本发明涉及蛋清提取技术领域，具体涉及一种从鸡蛋中提取卵转铁蛋白来制备冻干粉的方法。
背景技术：
卵转铁蛋白是单一肽链的蛋白质，是人体内一种重要的铁元素载体，许多疾病都与人血清中转铁蛋白的含量变化有关，如缺铁性贫血、急性肝炎及蛋白质缺乏等。卵转铁蛋白是一种能转运fe3+的铁结合蛋白，是一种非血红素结合铁的β-球蛋白，一个分子能可逆地结合两个fe3+，同时结合两个co32-或hco3-，阴离子的结合与fe3+的结合是协同的。有研究表明，酪氨酸残基在转铁蛋白与铁的结合过程起着关键的作用，转铁蛋白分子在结合铁离子前后结构是不完全相同：未结合铁离子时，转铁蛋白的分子呈较开放、疏散结构；结合了铁离子后，转铁蛋白的配体同铁离子之间相互作用使得整个分子结构变得更加紧密。
卵转铁蛋白(ovotransferrin,ovt)以前称作卵伴白蛋白，是一种糖蛋白，卵转铁蛋白约占鸡蛋总蛋白质含量的12%，具有抗菌、抗病毒、免疫调节、抗癌和抗氧化等作用。其能够能促进人体对铁及营养物质的吸收，有防止贫血的作用。对大肠杆菌等的抑制作用与血清中的转铁蛋白相同，同时对假单胞杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、李氏杆菌及衣原体等也有抑制作用，其抗病毒的性能优于乳铁蛋白和血清转铁蛋白，另外，对婴儿急性肠炎有很好的疗效。因此，从来源丰富的鸡蛋中提取卵转铁蛋白，将其开发为天然的防腐剂和抗菌剂应用于各类食品，或作为功能性成分添加到各类食品，或制成天然抗菌药物或高效补铁剂，以及用于化妆品中增强抗衰老功效，其应用和开发前景十分广阔。
技术实现要素：
本发明针对现有的技术问题，提供一种从鸡蛋中提取卵转铁蛋白来制备冻干粉的方法，以便提高鸡蛋中提取卵转铁蛋白的能力，以应用于各类食品。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从鸡蛋中提取卵转铁蛋白来制备冻干粉的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）制备蛋清稀释液：将新鲜鸡蛋洗净，置于2-3℃下冷藏3-6h，然后将冷藏的鸡蛋进行分离蛋黄与蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清体积的水进行稀释，得到蛋清稀释液，并置于3℃的冰箱中冷藏至少一小时；
（2）分离卵粘蛋白：在蛋清稀释液中加入3mol/l的hcl调节ph至5.8，并用300-450r/min的搅拌机进行搅拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用离心机离心，去除沉淀，得到上清液；
（3）调节ph：将步骤（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，调节ph至7.5，并用600-800r/min的搅拌机搅拌0.5-1h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用离心机离心，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸铵沉淀：在所述步骤（3）的上清液中加入40%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置2h，然后利用5000r/min的离心机离心30min；然后，取上清液再加入85%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置1h，然后利用5500r/min的离心机离心20min；沉淀用蒸馏水溶解、透析脱盐；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液调节ph至8.2，然后在离心20min，取上清液；
（5）利用q-sepharosefastflow离子交换柱，用ph为8.2的hcl缓冲液平衡离子交换柱，然后，将步骤（4）得到的上清液以2.5ml/min的流速加入离子交换柱中，然后分别用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速进行分步洗脱，并收集含有卵转铁蛋白的洗脱液；
（6）将卵转铁蛋白的洗脱液进行浓缩、真空冷冻干燥，研磨处理，即制得卵转铁蛋白冻干粉。
进一步，作为优选，在所述的步骤（4）与步骤（5）之间还设置有微滤步骤，所述的微滤步骤为采用滤膜去除所述的步骤（4）得到的上清液中的30-80微米范围的杂质，微滤时的操作压力为0.1mpa。
进一步，作为优选，所述的微滤步骤之后还设置有超滤步骤，超滤步骤采用0.01-0.02微米的超滤膜进行超滤处理，超滤时的操作压力为0.2mpa。
进一步，作为优选，所述的步骤（2）中利用离心机离心的转速为6500r/min，离心时间为40min，所述的步骤（3）中利用离心机离心的转速为8000r/min，离心时间为20min。
进一步，作为优选，在超滤时，边搅拌边超滤，搅拌的速率为80r/min。
进一步，作为优选，在所述的步骤（6）中，真空冷冻干燥的冷冻温度为-40℃，冷冻时间为36h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用硫酸铵盐析和离子交换层析的方法对鸡蛋清中的卵转铁蛋白进行分离，以期建立从蛋清中提取卵转铁蛋白的工艺，为其开发利用奠定基础，其制备的冻干粉便于储藏、运输，也便于应用于天然的防腐剂和抗菌剂应用于各类食品，本发明的冷冻干粉也可以作为功能性成分添加到各类食品，或制成天然抗菌药物或高效补铁剂，以及用于化妆品中增强抗衰老功效，其应用前景十分广阔。此外，其还可以用于制备对治疗大肠杆菌、假单胞杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、李氏杆菌及衣原体等的治疗药物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种从鸡蛋中提取卵转铁蛋白来制备冻干粉的方法，其包括以下步骤：
（1）制备蛋清稀释液：将新鲜鸡蛋洗净，置于2℃下冷藏4h，然后将冷藏的鸡蛋进行分离蛋黄与蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清体积的水进行稀释，得到蛋清稀释液，并置于3℃的冰箱中冷藏3小时；
（2）分离卵粘蛋白：在蛋清稀释液中加入3mol/l的hcl调节ph至5.8，并用300r/min的搅拌机进行搅拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用离心机离心，离心机离心的转速为6500r/min，离心时间为40min，去除沉淀，得到上清液；
（3）调节ph：将步骤（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，调节ph至7.5，并用600r/min的搅拌机搅拌0.6h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用离心机离心，离心机离心的转速为8000r/min，离心时间为20min，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸铵沉淀：在所述步骤（3）的上清液中加入40%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置2h，然后利用5000r/min的离心机离心30min；然后，取上清液再加入85%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置1h，然后利用5500r/min的离心机离心20min；沉淀用蒸馏水溶解、透析脱盐；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液调节ph至8.2，然后在离心20min，取上清液；
（5）利用q-sepharosefastflow离子交换柱，用ph为8.2的hcl缓冲液平衡离子交换柱，然后，将步骤（4）得到的上清液以2.5ml/min的流速加入离子交换柱中，然后分别用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速进行分步洗脱，并收集含有卵转铁蛋白的洗脱液；
（6）将卵转铁蛋白的洗脱液进行浓缩、真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的冷冻温度为-40℃，冷冻时间为36h，之后研磨处理，即制得卵转铁蛋白冻干粉。
实施例二
一种从鸡蛋中提取卵转铁蛋白来制备冻干粉的方法，其包括以下步骤：
（1）制备蛋清稀释液：将新鲜鸡蛋洗净，置于3℃下冷藏6h，然后将冷藏的鸡蛋进行分离蛋黄与蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清体积的水进行稀释，得到蛋清稀释液，并置于3℃的冰箱中冷藏2小时；
（2）分离卵粘蛋白：在蛋清稀释液中加入3mol/l的hcl调节ph至5.8，并用350r/min的搅拌机进行搅拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用离心机离心，离心机离心的转速为6500r/min，离心时间为40min，去除沉淀，得到上清液；
（3）调节ph：将步骤（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，调节ph至7.5，并用800r/min的搅拌机搅拌1h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用离心机离心，离心机离心的转速为8000r/min，离心时间为20min，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸铵沉淀：在所述步骤（3）的上清液中加入40%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置2h，然后利用5000r/min的离心机离心30min；然后，取上清液再加入85%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置1h，然后利用5500r/min的离心机离心20min；沉淀用蒸馏水溶解、透析脱盐；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液调节ph至8.2，然后在离心20min，取上清液；
（5）微滤步骤，采用滤膜去除所述的步骤（4）得到的上清液中的30-80微米范围的杂质，微滤时的操作压力为0.1mpa，得到微滤液；
（6）利用q-sepharosefastflow离子交换柱，用ph为8.2的hcl缓冲液平衡离子交换柱，然后，将步骤（5）得到的微滤液以2.5ml/min的流速加入离子交换柱中，然后分别用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速进行分步洗脱，并收集含有卵转铁蛋白的洗脱液；
（7）将卵转铁蛋白的洗脱液进行浓缩、真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的冷冻温度为-40℃，冷冻时间为36h，之后研磨处理，即制得卵转铁蛋白冻干粉。
实施例三
一种从鸡蛋中提取卵转铁蛋白来制备冻干粉的方法，其包括以下步骤：
（1）制备蛋清稀释液：将新鲜鸡蛋洗净，置于3℃下冷藏5h，然后将冷藏的鸡蛋进行分离蛋黄与蛋清，取蛋清液，在蛋清液中加入等于蛋清体积的水进行稀释，得到蛋清稀释液，并置于3℃的冰箱中冷藏1小时；
（2）分离卵粘蛋白：在蛋清稀释液中加入3mol/l的hcl调节ph至5.8，并用450r/min的搅拌机进行搅拌5h，使得卵粘蛋白沉淀，之后利用离心机离心，离心机离心的转速为6500r/min，离心时间为40min，去除沉淀，得到上清液；
（3）调节ph：将步骤（2）得到的上清液中加入2mol/l的naoh溶液，调节ph至7.5，并用800r/min的搅拌机搅拌1h，然后，置于3℃的冰箱中冷置2h，之后用离心机离心，离心机离心的转速为8000r/min，离心时间为20min，去除沉淀，得到上清液；
（4）硫酸铵沉淀：在所述步骤（3）的上清液中加入40%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置2h，然后利用5000r/min的离心机离心30min；然后，取上清液再加入85%饱和度的硫酸铵，在4℃下静置1h，然后利用5500r/min的离心机离心20min；沉淀用蒸馏水溶解、透析脱盐；透析的蛋清液用3mol/l的naoh溶液调节ph至8.2，然后在离心20min，取上清液；
（5）微滤步骤，采用滤膜去除所述的步骤（4）得到的上清液中的30-80微米范围的杂质，微滤时的操作压力为0.1mpa，得到微滤液；
（6）超滤步骤，超滤步骤采用0.01-0.02微米的超滤膜对步骤（5）得到的微滤液进行超滤处理，超滤时的操作压力为0.2mpa，且要求在超滤时，边搅拌边超滤，搅拌的速率为80r/min，得到超滤液；
（7）利用q-sepharosefastflow离子交换柱，用ph为8.2的hcl缓冲液平衡离子交换柱，然后，将步骤（6）得到的超滤液以2.5ml/min的流速加入离子交换柱中，然后分别用含0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.1mol/l的nacl溶液以1ml/min的流速进行分步洗脱，并收集含有卵转铁蛋白的洗脱液；
（8）将卵转铁蛋白的洗脱液进行浓缩、真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的冷冻温度为-40℃，冷冻时间为36h，之后研磨处理，即制得卵转铁蛋白冻干粉。
本发明采用硫酸铵盐析和离子交换层析的方法对鸡蛋清中的卵转铁蛋白进行分离，以期建立从蛋清中提取卵转铁蛋白的工艺，为其开发利用奠定基础，其制备的冻干粉便于储藏、运输，也便于应用于天然的防腐剂和抗菌剂应用于各类食品，本发明的冷冻干粉也可以作为功能性成分添加到各类食品，或制成天然抗菌药物或高效补铁剂，以及用于化妆品中增强抗衰老功效，其应用前景十分广阔。此外，其还可以用于制备对治疗大肠杆菌、假单胞杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、李氏杆菌及衣原体等的治疗药物。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。