本发明涉及一种从十字花科蔬菜种子中提制异硫氰酸酯高纯品的方法，尤指一种先将原料加水研磨成浆并进行发酵处理，然后依次通过乙酸乙酯萃取、纳米膜初步纯化、聚酰胺树脂纯化、hp2mgl树脂再次纯化、结晶等提制工艺制备异硫氰酸酯高纯品的方法。
背景技术：
硫代葡萄糖苷，是植物中一类重要的次级代谢产物。异硫氰酸酯是十字花科蔬菜植物中广泛而大量存在的硫代葡萄糖苷在其黑芥子酶作用下而产生的酶解产物。研究表明，在成熟的芥菜、青花菜等蔬菜种子中硫代葡萄糖苷及其黑芥子酶含量居高，然而在正常蔬菜植物组织中，硫代葡萄糖苷与黑芥子酶是相互独立存在的，只有当蔬菜植物组织细胞受到破损，硫代葡萄糖苷与黑芥子酶相互接触后，才可发生酶促降解反应产生异硫氰酸酯。异硫氰酸酯具有辛辣刺激的味道，是韩国料理、日本料理、生食海鲜、凉拌菜、马肉等常用的调味料，也是辣根、芥末及其制品的有效成分，其含量高低是该类产品的主要质量指标之一。随着人们对保健、养生等的关注越来越多，在现代饮食结构和环境条件下如何挖掘利用天然生物活性成分来预防亚健康成为食品领域关注的焦点。研究表明，异硫氰酸酯具有抑菌、杀菌、抑制血小板聚集、防治肿瘤等多种生物活性，从而使得近年来异硫氰酸酯提取物及其功能产品成为国内外众多消费者的健康新宠，市场潜力巨大。
目前，异硫氰酸酯的提取方法主要有压榨法、水蒸气蒸馏法、超声波或微波辅助提取法、酶法辅助提取法等，分离纯化方法主要有溶剂萃取法、超临界流体萃取法、大孔树脂吸附法，低压硅胶柱色谱法、高速逆流色谱法等，但这些方法大多局限于单一技术及工艺对提取或分离纯化异硫氰酸酯效果的实验研究，同时因十字花科蔬菜植物组织器官中（包括种子）的硫代葡萄糖苷相比其物质成分来说，含量一般小于1%，并因蔬菜品种、生长环境、种植技术以及采摘部位的不同而存在显著差异，使得在提取制备异硫氰酸酯过程中，存在得率低、纯度不高、加工原料消耗大等技术瓶颈，如中国公开专利申请cn1405316a，提取制备的异硫氰酸酯粗提物不能满足功能性终端产品开发的质量要求，以及广大公众对异硫氰酸酯功能性终端产品的市场需求，建立一种适合于工厂化规模生产异硫氰酸酯高纯品的方法已成为该领域的当务之急。
为此，本发明以资源丰富、硫代葡萄糖苷含量较高的新鲜的成熟芥菜籽或青花菜籽为原料，先将该原料加水研磨成浆并进行发酵处理，然后创新集成乙酸乙酯萃取、纳米膜初步纯化、聚酰胺树脂纯化、hp2mgl树脂再次纯化、结晶等先进技术及工艺，取得了工厂规模化生产异硫氰酸酯高纯品的技术突破，创建了获得了高纯异硫氰酸酯提取物的方法，不仅为其药理药效的研究和功能性终端产品的开发提供优质原料，而且真正地实现了安全、简便、合理、经济的十字花科蔬菜种子资源的高值化利用，充分体现出绿色化学生产的理念和循环经济的策略。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述技术存在的不足，提供一种绿色高效、适合工业化生产的从十字花科蔬菜种子中提制异硫氰酸酯高纯品的方法，最大限度地提制蔬菜种子中的异硫氰酸酯，并显著提高异硫氰酸酯的得率和纯度。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种从十字花科蔬菜种子中提制异硫氰酸酯高纯品的方法，该方法步骤如下：
a、原料处理：取新鲜的成熟十字花科蔬菜种子，加去离子水研磨成浆，然后用重量比为2：1的柠檬酸与vc的混合物调节ph值为5.5～6.5，于50～60℃密封发酵16～20h，得发酵浆液；
上述原料处理中同时添加柠檬酸与vc混合物的目的，一方面是通过柠檬酸来调节发酵液的ph值，另一方面是通过vc来提高硫代葡萄糖苷酶解产生异硫氰酸酯的效率；其中，柠檬酸与vc的配方（0.5:1、1:1、1.5:1、2.0:1、2.5:1）以及发酵时的ph值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、温度（30、40、50、60、70℃）、时间（8、12、16、20、24h）的优化工艺技术参数是通过响应面法实验优化筛选获得。
b、乙酸乙酯萃取：于发酵浆液中加入1～1.4倍体积的乙酸乙酯，于摇匀时间25～35min，静置萃取温度20～30℃、时间50～70min下萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩，回收乙酸乙酯，真空冷冻干燥，得异硫氰酸酯粗提物；
c、纳米膜初步纯化：将上述所得异硫氰酸酯粗提物用去离子水配制成质量浓度为1.5～2.5%的溶液，先采用截留分子量为2000da的纳米膜进行纳滤分离，并在滤液重为滤前溶液重的80～90%时，加10～20%滤前溶液重的去离子水透析一次，收集滤液和透析液，合并为纳滤分离液，然后采用截留分子量为300da的纳米膜进行纳滤浓缩，收集纳滤浓缩液；
d、聚酰胺树脂纯化：将上述所得纳滤浓缩液加去离子水配制成质量浓度为1.5～2.5%的溶液，室温下，通过聚酰胺树脂层析柱进行异硫氰酸酯的分离纯化，得洗脱液，将洗脱液减压浓缩至固形物含量25～35%，回收食用乙醇，收集减压浓缩液；
e、hp2mgl树脂再次纯化：将上述所得减压浓缩液加去离子水配制成质量浓度为1.5～2.5%的溶液，室温下，通过hp2mgl树脂层析柱进行异硫氰酸酯的分离纯化，收集洗脱液，减压浓缩，回收食用乙醇，浓缩液趁热过滤，滤液结晶，过夜，最后真空冷冻干燥，即得异硫氰酸酯高纯品提取物。
上述步骤a中十字花科蔬菜种子选自芥菜籽或青花菜籽，去离子水的加入量为十字花科蔬菜种子重量的0.8～1.2倍。
上述步骤c中纳滤分离的温度为35～40℃，压力为2.4～2.8mpa，纳滤浓缩的温度为35～40℃，压力为2.8～3.2mpa。
上述步骤d中通过聚酰胺树脂层析柱进行异硫氰酸酯的分离纯化是将7～9bv的1.5～2.5%质量浓度的溶液以2.0～3.0bv/h的流速通过聚酰胺树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置30～50min，然后用3.0～4.0bv质量浓度为15～25%的食用乙醇以1.5～2.5bv/h的流速淋洗除去杂质，再用4～6bv质量浓度为60～80%的食用乙醇以1.0～2.0bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液。
上述步骤e中通过hp2mgl树脂层析柱进行异硫氰酸酯的分离纯化是将5～7bv1.5～2.5%质量浓度的溶液以1.5～2.5bv/h的流速通过hp2mgl树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置30～50min，然后用2.5～3.5bv质量浓度为25～35%的食用乙醇以1.0～2.0bv/h的流速淋洗除去杂质，再用3～5bv体积浓度为65～75%的食用乙醇以0.8～1.2bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液。
上述步骤b、步骤d和步骤e中减压浓缩的真空度为-0.05～-0.09mpa，温度为50～60℃。上述步骤b和步骤e中真空冷冻干燥的真空度为-0.05～-0.09mpa，温度为-38～-42℃。
上述步骤e中滤液结晶的温度为0～4℃。
上述乙酸乙酯萃取、纳米膜初步纯化、聚酰胺树脂纯化、hp2mgl树脂再次纯化的工艺技术参数均由单因素实验、正交实验及最优组合验证实验优化筛选。其中：
1)乙酸乙酯萃取是根据异硫氰酸酯与乙酸乙酯的分子极性相近、易溶于乙酸乙酯原理，利用乙酸乙酯方便简单地、最大限度地将异硫氰酸酯类物质从原料发酵浆液中萃取出来，并将不溶于乙酸乙酯的其它物质分离出去；其优化工艺技术参数是以异硫氰酸酯得率为考察指标，在研究分析单位体积原料浆液的乙酸乙酯使用量（1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2.0）、摇匀时间（10、20、30、40、50、60min；）、静置萃取时间（15、30、45、60、75、90min）、萃取温度（4、20、30、40、50、60℃）、萃取次数（1、2、3次）等单因素对异硫氰酸酯萃取效果的基础上，通过正交试验与最优组合验证实验优化筛选。
2)纳米膜初步纯化是基于异硫氰酸酯类物质的分子量大小，利用纳米膜的分子筛效应，通过选用合适膜孔径的纳米膜及纳滤工艺技术参数，最大限度地将大于或小于异硫氰酸酯类物质分子量的其它物质分别采用纳滤分离或纳滤浓缩分离出去，同时最大限度提高异硫氰酸酯的得率和纯度，为后续树脂分离纯化异硫氰酸酯高纯品提供优异的原料基质；其优化工艺技术参数是以异硫氰酸酯得率和纯度为考察指标，在研究分析料液质量浓度（0.5、1.5、2.5、3.5%）、纳米分离膜截留分子量（1000、2000、2500、3500da）、纳虑分离温度（30、35、40、45℃）、纳虑分离压力（2.0、2.4、2.8、3.2mpa）、透析量（10、20、30、40%）及透析次数（1、2次）以及纳米浓缩膜截留分子量（反渗膜、200、300da）、纳虑浓缩温度（30、35、40、45℃）、纳虑分离压力（2.4、2.8、3.2、3.6mpa）、透析量（10、20、30、40%）及透析次数（1、2次）等单因素对异硫氰酸酯萃取效果的基础上，通过正交试验与最优组合验证实验优化筛选。
3)聚酰胺树脂纯化的优化工艺技术参数是在比较研究d101、ads-7、ab-8、nka-9、hpd-400、hz16、hz816、hz906、hz806、聚酰胺等10种树脂对异硫氰酸酯静态吸附与解吸率的基础上，优选异硫氰酸酯得率最高的聚酰胺树脂，然后以异硫氰酸酯得率和纯度为考察指标，在研究分析上样料液质量浓度、上样体积、上样流速，淋洗除去杂质的静置时间、乙醇质量浓度、淋洗体积、淋洗流速，以及异硫氰酸酯洗脱乙醇质量浓度、洗脱体积、洗脱流速等单因素对异硫氰酸酯分离纯化效果的基础上，通过正交试验与最优组合验证实验优化筛选最优树脂聚酰胺的动态分离纯化异硫氰酸酯的工艺技术参数；
4)hp2mgl树脂再次纯化是为了获得纯度达95%以上异硫氰酸酯高纯品而必需对聚酰胺树脂纯化后获得的异硫氰酸酯进行再次纯化的工艺技术，其原因是虽然hp2mgl树脂与异硫氰酸酯的分子极性比聚酰胺树脂更相近，但研究发现由于纳滤浓缩液存在其它杂质较多，仅用hp2mgl树脂一次纯化，也不能获得95%以上异硫氰酸酯高纯品，而通过hp2mgl树脂再次纯化经聚酰胺树脂纯化后的异硫氰酸酯，则可获得95%以上异硫氰酸酯高纯品；其优化工艺技术参数是在比较研究ls300、ls300b、ls303、ls306、dm11、hz832、hp-20、hp2mgl等8种树脂对异硫氰酸酯静态吸附与解吸率的基础上，优选异硫氰酸酯得率最高的hp2mgl树脂；然后以异硫氰酸酯得率和纯度为考察指标，在研究分析上样料液质量浓度、上样体积、上样流速，淋洗除去杂质的静置时间、乙醇质量浓度、淋洗体积、淋洗流速，以及异硫氰酸酯洗脱乙醇质量浓度、洗脱体积、洗脱流速等单因素对异硫氰酸酯分离纯化效果的基础上，通过正交试验与最优组合验证实验优化筛选最优树脂hp2mgl的动态分离纯化异硫氰酸酯的工艺技术参数。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1、本发明以资源量大、硫代葡萄糖苷及内源黑芥子酶含量高但却通常作为蔬菜生产消费副产物而被废弃的芥菜籽或青花菜籽为原料，根据硫代葡萄糖苷酶解产生异硫氰酸酯的生化机制，通过在原料浆液中添加柠檬酸与vc配方混合物及优化发酵工艺技术参数，充分发挥内源黑芥子酶的作用，最大限度激发酶促反应，酶解产生异硫氰酸酯的效率显著提高，同时避免了利用外源黑芥子酶发酵存在加工成本增加、外源物质添加安全、酶解效率较低等问题。
2、本发明通过创新集成乙酸乙酯萃取、纳米膜初步纯化、聚酰胺树脂纯化、hp2mgl树脂再次纯化、结晶等先进技术及工艺，可最大限度确保分离纯化过程中异硫氰酸酯得率的同时，其纯度逐步提高，并最终获得了95%纯度以上异硫氰酸酯高纯品；同时本发明所使用的单个工艺技术均为适合于工厂规模化生产的成熟、共性技术，如果按本发明完整的工艺流程及技术参数进行应用，即可实现工厂规模化生产95%纯度以上异硫氰酸酯高纯品的突破，解决了传统生产方式得率低、纯度不高、加工原料消耗大等难题。
3、本发明推广应用，可大幅提高芥菜籽或青花菜籽等蔬菜资源的高值化利用效率，满足异硫氰酸酯功能性终端产品开发的质量要求，以及广大公众对异硫氰酸酯功能性终端产品的市场需求。
具体实施方式
实施例1
取新鲜的成熟芥菜籽，加入0.8倍重量的去离子水，研磨成浆，然后用质量比为2:1的柠檬酸与vc的混合物调节ph为5.5，塑料薄膜密封，于50℃发酵20h，得发酵浆液，于发酵浆液中加入1倍体积的乙酸乙酯，于摇匀时间25min、温度20℃、静置萃取时间70min条件下萃取2次，合并萃取液，于-0.09mpa、50℃下减压浓缩，回收乙酸乙酯，再于-0.05mpa、-42℃下真空冷冻干燥浓缩液，得异硫氰酸酯粗提物；将该粗提物用去离子水配制成质量浓度为1.5%的溶液，先采用截留分子量为2000da的纳米膜在35℃、2.8mpa条件下纳滤分离，并在滤液重量为滤前溶液重量的90%时，加入为滤前溶液重量10%的去离子水透析1次，合并滤液、透析液，然后采用截留分子量为300da的纳米膜在35℃、3.2mpa条件下进行纳滤浓缩，收集纳滤浓缩液；将纳滤浓缩液加去离子水配制成质量浓度为1.5%的溶液，室温下，将7bv该溶液以3.0bv/h的流速通过聚酰胺树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置50min，然后用3.0bv质量浓度为15%的食用乙醇以2.5bv/h的流速淋洗除去杂质，再用4bv质量浓度为60%的食用乙醇以2.0bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液，于-0.05mpa、60℃下减压浓缩至固形物含量为25.0%，回收食用乙醇，收集减压浓缩液；将上述减压浓缩液再加去离子水配制成质量浓度为1.5%的溶液，室温下，将5bv该溶液以1.5bv/h的流速通过hp2mgl树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置30min，然后用2.5bv质量浓度为25%的食用乙醇以2.0bv/h的流速淋洗除去杂质，再用3bv质量浓度为65%的食用乙醇以1.2bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液，于-0.05mpa、60℃下减压浓缩，回收食用乙醇，浓缩液趁热过滤，滤液结晶，过夜，最后于-0.05mpa、-42℃下真空冷冻干燥，即得异硫氰酸酯高纯品提取物。
经检测，该提取物的得率为发酵浆液中异硫氰酸酯总量的73.46%，纯度达98.12%。
实施例2
取新鲜的成熟芥菜籽，加入1.2倍重量的去离子水，研磨成浆，然后用质量比为2:1的柠檬酸与vc的混合物调节ph值为6.5，塑料薄膜密封，于60℃发酵16h，得发酵浆液，于发酵浆液中加入为发酵浆液1.4倍体积的乙酸乙酯，于摇匀时间35min、温度30℃、静置萃取时间50min下萃取2次，合并萃取液，于-0.05mpa、60℃下减压浓缩，回收乙酸乙酯，再于-0.09mpa、-38℃下真空冷冻干燥浓缩液，得异硫氰酸酯粗提物；将该粗提物用去离子水配制成质量浓度为2.5%的溶液，先采用截留分子量为2000da的纳米膜在40℃、2.4mpa条件下进行纳滤分离，并在滤液重量为滤前溶液重量的80%时，加入为滤前溶液重量20%的去离子水透析1次，合并滤液和透析液，然后采用截留分子量为300da的纳米膜在40℃、2.8mpa条件下进行纳滤浓缩，收集纳滤浓缩液；将纳滤浓缩液配制成质量浓度为2.5%的溶液，室温下，将9bv该溶液以2.0bv/h的流速通过聚酰胺树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置30min，然后用4.0bv质量浓度为20%的食用乙醇以1.5bv/h的流速淋洗除去杂质，再用6bv80%质量浓度的食用乙醇以1.0bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液，于-0.09mpa、50℃下减压浓缩至固形物含量为35.0%，回收食用乙醇，收集减压浓缩液；将上述减压浓缩液再加去离子水配制成质量浓度为2.5%的溶液，室温下，将7bv该溶液以2.5bv/h的流速通过hp2mgl树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置50min，然后用3.5bv质量浓度为35%的食用乙醇以1.0bv/h的流速淋洗除去杂质，再用5bv质量浓度为75%的食用乙醇以0.8bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液，于-0.09mpa、50℃下减压浓缩，回收食用乙醇，浓缩液趁热过滤，滤液结晶，过夜，最后于-0.09mpa、-38℃下真空冷冻干燥，即得异硫氰酸酯高纯品提取物。
经检测，该提取物的得率为发酵浆液中异硫氰酸酯总量的77.65%，纯度达95.76%。
实施例3
取新鲜的成熟青花菜籽，加入1.0倍重量的去离子水，研磨成浆，然后用质量比为2:1的柠檬酸与vc的混合物调节ph值为6.0，塑料薄膜密封，于55℃发酵18h，得发酵浆液；于发酵浆液中加入为发酵浆液1.2倍体积的乙酸乙酯，于摇匀时间30min、温度25℃、静置萃取时间60min下萃取2次，合并萃取液，于-0.07mpa、55℃下减压浓缩，回收乙酸乙酯，浓缩液于-0.07mpa、-40℃下真空冷冻干燥浓缩液，得异硫氰酸酯粗提物；将该粗提物用去离子水配制成质量浓度为2.0%的溶液，先采用截留分子量为2000da的纳米膜在37.5℃、2.6mpa条件下进行纳滤分离，并在滤液重为滤前溶液重的85%时，加入为滤前溶液重量15%的去离子水透析1次，合并滤液和透析液，然后采用截留分子量为300da的纳米膜在37.5℃、3.0mpa条件下进行纳滤浓缩，收集纳滤浓缩液；将纳滤浓缩液用去离子水配制成质量浓度为2.0%的溶液，室温下，将8bv该溶液以2.5bv/h的流速通过聚酰胺树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置40min，然后用3.5bv质量浓度为20%的食用乙醇以2.0bv/h的流速淋洗除去杂质，再用5bv质量浓度为70%的食用乙醇以1.5bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液，于-0.07mpa、55℃下减压浓缩至固形物含量为30%，回收食用乙醇，收集减压浓缩液；将上述减压浓缩液再用去离子水配制成质量浓度为2.0%的溶液，室温下，将6bv该溶液以2.0bv/h的流速通过hp2mgl树脂层析柱，使树脂吸附至饱和，静置40min，然后用3.0bv质量浓度为30%的食用乙醇以1.5bv/h的流速淋洗除去杂质，再用4bv质量浓度为70%的食用乙醇以1.0bv/h的流速洗脱异硫氰酸酯，收集洗脱液，于-0.07mpa、55℃下减压浓缩，回收食用乙醇，浓缩液趁热过滤，滤液结晶，过夜，最后于-0.07mpa、-40℃下真空冷冻干燥，即得异硫氰酸酯高纯品提取物。
经检测，该提取物的得率为发酵浆液中异硫氰酸酯总量的75.67%，纯度达97.84%。