本发明涉及生物胶原蛋白制备的
技术领域：
，具体涉及一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法。
背景技术：
：胶原蛋白是动物细胞合成的一种天然生物高分子，广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极其主要的结构蛋白，起着支持结构器官、保护机体的作用。胶原蛋白具有稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低。目前，常用的提取方式有化学法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质的方法。现有技术如专利号为cn201710823158.2的中国发明专利，公开了牛骨胶原蛋白肽提取方法，包含如下步骤，一、破骨；二、上料清洗；三、上料蒸煮、排汤；四、水解过滤；五、浓缩；六、干燥喷粉；充分利用牛骨，经过深加工使得其内部不易被施放的一些营养物质都被充分释放，能够为人体利用。又如专利号cn201710904024.3的中国发明专利，公开了从动物硬质骨中采用酸-酶结合提取i型胶原蛋白的方法，包括以下步骤：步骤一、对骨原料进行前处理，之后用盐酸进行脱钙处理，盐酸浓度0.01～0.02mol/l，浸泡时间为10～12h；脱钙处理之后清洗至ph3～5；步骤二、加热蒸煮，蒸煮温度90～95℃，2～3h；步骤三、冷却，加入蛋白酶酶解，蛋白酶为胃蛋白酶，添加量为骨原料的3～5‰，酶解温度为50～55℃，酶解时间5～7h，保持在ph5～7；步骤四、分离得到酶解液；步骤五、后处理，得到骨i型胶原蛋白粉。本发明提取i型胶原蛋白，提升了可食性骨的利用价值；本发明的制备方法简单、生产效率高；采用脱色脱盐工艺所的产品色泽洁白、纯度高。现有技术中，酸法因强酸反应剧烈、设备腐蚀严重，碱法因发生消旋反应，已不适用于工业化应用。酶法提取是控制一定的温度和ph，用蛋白酶酶解原料，经过除杂精滤提取胶原蛋白，周期短，1-24h结束，蛋白收率高，氨基酸破坏少，且环境友好，缺点是分子量分布广、成本高、杂蛋白较多。因此，研究一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法具有重要意义。技术实现要素：本发明为解决上述技术问题，本发明提供了一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法。具体按照以下技术方案实现：一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入乙醇溶液，通气至温度为110-130℃后，停止通气并调整压力为80-95mpa条件下，密闭反应1-2h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入酸性溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理10-15min后，密闭反应釜处理20-30min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理60-90s后，密闭反应釜处理20-30min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白。所述柠檬酸溶液的质量浓度为7-10％。所述乙醇溶液的加入量为洗净牛骨质量4-7倍。所述乙醇溶液的质量浓度为45-50％。所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为(3-5):1。所述酸性溶液为质量浓度为55-65％的有机酸溶液。所述有机酸由如下重量份计物质组成：8-11份乳酸、4-7份酒石酸、1-2份没食子酸、2-5份醋酸。所述酸性溶液的加入量为洗净牛骨质量5-6倍。所述超高压撞击流处理中压力为180-230mpa，撞击距离为2-4mm。所述高压脉冲电场处理中电场强度为10-14kv/cm，脉冲数为10-15。所述超滤膜的分子量为0.1-0.7万道尔顿。本发明的有益效果在于：利用本发明方法提取胶原蛋白，胶原蛋白的纯度在98％以上，胶原蛋白的得率在90％以上，改善了胶原蛋白的生物活性，提高人体吸收利用率达98.5％以上，并且提取时间短。首先，本发明利用柠檬酸处理牛骨，清除牛骨表面油脂和钙质成分；其次，本发明在制浆过程中利用乙醇及通气处理，使得钙元素等杂质成分从水相转移到有机相，提高胶原蛋白的产率和纯度；最后，利用酸性溶液提取胶原蛋白，结合超高压撞击流，有效破坏胶原蛋白的稳定结构，结合高压脉冲电场，产生电磁效应，缩短提取时间，并且胶原分子链不会被打断，进而不会使得胶原分子降解，改善了胶原蛋白的生物活性。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。实施例1一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为10％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量7倍、质量浓度为50％的乙醇溶液，通气至温度为130℃后，停止通气并调整压力为95mpa条件下，密闭反应2h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为65％的有机酸溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理15min后，密闭反应釜处理30min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理90s后，密闭反应釜处理30min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为5:1；所述有机酸由如下物质组成：11kg乳酸、7kg酒石酸、2kg没食子酸、5kg醋酸；所述有机酸溶液的加入量为洗净牛骨质量6倍；所述超高压撞击流处理中压力为230mpa，撞击距离为4mm；所述高压脉冲电场处理中电场强度为14kv/cm，脉冲数为15；所述超滤膜的分子量为0.7万道尔顿。实施例2一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为7％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量4倍、质量浓度为45％的乙醇溶液，通气至温度为110℃后，停止通气并调整压力为80mpa条件下，密闭反应1h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为55％的有机酸溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理10min后，密闭反应釜处理20min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理60s后，密闭反应釜处理20min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为3:1；所述有机酸由如下物质组成：8kg乳酸、4kg酒石酸、1kg没食子酸、2kg醋酸；所述有机酸溶液的加入量为洗净牛骨质量5倍；所述超高压撞击流处理中压力为180mpa，撞击距离为2mm；所述高压脉冲电场处理中电场强度为10kv/cm，脉冲数为10；所述超滤膜的分子量为0.1万道尔顿。实施例3一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为8％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量5倍、质量浓度为48％的乙醇溶液，通气至温度为120℃后，停止通气并调整压力为85mpa条件下，密闭反应1.5h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为60％的有机酸溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理12min后，密闭反应釜处理25min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理75s后，密闭反应釜处理25min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为4:1；所述有机酸由如下物质组成：9.5kg乳酸、5kg酒石酸、1.5kg没食子酸、3kg醋酸；所述有机酸溶液的加入量为洗净牛骨质量5.6倍；所述超高压撞击流处理中压力为200mpa，撞击距离为3mm；所述高压脉冲电场处理中电场强度为12kv/cm，脉冲数为12；所述超滤膜的分子量为0.5万道尔顿。实施例4一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨50kg用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为9％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量6倍、质量浓度为50％的乙醇溶液，通气至温度为120℃后，停止通气并调整压力为90mpa条件下，密闭反应1h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为60％的有机酸溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理10min后，密闭反应釜处理25min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理60s后，密闭反应釜处理20min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为3.5:1；所述有机酸由如下物质组成：10kg乳酸、6kg酒石酸、2kg没食子酸、4kg醋酸；所述有机酸溶液的加入量为洗净牛骨质量5.5倍；所述超高压撞击流处理中压力为205mpa，撞击距离为3mm；所述高压脉冲电场处理中电场强度为13kv/cm，脉冲数为10；所述超滤膜的分子量为0.4万道尔顿。对比例1一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨50kg用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为9％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量6倍、质量浓度为50％的乙醇溶液，通气至温度为120℃后，停止通气并调整压力为90mpa条件下，密闭反应1h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为60％的有机酸溶液混合均匀，并经密闭反应釜处理25min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理60s后，密闭反应釜处理20min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为3.5:1；所述有机酸由如下物质组成：10kg乳酸、6kg酒石酸、2kg没食子酸、4kg醋酸；所述有机酸溶液的加入量为洗净牛骨质量5.5倍；所述高压脉冲电场处理中电场强度为13kv/cm，脉冲数为10；所述超滤膜的分子量为0.4万道尔顿。对比例2一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨50kg用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为9％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量6倍、质量浓度为50％的乙醇溶液，通气至温度为120℃后，停止通气并调整压力为90mpa条件下，密闭反应1h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为60％的有机酸溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理10min后，密闭反应釜处理45min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为3.5:1；所述有机酸由如下物质组成：10kg乳酸、6kg酒石酸、2kg没食子酸、4kg醋酸；所述有机酸溶液的加入量为洗净牛骨质量5.5倍；所述超高压撞击流处理中压力为205mpa，撞击距离为3mm；所述超滤膜的分子量为0.4万道尔顿。对比例3一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨50kg用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为9％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量6倍、质量浓度为50％的乙醇溶液，通气至温度为120℃后，停止通气并调整压力为90mpa条件下，密闭反应1h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为60％的盐酸溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理10min后，密闭反应釜处理25min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理60s后，密闭反应釜处理20min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为3.5:1；所述盐酸溶液的加入量为洗净牛骨质量5.5倍；所述超高压撞击流处理中压力为205mpa，撞击距离为3mm；所述高压脉冲电场处理中电场强度为13kv/cm，脉冲数为10；所述超滤膜的分子量为0.4万道尔顿。对比例4一种牛骨中高纯胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：s1将新鲜牛骨50kg用清水洗净后去除其表面的肉渣，然后用质量浓度为9％的柠檬酸溶液洗净；s2将洗净牛骨放入反应器中加入洗净牛骨质量6倍、质量浓度为50％的乙醇溶液，通气至温度为120℃后，停止通气并调整压力为90mpa条件下，密闭反应1h后，再高速搅拌形成浆状，过60目筛，获得牛骨浆；s3用高压均质机处理牛骨浆，物料从限流缝隙中喷出，湍流剪切，碰撞，使物料超细化成极小的颗粒，形成均匀的牛骨浆；s4向牛骨浆中加入质量浓度为60％的动物蛋白酶溶液混合均匀，并经超高压撞击流处理10min后，密闭反应釜处理25min后，将混合溶液经高压脉冲电场处理60s后，密闭反应釜处理20min后，利用压滤机进行固液体分离，获得提取液；s5将提取液经超滤处理，收集超滤液，经喷雾干燥即得胶原蛋白；所述通气是指氮气与二氧化碳混合气体，其中，氮气与二氧化碳的用量比为3.5:1；所述动物蛋白酶溶液的加入量为洗净牛骨质量5.5倍；所述超高压撞击流处理中压力为205mpa，撞击距离为3mm；所述高压脉冲电场处理中电场强度为13kv/cm，脉冲数为10；所述超滤膜的分子量为0.4万道尔顿。试验例准确称取5.0mg的羟脯氨酸溶于少量水中，定容至100ml，浓度为0.05mg/ml的标准溶液，然后取标准溶液0.05、0.125、0.25、0.375、0.5ml，分别加入0.1mol/l醋酸钠至1ml，利用高效液相色谱法测定吸光度，绘制标准曲线；然后取实施例4以及对比例1-4的样品5.0mg，然后配置0.05mg/ml的样品溶液，利用高效液相色谱法测定吸光度并结合标准曲线，得到胶原蛋白含量，并且计算胶原蛋白提取率和纯度，其中，胶原蛋白提取率＝(样品中胶原蛋白重量×样品重量)/(牛骨胶原蛋白重量×牛骨重量)；胶原蛋白纯度＝样品中胶原蛋白重量/样品重量；结果如表1所示：表1实施例4对比例1对比例2对比例3对比例4提取率(％)93.286.580.395.490.5纯度(％)98.694.195.789.488.3试验例2对实施例1-实施例4进行重金属含量的测定：无机砷、总砷按照gb/t5009.11《食品中总砷及无机砷的测定》进行检测，铅(以pb计)按照gb5009.12《食品中铅的测定》进行检测，镉(以cd计)按照gb/t5009.15《食品中镉的测定》进行检测，汞(以甲基汞计)按照gb/t5009.17《食品中总汞及有机汞的测定》进行检测，结果如表2所示：表2实施例1实施例2实施例3实施例4无机砷(mg/kg)0.120.080.100.07总砷(mg/kg)0.230.180.200.15镉(mg/kg)<0.01<0.01<0.01<0.01铅(mg/kg)0.030.050.050.04汞(mg/kg)<0.01<0.01<0.01<0.01当前第1页12