利用咸味受体筛选咸味增强剂的方法与流程

本发明主要涉及一种筛选咸味增强剂的方法、咸味增强剂、以及对高盐浓度具有适口性的模式动物。
背景技术：
：味觉是五种感觉之一并被分布在口腔内上皮的味蕾所接受。其刺激是通过鼓索神经和舌咽神经传递至大脑的味觉区域而被识别的。作为味觉的主要类型，已知有五种基本的味道(甜味、鲜味、苦味、酸味以及咸味)。对于甜味、鲜味和苦味，已知ii型味觉细胞中的g蛋白偶联受体(gpcr)是受体。对于酸味，通过使用白喉毒素的实验发现，酸味受体存在于iii型细胞中，然而尚未阐明其主要受体。咸味是盐的味道(主要成分是氯化钠(nacl))，并且是当nacl溶解于口腔中离子化的na+离子和cl-离子由舌头感知到时产生的味觉。作为起咸味受体分子作用的分子，就阳离子而言，据报道有上皮钠通道(epithelialsodiumchannel：enac)αβγ(一种阿米洛利敏感(as)上皮na+通道)在舌前部菌状乳头i型细胞中以异源三聚体的形式表达并用以接受低浓度盐(适口性)(非专利文献1)。另外，作为高浓度盐(排斥性)受体分子，列举了trpv1t作为候选物，其是瞬时受体电位阳离子通道亚家族v成员1(transientreceptorpotentialcationchannelsubfamilyvmember1：trpv1)的剪接变体(splicingvariant)(非专利文献2)。另外，还没有关于接受阴离子cl-的分子的报道。由于enacαβγ在菌状乳头i型细胞中表达，因此认为咸味是被i型味觉细胞接受的。然而，最近有一种理论认为咸味是通过ii型细胞和iii型细胞共轭而接受的，至于哪些细胞接受了咸味则尚无定论(非专利文献3)。nacl是生物的重要营养成分并且在人体的体内平衡中起着各种各样的功能，例如水分平衡、ph调节、渗透压和神经传导等。然而，人们认为过量摄入na+与胃癌或高血压的风险密切相关，并且希望减少从食物中摄入的盐量。当为了这个目的而简单地减少食物中含有的nacl时，食物味道会变得太淡而无法得到满足感。因此，需要开发一种咸味增强剂，该咸味增强剂能够通过寻找咸味受体并使该咸味受体活化从而在保持盐浓度不改变的情况下使咸味增强。现有技术文献非专利文献非专利文献1：chandrashekaretal.,nature.2010mar.11；464(7286)：297-301非专利文献2：lyalletal.,jphysiol.2004jul.1；558(pt1)：147-159非专利文献3：okaetal.,nature.2013feb.28；494(7438)：472-475技术实现要素：发明所要解决的问题本发明的目的在于提供一种筛选咸味增强剂的方法、咸味增强剂、以及对高盐浓度具有适口性的模式动物。解决问题的方法本发明人进行了认真的研究以解决上述问题，结果发现，一种功能未知的tmc4蛋白与咸味的接受有关。本发明就是基于该发现进行反复改良而实现的。具体地，本发明提供了下述技术方案的发明。项1.一种筛选咸味增强剂有效成分的方法，其包括以下步骤：(i)确定被检物质是否为能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物；以及(ii)选择在步骤(i)中确定为能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物的被检物质作为咸味增强剂的有效成分。项2.一种咸味增强剂，其包含能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物。项3.如项2所述的咸味增强剂，其中，所述化合物是源自食品的成分。项4.一种对高盐浓度具有适口性的模式动物，其中所述模式动物是tmc4基因被敲除的非人动物。项5.如项4所述的模式动物，其中，所述模式动物是小鼠。发明的有益效果本发明提供了一种新型筛选咸味增强剂方法、以及咸味增强剂。本发明提供的咸味增强剂可以在抑制盐浓度的情况下强劲地感觉到咸味，因此可以在饮食中获得充分的满足感。另外，本发明的筛选方法和模式动物可用作研究和开发的工具，并且能够为食品工业和健康科学的进一步发展做出贡献。附图说明图1示出了通过原位杂交所获得的染色图像。cvp：轮廓乳头(circumvallatepapillae)；fop：叶状乳头(foliatepapillae)；fup：菌状乳头(fungiformpapillae)；比例尺：50μm。图2示出了全细胞膜片钳测定(wholecellpatchclampassay)的结果。图3示出了简短访问测试(briefaccesstest)的结果。图4示出了使用咸味增强剂盐酸精氨酸(arg-hcl)测定咸味增强效果的结果。图5示出了使用不影响咸味的蔗糖和麦芽糖进行咸味增强效果测定的结果。具体实施方式tmc4基因和tmc4蛋白tmc(transmembranechannellike：跨膜通道样)4基因是已知基因，且tmc4蛋白是已知蛋白。tmc4蛋白是一种tmc蛋白。tmc蛋白是具有八个跨膜结构域的膜蛋白，并且在细胞中包括n-端和c-端。tmc蛋白在tm5和tm6之间有一个公共区域，称为tmc基序。在哺乳动物中，tmc蛋白从序列上看属于anoctamin家族。美国国家生物技术信息中心(ncbi：nationalcenterforbiotechnologyinformation)的genbank登录了tmc4基因的cdna的核苷酸序列和tmc4蛋白的氨基酸序列，例如人(homosapiens：智人)和小鼠(musmusculus：小家鼠)，登录号如下(应该理解的是，当登录有多个修订版本时是指出最新修订版本)：人tmc4基因：nm_001145303(nm_001145303.2)、nm_144686(nm_144686.3)、bc025323(bc025323.1)人tmc4蛋白：np_001138775(np_001138775.2)、np_653287(np_653287.2)小鼠tmc4基因：nm_181820(nm_181820.2)小鼠tmc4蛋白：np_861541(np_861541.2)咸味增强剂本发明的咸味增强剂包含能够上调tmc4基因或tmc4蛋白功能表达化合物。本发明中的术语“咸味增强剂”是指本身不具有咸味但具有增强同时存在的氯化钠(nacl，食盐)的咸味的作用的物质。作为能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物，可以使用任何化合物，只要是tmc4基因或tmc4蛋白功能表达能够上调即可。能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物的实例包括但不限于，tmc4蛋白的特异性激活剂和能够上调tmc4基因表达的核酸。术语“上调tmc4基因或tmc4蛋白功能表达”在本说明书中是指tmc4基因或tmc4蛋白功能表达的所有方面都是上调的，并且实例包括但不限于，tmc4蛋白功能的激活、以及tmc4蛋白(例如tmc4基因转录的上调、或tmc4蛋白翻译的上调)表达的上调。作为激活tmc4蛋白的功能的一例包括：以被视为cl-离子通道的tmc4蛋白为介的cl-离子向细胞内流入的促进。本发明优选方案之一是tmc4蛋白激动剂。术语“能够上调tmc4基因的表达”例如可以举出但不限于，tmc4蛋白表达水平通过促进tmc4基因的转录、促进翻译成tmc4蛋白等(即，tmc4蛋白的表达水平增加的方面)而上调的方面。作为能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物，例如可以通过下述筛选方法获得。作为能够上调tmc4蛋白的功能表达的化合物可以单独使用或组合两种以上使用。本发明的咸味增强剂，例如能够以食物(食物组合物)的形式提供。或者也能够以源自食物的成分的形式提供，例如食物的代谢产物或者通过化学或物理方法分解的产物(例如糖、氨基酸、肽、脂质或者它们中的任意复合物)。当本发明的咸味增强剂是以食物组合物的形式提供时，可以通过将能够上调对应于有效成分的tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物添加于食物或饮料中的形式来制备。对于食物或饮料的形式没有特别的限定，并且实例包括例如：酱油、味噌、沙司或番茄酱等调味品，动植物蛋白水解物(hap、hvp)、酵母提取物、氨基酸、肽等作为主要成分的调味品，日本即食肉汤、日本面条汤底、肉酱、乳酪面糊或调味汁等用于调味的食品调味料，面条、面包和小吃等加工的谷物产品，火腿、香肠和鱼酱产品等加工的肉和鱼类产品，汤，酱菜，以及即食菜等。另外，食物或饮料还包括可以仅通过加热水或水来烹饪的即食食品(例如：即食面条的粉状或液体状汤料、即食清汤、肉汤和中式汤、日式酱汤、日本清汤、以及烩菜即食面条)。或者，咸味增强剂也能够以在生物体内食物组合物代谢过程中产生的物质的形式提供(例如糖、氨基酸、肽或脂质)。用作本发明咸味增强剂中的有效成分的、能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物的含量通常在0.01重量％～100重量％范围。本发明的咸味增强剂能够以相对于100质量份的氯化钠丰度比或含量比为1质量份～15质量份。本发明还包括以下方面：一种能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物的作为咸味增强剂的用途；一种用作咸味增强剂的化合物，其能够上调tmc4基因或tmc4蛋白功能表达；以及一种能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物的用于制造咸味增强剂的用途。筛选方法本发明的筛选方法包括以下步骤：(i)确定被检物质是否为能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物；以及(ii)选择在步骤(i)中确定为能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物的被检物质作为咸味增强剂的有效成分。在步骤(i)中，确定被筛选的被检物质是否是能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物。被检物质没有特别的限定，只要是可以作为咸味增强剂的有效成分的候选化合物的化合物即可。被检物质可以是天然化合物(例如生物材料)或合成化合物。被检物质优选源自食物的化合物。被检物质的具体实例包括低分子量化合物、蛋白(例如抗体)、核酸(例如sirna、shrna、dsrna或mirna)、糖链以及复合碳水化合物。作为用于确定被检物质是否是能够上调tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达的化合物的方法，本领域技术人员根据作为测定目标的被检物质、以及确定有上调的tmc4基因或tmc4蛋白的功能表达，可以在能够达到目的的范围内从公知的以及未来开发的所有手段(方法)中适当选择。例如，可以采用以下手段(方法)，使被检物质作用于通过将tmc4基因导入细胞(例如hek293t)而表达tmc4蛋白的培养细胞、两栖动物卵母细胞(例如爪蟾卵母细胞)等，或者结合于tmc4蛋白的人工脂质膜上并观察其响应。作为观察响应的方法的具体实例包括膜片钳法(例如细胞附着法、由内而外的方法或全细胞方法)、全细胞电流的测定法、放射性标记离子通量测定法、以及使用电压敏感染料和离子敏感染料的荧光测定法。具体实施这些技术的方法是本领域技术人员所熟知的。在膜片钳法和全细胞电流测定法中，可以将离子流入表达了tmc4蛋白的细胞的变化作为电流或电压的变化而进行检测。在放射性标记离子通量测定法中，利用放射性同位素离子检测离子流入表达了tmc4蛋白的细胞的变化。在使用电压敏感染料和离子敏感染料的荧光测定法中，可以检测流入表达了tmc4蛋白的细胞的离子作为荧光强度的变化。荧光强度的变化可以使用例如酶标仪来测量。在这些方法中，作为能够上调tmc4蛋白的功能表达的化合物可以选择以tmc4蛋白为介的cl-离子向细胞内流入的上调(促进)的化合物。或者，也可以通过基于tmc4蛋白的氨基酸序列的结构模型的结构-活性关系模拟来确定被检物质是否是能够上调tmc4蛋白的功能表达的化合物。例如，构建tmc4蛋白的三维结构模型，在与三维结构模型对接模拟的基础上，筛选激活孔区域的配体。作为能够上调tmc4蛋白的功能表达的化合物，例如，可筛选与影响tmc4蛋白的分子活性的三维结构区域位点对接时的一致率高的化合物。具体实例包括：(1)通过具有相似于tmc4蛋白的性质且具有已知三维结构的蛋白与tmc4蛋白之间的比对(对准)来推测影响分子活性的三维结构区域位点、并且通过与三维结构区域位点进行对接模拟来筛选与结构匹配的配体的方法；以及(2)当已知能激活具有相似于tmc4蛋白的性质且具有已知三维结构的蛋白的化合物(配体)时通过配体的三维结构进行对接模拟来推测作用于tmc4蛋白的结构区域的配体的区域、并且基于对接位点的三维结构筛选出进一步激活tmc4蛋白的配体结构的方法。在该步骤中，将已知的咸味增强剂，例如精氨酸或其盐(例如盐酸精氨酸)作为对照，筛选比对照具有更高程度的上调tmc4基因或tmc4蛋白功能表达的被检物质。随后，在步骤(ii)中选择咸味增强剂的有效成分。模式动物本发明中用作对高盐浓度具有适口性的模式动物的非人动物，是tmc4基因被敲除的非人动物。非人动物可以是任何物种的动物，只要不是人类且可以用作实验动物即可，优选为啮齿动物，更优选为小鼠。在本说明书中，术语“tmc4基因被敲除”是指，由于上述tmc4基因的核苷酸序列的修饰等导致tmc4基因的表达产物根本不表达，或者，即使表达，其表达产物也不能表现出tmc4基因的正常产物所具有的功能，而且缺乏tmc4基因的功能的状态。对于本发明中所用的非人动物没有特别的限定，只要是tmc4基因被敲除即可，在tmc4基因的功能缺失的具体方面，例如包括其中至少部分tmc4基因被修饰、以及其中tmc4基因的启动子被失活等。在本说明书中，术语“至少部分tmc4基因被修饰”是指，至少部分tmc4基因的核苷酸序列被修饰而引起缺失、取代或添加。为了敲除tmc4基因，可以通过组合缺失、取代或添加中的一种或两种以上来引起tmc4基因的突变。另外，在本说明书中，术语“缺失”至少部分tmc4基因的核苷酸序列是指，通过使部分或全部的tmc4基因缺失而引起的修饰，由此使得tmc4基因的表达产物不能表现出作为tmc4蛋白的功能。在本说明书中，术语“替代”至少部分tmc4基因的核苷酸序列是指，通过用其它与tmc4基因无关的个别基因取代部分或全部的tmc4基因而引起的修饰，由此使得tmc4基因的表达产物不能表现出作为tmc4蛋白的功能。另外，在本说明书中，术语“添加”到至少部分tmc4基因的核苷酸序列是指，通过添加与tmc4基因不同的序列至tmc4基因而引起的修饰，由此使得tmc4基因的表达产物不能表现出作为tmc4蛋白的功能。本发明中所用的tmc4基因被敲除的非人动物，可以是tmc4基因的任一个等位基因被敲除的杂合(异型接合体)敲除动物，或者是两个等位基因的功能都被敲除的纯合(同型结合体)敲除动物。本发明中所用的非人动物可以是雌性或雄性。tmc4基因被敲除的非人动物可以通过已知的方法来制备。这种方法的实例包括但不限于基因组编辑技术，例如talen方法和crispr/cas9方法，以及通过同源重组方法的基因破坏技术。如后述的实施例所示，tmc4基因被敲除的非人动物对高盐浓度具有适口性，因此可以用作具有这种适口性的模式生物。本发明还包括以下方面的技术方案：一种tmc4基因被敲除的非人动物作为对高盐浓度具有适口性的模式动物的用途；以及一种tmc4基因被敲除的非人动物，其用作对高盐浓度具有适口性的模式动物。实施例下面将参考实施例更详细地描述本发明。应当指出，这些实施例并不限制本发明。[实施例1]tmc4的表达模式通过原位杂交证实，tmc4局部存在于口腔内的具有味蕾(轮廓乳头、叶状乳头和菌状乳头)的组织中。<方法>原位杂交使用7周龄以上的野生型c57bl/6j(b6)雄性小鼠(购自cleajapan,inc.)。通过颈脱位使小鼠安乐死，并从舌头上取乳头(乳突)周围的上皮，用o.c.t.化合物(sakurafinetekjapanco.,ltd.)将其包埋在cryomold1号(sakurafinetekjapanco.,ltd.)中，然后将所得物用液氮冷冻。将每个冷冻的块切成7μm的厚度，并且将所得物附着至涂覆有mas的载玻片(matsunamiglassind.,ltd.)上。使用digrnalabelingmix(rochediagnosticsk.k.)通过t3rna聚合酶(stratagene公司)进行体外转录反应合成了地高辛(digoxigenin)标记的反义rna。然后，将所得物在65℃下用alkalinesizingbuffer(碱性分选缓冲液)(42mmnahco3、63mmna2co3)处理55分钟，以通过水解将反义rna片段化为约150个碱基的大小，从而获得rna探针。将每个轮廓、叶状或菌状乳头的冷冻切片用冷风干燥15分钟，然后用4％pfa/pbs溶液固定15分钟，并用0.1％depc/pbs洗涤两次。为了使探针容易渗透，将所得物用含有蛋白酶k(1μg/ml、invitrogen公司)的tbs溶液处理5分钟，并进一步用0.1％depc/pbs溶液洗涤。然后，将切片浸入含有1.17％三乙醇胺和0.25％乙酸酐的depc水中以进行乙酰化。将所得物用depc水洗涤，然后干燥至切片外围部分干燥的程度，并浸入预杂交溶液(50％甲酰胺、5×ssc、鱼精dna(40μg/ml))中，在湿度箱中58℃下预杂交2小时。然后，将所得物用杂交溶液(50％甲酰胺、5×ssc、5×denhardt's溶液、酵母rna(0.25mg/ml)、1mmdtt、鱼精dna(0.5mg/ml))在85℃处理3分钟。将所得物滴在切片上，用封口膜覆盖，并在58℃杂交过夜。杂交后将所得物用5×ssc在58℃下洗涤5分钟两次，并用0.2×ssc洗涤30分钟两次。将所得物用tbs溶液洗涤5分钟，并在室温下浸入封闭溶液(0.1％封闭试剂(rochediagnostick.k.)/tbs)约1小时进行封闭。然后，在包含碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(0.1μl/ml、rochediagnostick.k.)封闭溶液中，在室温下进行抗原抗体反应1小时。将所得物用tbs溶液洗涤15分钟3次，并浸入碱性磷酸酶缓冲液(100mmtris-hcl(ph9.5)、100mmnacl、50mmmgcl2)中5分钟。然后，将nbt(氮蓝四唑)/bcip(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酶对甲苯胺盐5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatasep-toluidinesalt)溶液(rochediagnosticsk.k.)作为显色底物以滴加的方式加入其中，然后在室温下进行显色反应过夜。用碱性磷酸酶缓冲液洗涤5分钟使显色反应停止后，将所得物浸入超纯水5分钟。将所得物干燥，并盖上盖玻片用fluoromount封片剂(sigma)封入，获得标本(显微镜用标本)。标本用显微镜bx51(olympus公司)观察，并且用cooledccd照相机dp73(olympus公司)获得其图像。<结果>将结果示于图1。其表明tmc4特异性强劲地局部存在于轮廓乳头(cvp)和叶状乳头(fop)的味蕾中。[实施例2]tmc4的电生理特性为了检测tmc4电生理特性，使用表达tmc4的hek293t细胞进行了全细胞膜片钳测定(全细胞记录)。<方法>质粒和表达蛋白为了在hek293t细胞中表达小鼠tmc4(mtmc4)，使用了具有cmv启动子的质粒载体pires2-acgfp1(clontechlaboratories,inc.)。以1μg/35mm培养皿的比率转染表达载体，其中mtmc4(序列登录号nm_181820.2，从源自小鼠轮廓乳头上皮的cdna克隆)被插入pires2-acgfp1限制性内切酶ecor1位点和not1位点之间。作为转染试剂，使用了具有plus&reagent(商标)(thermofisherscientifick.k.)的脂质体(商标)ltxreagent。另外，为了进行荧光指示，同时转染了0.1μg/35mm的pegfp-n1(clontechlaboratories,inc.)。将转染细胞接种于18mm圆形玻璃容器中(matsunamiglassind.,ltd.)，并在恒温箱(37℃、co2浓度为5体积％)中再次培养。所有的实验均在转染至hek293t细胞后的24～36小时之间进行。膜片钳法(膜片钳记录)在使用hek293t细胞进行全细胞膜片钳记录中，使用axopatch200b(moleculardevices,llc.)作为放大器，并用digidata1550(axoninstruments，美国加利福尼亚州联合市)获得数字数据。用pclamp10.2(axoninstruments)软件分析获得的数据。使用微电极拉制仪p-97/ivf(sutterinstrumentcompany)加工具有细丝(narishigegroup)的gd-1.5玻璃毛细管以制备玻璃电极。将其电极电阻调整为3-5mω。在相继灌注细胞外液的情况下，将表达mtmc4的细胞的膜电位固定在-60mv进行测量。通过以10mv的间隔向各细胞外液施加-100mv～+100mv的阶跃脉冲(400ms)以创建i-v曲线，并由此测量了不同细胞外液下的mtmc4的电压-电流特性。另外，当在瞬间更换细胞外液时，使用microfilcmf28gxxl(wpi)通过灌注来更换液体，同时每5秒对固定于-60mv电压的细胞施加±100mv斜波300ms。所有测量均在25℃下进行。表1示出了膜片钳方法中使用的细胞内液(pipettesolution:电极内液)的组成，表2示出了细胞外液(bathsolutions：电解液)的组成。需要注意的是，表2中也示出了实施例4中使用的细胞外液的组成。通过使用n-甲基-d-葡萄糖胺(nmdg：n-methyl-d-glucamine)将细胞内液(pipettesolution)调节至ph7.4。将每个细胞内液调节至渗透压约为270mosmol/kg。通过使用nmdg-oh将细胞外液(solutions)调节至ph7.4。将细胞外液的渗透压调节至约290mosmol/kg。[表1]电极内液(pipettesolution)物质(浓度：mm)nmdg-clnmdg-cl134bapta5hepes10nmdg-cl：n-甲基-d-葡萄糖胺氯化物bapta：o,o'-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-n,n,n'n'-四乙酸四钾盐水合物hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[表2]nmdg-cl：n-甲基-d-葡萄糖胺氯化物hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸nppb：5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸<结果>将结果示于图2。将细胞外液的nacl(134mm)逐步替换为葡萄糖酸钠(na-gluconate：na-葡萄糖酸盐)，如此地使细胞外液依次改变为100mmcl-(nacl100mm、葡萄糖酸钠34mm)、50mmcl-(nacl50mm、葡萄糖酸钠84mm)、以及134mm葡萄糖酸钠(0mmcl-)。由此，外向cl-电流的大小随着cl-浓度的降低而减少。当cl-完全替换为葡萄糖酸盐时外向电流并未消失。然而，当将100μmnppb(即cl-通道抑制剂)添加到134mmnacl缓冲液时，电流完全消失了。这提示tmc4可能是向外整流性cl-通道，其孔径允许葡萄糖酸盐等大分子通过。[实施例3]tmc4基因敲除小鼠为了观察tmc4对咸味接受行为的影响，制备了tmc4基因敲除小鼠(ko)进行舔舐(行为)分析实验(简短访问测试)。<方法>tmc4ko小鼠动物实验获得批准并按照动物实验手册进行。tmc4ko小鼠以c57bl/6j小鼠为遗传背景通过talen方法(株式会社特殊免疫研究所：instituteofimmunologyco.,ltd.)制备。在回交tmc4ko小鼠的创始小鼠(foundermouse)后，使用从小鼠尾部提取的dna进行tmc4基因组序列的序列分析，从而检查是否存在移码。在tmc4ko小鼠中，使用通过杂交杂合小鼠(+/-)生成的同胞仔wt小鼠(+/+)和ko小鼠(-/-)且均为雄性、7周龄以上。给小鼠提供正常饮食(labmrbreeder、日本农产工业：nosancorporation)，并在22±1℃的恒定温度、12小时的明/暗循环(上午8:00点亮)条件下饲养。舔舐分析实验(简短访问测试)舔舐分析实验是一种在短时间内向实验动物提供口味溶液以计算动物舔舐放液嘴的次数(舔舐次数)的方法，也是一种可以仅依靠味觉识别(通过大脑)不包括吞咽后的影响来测定的实验。实验使用了tmc4ko小鼠(-/-，7周龄以上，n＝7)及其野生型同胞仔(+/+，7周龄以上，n＝9)。进行了甜味、鲜味、苦味、酸味、以及咸味五种口味与水的比较测试。在允许自由进食的同时禁水4小时后，进行了甜味和鲜味(以阈值或更高水平来愉快摄入的味道)的测试。在测试苦味、酸味、以及咸味(以阈值或更高水平来排斥摄入的味道)的那一天，在允许自由进食的同时禁水23小时后进行测试。至于被认为是适口的咸味，是将利尿剂速尿灵(furosemide)以每公斤体重50mg/kg的量给每只小鼠皮下注射，然后禁食和禁水6小时。为了尽可能消除饮水限制对健康状况的影响，通过测量确定各个体保持其体重在开始测试时的80％以上。为了测量舔舐次数，使用数码相机(vsk0780、panasonic公司)记录舔舐行为，并且根据记录影像针对呈现每种口味溶液后小鼠开始舔舐放液嘴(水龙头)起5秒间的舔舐次数进行计数。对口味物质溶液的舔舐次数与禁水后5秒内对超纯水舔舐次数的比率(设想为最高速度下的舔舐次数)被定义为舔舐率(lickratio)：(舔舐率)/(禁水后对超纯水的平均舔舐次数)。通过双因素方差分析比较各组之间的差异，测试了wt和ko小鼠的反应。<结果>试验中使用了经适应训练的小鼠(wt：n＝9；ko：n＝7；均为雄性、20周龄以上)。对通常浓度依赖性适口化的味道(甜味和鲜味)在禁食和禁水4小时后测量了5秒间的舔舐次数，并且对随浓度增加而排斥化(被拒绝)的味道(苦味、酸味和咸味)在禁水和自由进食23小时后测量了5秒间的舔舐次数。假设禁水23小时后的舔舐水次数为1，则计算与该参考值的比率。至于用于测试的口味溶液，甜味用蔗糖(wakopurechemicalindustries,ltd.)溶液、鲜味用谷氨酸钠(msg)(wakopurechemicalindustries,ltd.)溶液和0.5mm肌苷酸(imp)(wakopurechemicalindustries,ltd.)的混合溶液、苦味用盐酸奎宁(wakopurechemicalindustries,ltd.)溶液、酸味用柠檬酸(wakopurechemicalindustries,ltd.)溶液、并且咸味用nacl(kantochemicalco.,inc.)溶液。将结果示于图3。当将nacl用作口味溶液的咸味时，wt小鼠和ko小鼠(双因素方差分析：two-wayanova)组之间存在显著差异(显著性水平：5％)，并且ko小鼠对nacl的反应(敏感性)低于wt小鼠。另一方面，对于其它口味质量(味质)和设想为适口的咸味，在wt小鼠和ko小鼠的组之间未观察到显著差异。[实施例4]已知的咸味增强剂对tmc4的电生理特性的影响为了观察已知的咸味增强剂对tmc4的影响，通过使用表达人tmc4(htmc4)的hek293t细胞进行全细胞膜片钳测定(全细胞记录)。<方法>除了下列1)和2)之外，以与实施例2相同的方式测定了全细胞膜片钳，并比较了流经tmc4的cl-电流。1)使用表达人tmc4(htmc4)的hek293t细胞；并且2)将134mmnacl溶液用作媒介物(vehicle)溶液，通过向媒介物溶液中添加100μm盐酸精氨酸(arg-hcl)作为咸味增强剂而获得的细胞外液，以及使用通过向媒介物溶液中添加100μm蔗糖或麦芽糖而获得的细胞外液(对照不增强咸味)。至于htmc4，登录号bc025323的克隆购自dharmacon，并将其插入到质粒pires2-acgfp1的限制性内切酶ecor1位点和not1位点之间，以与mtmc4相同的方式构建表达载体。<结果>结果如图4和5所示。当使用100μm盐酸精氨酸作为咸味增强剂加入媒介物溶液时，流经相同细胞的cl-电流增加。另一方面，当添加都不具有咸味增强作用的100μm蔗糖或麦芽糖时，流经相同细胞的cl-电流不变。这表明流经表达tmc4的细胞的cl-电流被盐酸精氨酸(咸味增强剂)所激活。因此，当使用表达tmc4的hek293t细胞通过全细胞膜片钳测定法搜索增加cl-电流的物质时，可以发现咸味增强剂的候选物。当前第1页12