggatctg-3'，由上海生物工程技术服务有限公司合成(底部划横线的序列为与pug6质粒互补引物序列)。pcr扩增条件为：94℃×4min，一个循环；94℃×30s,62℃×30s，72℃×1min，30个循环；72℃×10min，一个循环；pcr扩增体系(50μl)的组成为：模板dna1μl，10×pcr反应缓冲液(mg²⁺plas)5.0μl，10μm引物(上下游)各1μl，10mmdntps4μl，taqdna聚合酶5u/μl，ddh2o37.75μl，混匀。以上pcr反应制剂均为takara公司生产。随后对pcr扩增产物进行检测：取5μlpcr扩增产物点样于1.0％琼脂糖凝胶上，电泳缓冲液为1×tae，100v电压下，电泳25min，溴化乙锭(eb)染色后，由凝胶成像系统对电泳图谱拍照并进行分析，采用d2000dnaladder判断pcr扩增产物的大小为1753bp(如图6)。

利用dnaclean&concentration^tm-25dna纯化试剂盒(zymoreasearch，usa)对pcr反应体系中的敲除线性质粒进行纯化。采用giets和schiestl所述醋酸锂转化法分别转化目标单倍体酿酒酵母17a24(mata)和5125(matα)，具体操作步骤如下：1)接种5ml液体yepd培养基，30℃下振荡培养过夜。2)用血球计数板对过夜培养物细胞密度计数，以最终5×10⁶cfu/ml的细胞密度接种至50mlyepd培养液。3)以200r/min的转速，于30℃振荡培养箱中振荡培养3～5h，至细胞密度2×10⁷cfu/ml。4)50ml离心管以2500r/min的转速离心5min，收集细胞。5)弃上清液，将细胞重悬在25ml无菌水中，再次以2500r/min的转速离心5min。6)弃上清液，把细胞悬浮在1ml的0.1mol/l的乙酸锂中，转悬浮物到一个1.5ml无菌离心管中。7)高速离心5s沉淀细胞，吸尽乙酸锂。8)悬浮细胞到最终500μl体系(2×10⁹cfu/ml)。9)将1ml鲑鱼精子ssdna(sigma，usa)样品煮沸5min，立刻于冰上冷却。10)充分振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到新的离心管中，离心沉淀细胞，除去乙酸锂。11)按顺序加入基本“转化混合液”，包括：聚乙二醇(peg，50％m/v)，240μl；1.0mol/l乙酸锂，36μl；ssdna(2.0mg/ml)，25μl；水和质粒dna(0.1～10μg)，50μl。12)剧烈振荡1min。13)30℃保温30min。14)42℃水浴中热激20～25min。15)7000r/min的转速离心15s，除去转化混合液。16)吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。17)用等份100μl转化混合液涂布含有200μg/mlg418的yepd琼脂平板。

由于野生型单倍体菌株不能在含200μg/mlg418的yepd琼脂平板上生长，故能在该平板上生长的均为敲除了ald6基因而替换上g418抗性基因的转化子。

【实施例3】ald6基因敲除菌株g418筛选标记基因的敲除

利用plasimidminikiti(omega，usa)质粒提取试剂盒对含psh65(如图8)(gal1-cre，phleomycinresistance)质粒的dh5α大肠杆菌进行质粒提取，并用实施例2中的方法对17a24-ald6△-kanmx和5125-ald6△-kanmx两株基因敲除菌株再次进行转化，并用含有100μg/ml腐草霉素的yepd培养基进行筛选。待转化子长出后，在含有半乳糖的yepg液体培养基中诱导培养5h，由于半乳糖的存在诱导psh65质粒上cre重组酶的表达，从而介导已整合到单倍体酵母基因组上相邻loxp位点间kanmx(g418抗性)基因的敲除。随后涂布于yepd固体培养平板上，获得单菌落后，影印至含200μg/mlg418的yepd固体平板上，筛选kanmx(g418抗性)基因被删除的菌株。将kanmx基因已被敲除的菌株在yepd液体培养基中传代10次，影印至带有100μg/ml腐草霉素的yepd培养基上挑取psh65质粒丢失的菌落进行保藏。得到的两株单倍体菌株分别命名为17a24-ald6△(mata)和5125-ald6△(matα)。

【实施例4】17a24-ald6△(mata)和5125-ald6△(matα)杂交融合及17a24(mata)和5125(matα)原菌株杂交融合重新生成二倍体

分别将17a24-ald6△(mata)、5125-ald6△(matα)、17a24(mata)和5125(matα)四株菌接种于10mlyepd液体培养基中28℃培养过夜，然后分别吸取0.1ml17a24-ald6△(mata)和5125-ald6△(matα)菌悬液接种于10mlyepd液体培养基中，再分别吸取0.1ml17a24(mata)和5125(matα)菌悬液接种于10mlyepd液体培养基中28℃振荡培养4h。镜检杂交完成后吸取适量菌悬液涂布于yepd固体培养基上，28℃培养24h，分别挑取较大菌落于mcclary培养基上鉴定杂交菌株的产孢能力，能够产孢的菌株确定为经过杂交形成的二倍体杂交菌株。分别命名为njz17a5-ald6△(mata/matα)(如图8)和njz17a5(mata/matα)(如图9)。

【实施例5】ald6敲除二倍体杂交菌株njz17a5-ald6△、原始二倍体杂交菌株njz17a5、亲本菌株njzcc17和njzsc5乙酸、甘油产量及主要酿造特性的比较

将njz17a5-ald6△、njz17a5、njzcc17和njzsc5挑取单菌落于10mlyepd液体培养基中培养24h，再接种于300ml半合成发酵培养基中，26℃缓慢振荡培养至酒精发酵结束。每株菌设三个重复。每间隔24h称重，监测co2释放量的变化情况，当24h内co2释放量无变化时可认为酒精发酵结束(如图10)。

从表1可以看出与njz17a5、njzcc17和njzsc5相比，njz17a5-ald6△的甘油产量提高了近30％，而乙酸和挥发酸的量减少了近50％，对葡萄酒风味有不利影响的乙醛和乙酸乙酯含量降低了近50％和60％，而对葡萄酒(尤其是白葡萄酒)风味有利的物质异戊醇和2-苯乙醇产量分别提高了16％左右。

表1各菌株的发酵性能的比较

a、b、c、d：不同字母代表以上数据之间经邓氏多变域测验法(duncan`smultiplerangetest)在显著差异群p≤0.05时差异显著；*、**、***和ns：分别代表利用邓氏多变域测验法在p≤0.05、p≤0.01和p≤0.001时显著，ns代表不显著(p>0.05)。

sequencelisting

<110>梁恒宇，武汉生物技术研究院

<120>一种高产甘油低产乙酸的葡萄酒用酿酒酵母菌株及构建方法

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1503

<212>dna

<213>saccharomycescerevisiae

<400>1

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