一种低温制备的胶原蛋白水凝胶、其制备方法及应用与流程

本发明涉及功能性胶原蛋白水凝胶领域，尤其涉及一种低温下制备的胶原蛋白水凝胶、其制备方法及应用。

背景技术：

水凝胶作为生物医用材料，近年来受到了越来越多的应用，如药物载体、药物的递送及可控释放、医用敷料、抗菌涂层等。尤其是，水凝胶具有较好的原位保留特性，能够在病变部位长时间保留并实现有效分子的可控缓释，进而发挥保湿、抗菌、抗炎等特性，在化妆品(保湿、抗炎、祛痘)、医用敷料(抗菌、支架)等领域发挥重要的作用。同时，负载了功能性药物(如光敏剂、光热制剂、免疫因子等)的凝胶，能够实现诸如皮肤疾病、肿瘤、免疫病等的治疗。满足于生物学应用的水凝胶应具备以下性质：1)生物相容性高，安全无毒；2)性能稳定，能够原位保留且随时间降解；3)机械性能灵活，具有剪切变稀及自愈的特性。

胶原蛋白作为一种天然的高分子蛋白，是动物结缔组织的重要组成成分，因其出色的生物相容性、可降解性以及生物活性，被广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。高浓度的胶原蛋白能够自发形成凝胶，但其机械性能极差且降解速率过快，不能够满足于生物医学的应用。为了提高胶原蛋白凝胶的机械性能，目前多采用化学交联剂(如戊二醛)等与胶原蛋白进行化学交联，从而提高其黏弹模量。但是交联剂引发的凝胶形成过程是不可逆的，而且化学还原试剂的添加会造成不可避免的生物毒性。

目前基于胶原蛋白的凝胶制备方法已公开数种。已公开将胶原蛋白与壳聚糖酸或透明质酸钠溶液混合后，37℃放置便可迅速形成凝胶(专利申请公开号cn102229705a)。但此方法制备的凝胶机械性能不足，且提出对部分使用者仍存在使用部位红肿、过敏及降解过快等情况。此外，通过添加化学交联剂(如碳二亚胺即edc,专利申请公开号cn101543643a)或促凝胶特性的制剂(如卡拉胶，专利申请公开号cn103655336及cn102108211a；卡波姆，专利申请公开号cn102688181a)，进而实现凝胶的形成。但通过此种策略得到的胶原蛋白凝胶虽具有较好的增稠性，但存在不溶物含量高且粘度不易调控，剪切性能不足等缺点。

通过调控分子间的弱相互作用，如氢键作用、疏水作用、静电相互作用等，能够实现对胶原蛋白凝胶状态的调节，采用此类方法制备的胶原蛋白凝胶具有较好的凝胶-溶胶可逆性以及增强的机械性能，扩展了胶原蛋白凝胶的应用。此低温条件下制备胶原蛋白水凝胶的方法，能够最大程度的保持胶原蛋白的生物活性。相较于室温或苛刻条件形成的胶原蛋白水凝胶，具有更优的性能。

技术实现要素：

针对已有技术的问题，本发明提供了一种低温条件下制备的胶原蛋白水凝胶、其制备方法及应用，所述胶原蛋白水凝胶能够在低温下形成凝胶，其制备方法简便、绿色，制备得到的凝胶性能稳定，安全无毒，具有较好的包覆性能，可应用于日用化妆品、医用辅料、生物医药、组织修复等领域。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种低温胶原蛋白水凝胶，所述胶原蛋白水凝胶包含胶原蛋白及天然高分子,所述的胶原蛋白水凝胶处于5℃以下，-20℃以上。

优选地，所述的胶原蛋白包括人、牛、羊、猪、驴、禽类、水产动物等的皮肤、牛跟腱、骨组织等部位提取的胶原蛋白、明胶、水解胶原蛋白、胶原多肽等中的一种或两种以上的混合物。进一步优选地，所述胶原蛋白为小牛皮肤胶原蛋白、深海鱼皮蛋白中的一种或其混合物；

优选地，所述的天然高分子包括海藻酸钠、多聚赖氨酸、透明质酸、软骨素、壳聚糖、肝素等。优选地，从提高凝胶性能的角度考虑，所述的天然高分子为带有相反电荷的海藻酸钠、透明质酸。

第二方面：本发明提供第一方面所述的低温胶原蛋白水凝胶，其特征在于其在常温下不形成稳固凝胶，在低温下形成不流动的凝胶。

第三方面：本发明提供第二方面所述的低温胶原蛋白水凝胶，其特征在于所述的胶原蛋白凝胶中胶原蛋白与生物高分子的质量含量分别为0.1-1％，1-15％,其余为水分。

第四方面：本发明提供第三方面所述的低温胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配置胶原蛋白水溶液，将胶原蛋白粉末称量后置于干净容器，用醋酸水溶液对胶原蛋白进行浸泡，涡旋或轻微超声加速其溶解。所述醋酸水溶液中胶原蛋白的体积质量分数为0.1-100mgkg^-1,优选地，其体积质量分数为1-10mgkg^-1；

(2)配置生物高分子水溶液，将高分子称量后置于干净容器，用双重蒸馏水进行溶解，涡旋或搅拌加速其溶解。所述水溶液中生物高分子的体积质量分数为0.1-50mgkg^-1,优选地，其体积质量分数为0.1-20mgkg^-1；

(3)将步骤(1)配置的胶原蛋白与步骤(2)生物高分子混合，搅拌均匀。胶原蛋白与生物高分子的体积质量分数比为100:1-1:100,优选地，其体积质量分数比为10:1-1:50；

(4)将步骤(3)所得混合溶液的ph值调节为6.2-7.5。所述ph值通过加入碱性物质或酸性物质进行调节：

优选地，所述碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等的任意一种或两种以上的混合物；

优选地，所述酸性物质为盐酸、硫酸、硝酸等中的任意一种或两种以上的混合物。

(5)将步骤(4)得到的混合溶液置于低温老化一定的时间。所述的低温为-10℃-10℃，优选地，所述的低温为-5℃-5℃；所述的老化时间为4h-72h，优选地，所述的老化时间为12h-24h。

第六方面：根据第五方面所述的覆功能性分子的低温胶原蛋白水凝胶，其特征在于，所述功能性分子包括：化妆品添加因子、抗菌制剂、光敏/光热制剂、化疗药物、免疫因子等；所述化妆品添加因子包括：氨基酸、小分子活性肽、维生素(a、c、b5)、植物提取精华物如玫瑰精华、茶树精油)、祛痘抗炎成分(如水杨酸、过氧化苯酰、三氯沙、雷索辛)；所述抗菌制剂包括：金属离子(如ag⁺，zn²⁺、cu²⁺)、纳米金属粒子(如银、铜、锌等)、金属化合物及氧化物(如氧化锌、氧化铜、磷酸二氢铵、碳酸锂等)、天然抗菌剂(如蓖麻油、山葵、甲壳素等)、有机抗菌剂(如聚乙烯、咪唑类、噻唑类、异噻唑酮衍生物、季铵盐类、双呱类、酚类)、抗生素(包括内酰胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等)；所述的光敏/光热制剂包括：金属纳米粒子(如纳米金、银、钯等)、半导体材料(如铜基半导体等)、有机染料(如卟啉类、酞菁类、花菁类等)、碳材料(如石墨烯等)、其它(如黑磷、聚苯胺类等)；所述化疗药物包括紫杉醇、阿霉素、喜树碱、尼莫司汀、卡莫司汀、安西他滨、长春新碱等。所述功能性分子为上述一种或至少两种的混合物。

第七方面，第五方面或第六方面所述的包覆功能性分子的低温胶原蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配置胶原蛋白水溶液，将胶原蛋白粉末称量后置于干净容器，用醋酸水溶液对胶原蛋白进行浸泡，涡旋或轻微超声加速其溶解。所述醋酸水溶液中胶原蛋白的体积质量分数为0.1-100mgkg^-1,优选地，其体积质量分数为1-10mgkg^-1；

(2)配置生物高分子水溶液，将高分子称量后置于干净容器，用双重蒸馏水进行溶解，涡旋或搅拌加速其溶解。所述水溶液中生物高分子的体积质量分数为0.1-50mgkg^-1,优选地，其体积质量分数为0.1-20mgkg^-1；

(3)将步骤(1)配置的胶原蛋白与步骤(2)生物高分子混合，搅拌均匀。胶原蛋白与生物高分子的体积质量分数比为100:1-1:100,优选地，其体积质量分数比为10:1-1:50；

(4)向步骤(3)得到的混合溶液中加入功能性分子后搅拌均匀，所述功能性分子体积质量浓度为0.1-100mgml^-1，优选地，为0.1-10mgml-1。

(5)将步骤(4)所得混合溶液的ph值调节为6.2-7.5。所述ph值通过加入碱性物质或酸性物质进行调节：

优选地，所述碱性物质为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等的任意一种或两种以上的混合物；

优选地，所述酸性物质为盐酸、硫酸、硝酸等中的任意一种或两种以上的混合物。

(6)将步骤(5)得到的混合溶液置于低温老化一定的时间。所述的低温为-10℃-10℃，优选地，所述的低温为-5℃-5℃，进一步优选为0-4℃；所述的老化时间为4h-72h，优选地，所述的老化时间为6h-36h，进一步优选为12-24h。最终得到包覆了功能性分子的低温胶原蛋白水凝胶。

第八方面：本发明提供一种如第一方面所述的低温胶原蛋白水凝胶或如第五方面所述的包覆了功能性分子的低温胶原蛋白水凝胶在制备化妆品、生物敷料、药物递送及药控释放、光动力/光热疾病治疗制剂、化疗药物、免疫调节剂等中的任意一种领域或至少两种领域的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的胶原蛋白水凝胶性能均一且稳定，具有灵活可控的机械性能(如在外力作用下，能够表现出较好的流动性。被破坏后静置，又可恢复至原有凝胶状态，即剪切变稀及自愈的特性)，所制备的凝胶性能可逆。此外，有效的解决了胶原蛋白的降解过快的缺点，能够实现凝胶的较长时间缓慢降解；

(2)本发明的胶原蛋白水凝胶无需添加化学交联剂及凝胶促成剂，利用了低温条件下，分子之间弱相互作用的增强，制备方法简便且具有普适性。制备的凝胶生物相容性好，且安全性能高，满足于美容护肤、祛痘抗炎、组织工程、生物药物等的应用。

(3)本发明的胶原蛋白水凝胶具有强大的包覆性能，进而实现多种功能性分子的装载，拓宽了此胶原蛋白凝胶的应用范围。此外，此凝胶可同时包覆两种以上功能性分子，联合多种功效，更好的发挥作用。

附图说明

图1为实例1制备的胶原蛋白水凝胶的实物图，图1a为室温下的样品状态，图1b为低温下的样品状态。在室温下呈现可流动状态，在低温下呈现不可流动的水凝胶状态；

图2为实例2制备的低温胶原蛋白水凝胶的微管结构透射电镜图片，呈现薄的片状；

图3为实例3制备的低温胶原蛋白水凝胶的流变学行为，其中a)给予所制备的凝胶逐渐增强的剪切力，观察其粘性模量及弹性模量的变化，发现当剪切力增加至150％时，粘弹模量得以翻转，预示着凝胶已转变为凝胶，说明了所制备的凝胶具有较好的剪切变稀的特性；b)给予凝胶一个较为温和的剪切力(10％)，改变其角频率，发现所制备的凝胶具有较好的粘弹区间；c)给予所制备的凝胶一定的剪切速率，观察其剪切段及恢复段的粘度变化，发现最终几乎恢复至原始值，说明所制备的凝胶具有较高的恢复性能；

图4为实例4制备的包覆了icg的低温胶原蛋白水凝胶的实物图及注射器注射结果。表明，icg的添加，未影响凝胶的状态，所制备的凝胶具有较好的可注射性能，有利于生物医学方面的应用；

图5为实例5制备的包覆了mb的低温胶原蛋白水凝胶在特定波长(630nm，0.6wcm^-2)激光的照射下，肿瘤原位温度的升高。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

称量5mg透明质酸粉末加入到10ml水中，机械搅拌，得透明质酸溶液；称量14mg小牛皮胶原蛋白溶于10ml的0.2m醋酸溶液中，混匀静置，得小牛皮胶原溶液；将小牛皮胶原溶液加入到透明质酸溶液中混匀，调节ph至6.8并机械搅拌10分钟，将上述混合溶液放置-10℃低温环境下，静置12h，得小牛皮胶原水凝胶。

所得到的胶原蛋白水凝胶倒置不流动，且外观透明均一，如图1所示。

实施例2

室温下，将2mg用0.2m醋酸溶液溶解的海洋动物提取的胶原蛋白加入到20mgml^-1的海藻酸钠水溶液中，搅拌均匀，调节其ph值至7.2，置于0℃环境中静置24h后取出，得胶原蛋白水凝胶。室温下放置，凝胶不溶解或变化。凝胶的微观结构如图2所示，呈现出较为均匀的薄层结构。

实施例3

称取胶原蛋白粉末5mg置于干净容器，用醋酸水溶液对胶原蛋白进行浸泡，涡旋或轻微超声将其溶解，浓度为10mgml^-1。配置壳聚糖水溶液，称取壳聚糖10mg称量后置于干净容器，用双重蒸馏水进行溶解，涡旋加速其溶解，浓度为20mgkg^-1，配置阿霉素水溶液200mgml^-1备用。将胶原蛋白与壳聚糖混合均匀，再向上述混合溶液中加入100ul上述阿霉素溶液，混合后调节ph至6.2。将上述溶液置于4℃冰箱上层老化36h。最终得到包覆了化疗药物阿霉素的低温胶原蛋白水凝胶。

其流变性为结果如图3所示，表明此凝胶具有较好的剪切变稀特性(图3a-b)及可恢复性能(图3c)。

实施例4

配置牛跟腱胶原蛋白醋酸溶液1mgml^-1，多聚赖氨酸水溶液50mgml^-1，吲哚菁绿(icg)碱溶液3mgml^-1。将上述组分以3:10:1混合均匀，混合后调节ph至7.0。将上述溶液置于-5℃老化12h。最终得到包覆光热制剂icg的低温胶原蛋白水凝胶。该凝胶的实物图如图4所示，呈现均一的绿色凝胶，此凝胶具有较好的可注射性能。

实施例5

配置深海鱼皮胶原蛋白醋酸溶液5mgml^-1，海藻酸钠水溶液50mgml^-1，亚甲基蓝(mb)水溶液10mgml^-1。将上述组分以5:10:1混合均匀，混合后调节ph至7.2。将上述溶液置于0℃冰箱层老化24h。最终得到包覆光热制剂mb的低温胶原蛋白水凝胶。该凝胶通过瘤内注射入小鼠的肿瘤部位，在特定的激光照射下(0.6w/cm²)，能够实现肿瘤原位温度的升高。如图5所示。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。