核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和PCR扩增试剂盒与流程

技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒。
背景技术：
：pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)是一种用于扩增特定的核酸片段的分子生物学技术，其最大特点，是能将微量的核酸进行大量的富集和增加，从而达到便于检测微量核酸的目的。其中在医学诊断上常用的pcr方法主要是基于双荧光探针的实时荧光定量pcr(qpcr)方法，利用qpcr方法进行体外诊断的靶标主要包括人基因组dna、dna病毒、细菌、真菌和rna病毒等。而由于rna的结构为单链结构，不稳定且容易降解，因此在样品的处理过程当中要求非常高，需要较为复杂的方法对待扩增的rna样品进行前处理和核酸提取并纯化，得到纯净的核酸后，方能进行检测得到稳定的结果。技术实现要素：基于此，有必要提供一种可简化rna样品pcr扩增方法的核酸释放剂。一种核酸释放剂，包括tris-hcl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇和强碱；其中，tris-hcl的摩尔浓度为0.5mm～500mm，氯化钠的摩尔浓度为20mm～500mm，氯化钾的质量浓度为5mg/ml～8mg/ml，吐温20的体积百分比为0.1％～2％，曲拉通x-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％～3％，强碱的质量浓度为2mg/ml～50mg/ml。本发明的核酸释放剂通过一定比例的强碱使细胞裂解释放核酸，而氯化钠和氯化钾则通过协调细胞膜内外离子平衡来对核酸起保护作用，tris-hcl用于保证细胞裂解时ph值的稳定且能够较好地与后续扩增时的pcr反应液兼容；曲拉通x-100一方面可以很好地对核酸特别是单链的rna起到保护作用，使rna能够在碱性环境中得以保存，另一方面曲拉通x-100和氯化钾在一定配比下可以降低强碱环境对pcr反应中酶的抑制作用，从而保证rna的扩增效率；吐温20和乙基苯基聚乙二醇可对逆转录酶起到保护作用，使逆转录酶在碱性环境中正常工作。通过上述各组分的协同作用，本发明的核酸释放剂可以使含有rna的样品在室温下直接释放出rna，避免因加热产生气溶胶导致的样品污染问题，并有效防止rna在碱性环境中的降解，更重要的是能够与pcr反应液直接混合进行pcr扩增，无需进行复杂的核酸提取和纯化过程即可完成扩增，真正实现一室化、无污染、简单快速的rna扩增检测，而且检测灵敏度高，重复性良好。在其中一个实施例中，还包括甜菜碱和牛血清白蛋白，且在所述核酸释放剂中，所述甜菜碱的质量浓度为0.1mg/ml～20mg/ml，所述牛血清白蛋白的质量浓度为5mg/ml～100mg/ml。在其中一个实施例中，还包括蛋白酶k和十二烷基硫酸锂，且在所述核酸释放剂中，所述蛋白酶k的质量浓度为0.02mg/ml～1.5mg/ml，所述十二烷基硫酸锂的质量浓度为0.4mg/ml～30mg/ml。本发明还提供了一种核酸pcr扩增方法，包括以下步骤：将上述核酸释放剂与样品混合，于25℃～60℃放置2min～10min，然后加入pcr反应液进行pcr扩增。在其中一个实施例中，在将所述核酸释放剂与样品混合之前，还包括样品的预处理步骤：将样品与聚乙二醇混合，然后离心取沉淀。在其中一个实施例中，对所述样品中的肠道病毒进行pcr扩增的条件为：逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，53℃～57℃反应28s～32s，若干个循环；冷却：23℃～27℃反应8s～12s。在其中一个实施例中，对所述样品中的丙型肝炎病毒进行pcr扩增的条件为：预变性和酶激活：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；逆转录反应：58℃～62℃反应28min～32min；热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；冷却：23℃～27℃反应8s～12s。在其中一个实施例中，对所述样品中的呼吸道病毒进行pcr扩增的条件为：逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；冷却：23℃～27℃反应8s～12s。在其中一个实施例中，对所述样品中的呼吸道细菌进行pcr扩增的条件为：udg酶反应：48℃～52℃反应1.9min～2.1min；热变性反应：92℃～96℃反应2.9min～3.1min；扩增反应：92℃～96℃反应8s～12s，58℃～62℃反应18s～22s，若干个循环；延伸及荧光采集：73℃～77℃反应18s～22s；溶解曲线：62℃～75℃。本发明还提供了一种pcr扩增试剂盒，包括上述核酸释放剂和pcr反应液。附图说明图1为实施例1～25的实时荧光定量pcr扩增曲线；图2为实施例26～50的实时荧光定量pcr扩增曲线；图3为实施例51～70的实时荧光定量pcr扩增曲线；图4为实施例71～90的实时荧光定量pcr扩增曲线。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明一实施例的核酸释放剂，包括tris-hcl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇和强碱；其中，tris-hcl的摩尔浓度为0.5mm～500mm，氯化钠的摩尔浓度为20mm～500mm，氯化钾的质量浓度为5mg/ml～8mg/ml，吐温20的体积百分比为0.1％～2％，曲拉通x-100的体积百分比为0.1％～3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％～3％，强碱的质量浓度为2mg/ml～50mg/ml。为了达到裂解的效果，裂解液需要呈碱性，而rna在碱性环境中极易被降解，同时针对rna的pcr扩增检测需要用到逆转录酶，相对于热稳定性较好的taqdna聚合酶，逆转录酶较为脆弱，在碱性环境中容易被抑制，无法达到逆转录的效果。因此，rna在裂解液中一般无法直接进行pcr扩增检测。目前针对rna样品的pcr扩增检测的前处理方法主要有煮沸裂解法和磁珠法。煮沸裂解法是通过煮沸使样品中的核酸在裂解缓冲液的作用下释放出来，溶解在裂解缓冲液中，沸水浴裂解细胞的同时，使细胞的蛋白质与染色体变性。然后通过离心沉淀去除变性的蛋白质和其他杂质，回收上清液中的核酸用于pcr扩增。然而，经高温煮沸，蛋白凝固使部分核酸被包裹并随离心沉淀丢失，直接导致上清液中模板核酸量减少，使后续扩增检测灵敏度下降。同时，煮沸加热极容易产生气溶胶，导致样品污染，从而在后续的检测中产生假阳性的结果。磁珠法是通过裂解液裂解细胞，游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，再用洗脱液洗脱，得到纯净的核酸。但磁珠法操作复杂，且对样本量的要求一般在200～600微升，仪器设备的要求也非常高，限制了其推广和使用。针对上述机理，本实施例的核酸释放剂通过一定比例的强碱使细胞裂解释放核酸，而氯化钠和氯化钾则通过协调细胞膜内外离子平衡来对核酸起保护作用，tris-hcl用于保证细胞裂解时ph值的稳定且能够较好地与后续扩增时的pcr反应液兼容；曲拉通x-100一方面可以很好地对核酸特别是单链的rna起到保护作用，使rna能够在碱性环境中得以保存，另一方面曲拉通x-100和氯化钾在一定配比下可以降低强碱环境对pcr反应中酶的抑制作用，从而保证rna的扩增效率；吐温20和乙基苯基聚乙二醇可对逆转录酶起到保护作用，使逆转录酶在碱性环境中正常工作。通过上述各组分的协同作用，该核酸释放剂可以使含有rna的样品在室温下直接释放出rna，避免因加热产生气溶胶导致的样品污染问题，并有效防止rna在碱性环境中的降解，更重要的是能够与pcr反应液直接混合进行pcr扩增，无需进行复杂的核酸提取和纯化过程即可完成扩增，真正实现一室化、无污染、简单快速的rna扩增检测，而且检测灵敏度高，重复性良好。可以理解，该核酸释放剂不仅可用于rna样品的pcr扩增检测，也适用于dna样品或rna、dna混合样品的多重联合扩增检测。具体地，强碱为氢氧化钠或氢氧化钾等，可根据需要选择。在一个具体示例中，核酸释放剂还包括甜菜碱和牛血清白蛋白，且在核酸释放剂中，甜菜碱的质量浓度为0.1mg/ml～20mg/ml，牛血清白蛋白的质量浓度为5mg/ml～100mg/ml。通过添加一定比例的甜菜碱和牛血清白蛋白，可以协同曲拉通x-100更好地在碱性条件下对rna进行保护，以及防止聚合酶和逆转录酶变性，从而确保rna的快速释放和扩增，实现rna样品的快速检测。在一个具体示例中，核酸释放剂还包括蛋白酶k和十二烷基硫酸锂，且在核酸释放剂中，蛋白酶k的质量浓度为0.02mg/ml～1.5mg/ml，十二烷基硫酸锂的质量浓度为0.4mg/ml～30mg/ml。通过添加一定比例的蛋白酶k和十二烷基硫酸锂，可以变性降解rnase，从而进一步保护rna防止其降解。本发明一实施例的核酸pcr扩增方法，包括以下步骤：将上述核酸释放剂与样品混合，于25℃～60℃放置2min～10min，然后加入pcr反应液进行pcr扩增。本实施例的核酸pcr扩增方法针对rna等核酸样品实现了免提取纯化直接进行扩增的操作，即将上述核酸释放剂加入到样品中，使核酸从细胞中释放出来，然后直接加入pcr反应液进行pcr扩增例如实时荧光定量pcr，无需进行煮沸加热或提取纯化等过程，就能够完成对核酸样品的扩增检测，真正实现一室化、无污染、简单快速的rna扩增检测，而且检测灵敏度高，重复性良好。在一个具体示例中，核酸释放剂与样品的体积比为1∶1～5。可选地，样品类型包括血清、血浆、口咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、粪便等多种类型，与核酸释放剂混合后可以直接对接下游的pcr扩增或基因芯片等检测方法。在一个具体示例中，pcr反应液包括脱氧核糖核苷三磷酸、上游引物、下游引物、dna聚合酶、逆转录酶和扩增缓冲液等。可以理解，根据pcr反应类型和目的的不同，pcr反应液的组成可以根据需要进行选择，不限于此，例如进行实时荧光定量pcr时，pcr反应液还包括荧光探针或荧光染料等。在一个具体示例中，在将核酸释放剂与样品混合之前，还包括样品的预处理步骤：将样品与聚乙二醇(peg)溶液混合，然后离心取沉淀。具体地，聚乙二醇的种类为peg-6000，浓度为体积百分比0.5％～5％。将聚乙二醇作为核酸沉降剂，可以用于处理复杂样品，对于以游离形式存在的rna病毒，能够有效捕获，增加后期的检测灵敏度，同时不影响pcr的反应体系，可以显著提高rna快速pcr检测的性能。例如对于含有高盐溶液的细胞保存液、病毒保存液或已经溶血的血液样品等，可取50～5000微升样品，等体积加入peg溶液，以3000～13000rpm/min进行离心1～10分钟，弃去上清取沉淀，然后再加入50～100微升的核酸释放剂。在一个具体示例中，对样品中的肠道病毒进行pcr扩增的条件为：逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，53℃～57℃反应28s～32s，若干个循环；冷却：23℃～27℃反应8s～12s。在一个具体示例中，对样品中的丙型肝炎病毒(hcv)进行pcr扩增的条件为：预变性和酶激活：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；逆转录反应：58℃～62℃反应28min～32min；热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；冷却：23℃～27℃反应8s～12s。在一个具体示例中，对样品中的呼吸道病毒进行pcr扩增的条件为：逆转录反应：48℃～52℃反应28min～32min；热变性反应：93℃～97℃反应0.9min～1.1min；扩增反应：93℃～97℃反应13s～17s，58℃～62℃反应28s～32s，若干个循环；冷却：23℃～27℃反应8s～12s。在一个具体示例中，对样品中的呼吸道细菌进行pcr扩增的条件为：udg酶反应：48℃～52℃反应1.9min～2.1min；热变性反应：92℃～96℃反应2.9min～3.1min；扩增反应：92℃～96℃反应8s～12s，58℃～62℃反应18s～22s，若干个循环；延伸及荧光采集：73℃～77℃反应18s～22s；溶解曲线：62℃～75℃。可以理解，pcr扩增的条件不限于上述具体示例，根据不同的pcr类型和目的可进行相应调整。本发明一实施例的pcr扩增试剂盒，包括上述核酸释放剂和pcr反应液。本实施例的pcr扩增试剂盒针对rna等核酸样品实现了免提取纯化直接进行扩增的操作，即将上述核酸释放剂加入到样品中，使核酸从细胞中释放出来，然后直接加入pcr反应液进行pcr扩增例如实时荧光定量pcr，无需进行煮沸加热或提取纯化等过程，就能够完成对核酸样品的扩增检测，真正实现一室化、无污染、简单快速的rna扩增检测，而且检测灵敏度高，重复性良好。以下为具体实施例。一、肠道病毒检测实施例1～25：准备25份肠道病毒咽拭子样品(病毒保存液基质)，分别取100μl样品于12000rpm/min离心10min，弃去上清并加入50μl核酸释放剂，静置10min，然后取10μl与40μlpcr反应液混合进行实时荧光定量pcr扩增，扩增曲线如图1所示。实施例1～25所用核酸释放剂包括tris-hcl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇、甜菜碱、牛血清白蛋白、蛋白酶k、十二烷基硫酸锂和氢氧化钠。其中，tris-hcl的摩尔浓度为0.5mm，氯化钠的摩尔浓度为500mm，吐温20的体积百分比为0.1％，曲拉通x-100的体积百分比为3％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为0.1％，氯化钾的质量浓度为8mg/ml，氢氧化钠的质量浓度为2mg/ml，甜菜碱的质量浓度为20mg/ml，牛血清白蛋白的质量浓度为5mg/ml，蛋白酶k的质量浓度为1.5mg/ml，十二烷基硫酸锂的质量浓度为0.4mg/ml。对比例1～25：采用磁珠法对上述25份样品进行处理并进行实时荧光定量pcr扩增。对比例26～35：与实施例1～10基本相同，区别在于核酸释放剂中不包括吐温20和乙基苯基聚乙二醇。对比例36～45：与实施例11～20基本相同，区别在于核酸释放剂中不包括曲拉通x-100。对比例46～50：与实施例21～25基本相同，区别在于核酸释放剂中曲拉通x-100的体积百分比为8％，氯化钾的质量浓度为15mg/ml。各实施例和对比例的ct值如表1所示，pcr扩增的条件为：逆转录反应：50℃反应30min；热变性反应：95℃反应1min；扩增反应：95℃反应15s，55℃反应30s，45个循环；冷却：25℃反应10s。表1根据检测结果可知，对比例1～25和实施例1～25均能检测出肠道病毒的阳性样本，结果一致率达100％，准确性较好，而对比例26～50则无法稳定成功地检测出肠道病毒的阳性样本。另外ct数值越小说明检测灵敏度越高，对比ct值可知采用本发明核酸释放剂及核酸pcr扩增方法的实施例在rna样品扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。二、呼吸道细菌联检实施例26～50：准备25份呼吸道痰液样本(生理盐水基质)，分别取5μl样品加入5μl核酸释放剂，静置10min，然后加入40μlpcr反应液混合进行实时荧光定量pcr扩增，扩增曲线如图2所示。所用核酸释放剂包括tris-hcl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇、甜菜碱、牛血清白蛋白、蛋白酶k、十二烷基硫酸锂和氢氧化钠。其中，tris-hcl的摩尔浓度为500mm，氯化钠的摩尔浓度为20mm，吐温20的体积百分比为2％，曲拉通x-100的体积百分比为0.1％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为3％，氯化钾的质量浓度为5mg/ml，氢氧化钠的质量浓度为50mg/ml，甜菜碱的质量浓度为0.1mg/ml，牛血清白蛋白的质量浓度为100mg/ml，蛋白酶k的质量浓度为0.02mg/ml，十二烷基硫酸锂的质量浓度为30mg/ml。对比例51～75：采用磁珠法对上述25份样品进行处理并进行实时荧光定量pcr扩增。各实施例和对比例的ct值如表2所示，pcr扩增的条件为：udg酶反应：50℃反应2min；热变性反应：94℃反应3min；扩增反应：94℃反应10s，60℃反应20s，45个循环；延伸及荧光采集：75℃反应20s；溶解曲线：62℃～75℃。表2对比例51～63实施例26～38对比例64～75实施例39～50样本135.3631.34样本1423.3524.14样本229.4724.54样本1536.0332.69样本330.1831.1样本1636.235.99样本437.2336.56样本1736.0235.95样本533.2128.44样本1833.4433.2样本627.9425.69样本1938.3438.32样本726.5824.945样本2030.7629.145样本831.1930.495样本2136.4930.85样本933.6429.675样本2226.2225.925样本1037.9534.455样本2323.0122.96样本1132.6824.13样本2431.3927.32样本1227.5823.355样本2529.2624.015样本1334.1432.605根据检测结果可知，对比例和实施例均能检测出呼吸道细菌的阳性样本，结果一致率达100％，准确性较好。另外ct数值越小说明检测灵敏度越高，对比ct值可知采用本发明核酸释放剂及核酸pcr扩增方法的实施例在细菌多重扩增检测中的灵敏度与磁珠法的灵敏度相当。也说明本发明的核酸释放剂及核酸pcr扩增方法不仅仅适用于rna样品的扩增检测，同时也可应用于dna样品的扩增检测。三、hcv病毒检测实施例51～70：准备20份hcv血清样品，分别取15μl样品加入5μl核酸释放剂，静置10min，然后与30μlpcr反应液混合进行实时荧光定量pcr扩增，扩增曲线如图3所示。所用核酸释放剂包括tris-hcl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇、甜菜碱、牛血清白蛋白和氢氧化钠。其中，tris-hcl的摩尔浓度为200mm，氯化钠的摩尔浓度为250mm，吐温20的体积百分比为1％，曲拉通x-100的体积百分比为2％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为2％，氯化钾的质量浓度为7mg/ml，氢氧化钠的质量浓度为25mg/ml，甜菜碱的质量浓度为10mg/ml，牛血清白蛋白的质量浓度为60mg/ml。实施例91～110：使用与实施例51～70相同的hcv血清样品，分别取15μl样品加入5μl核酸释放剂，静置10min，然后与30μlpcr反应液混合进行实时荧光定量pcr扩增，所用核酸释放剂与实施例1～25所用核酸释放剂相同。各实施例的ct值如表3所示，pcr扩增的条件为：预变性和酶激活：95℃反应1min；逆转录反应：60℃反应30min；热变性反应：95℃反应1min；扩增反应：95℃反应15s，60℃反应30s，45个循环；冷却：25℃反应10s。表3根据图3可知，采用本发明核酸释放剂及核酸pcr扩增方法的实施例均能检测出hcv病毒的阳性样本，稳定性较好。另外，从表3可以看到实施例51～70的检测灵敏度略差于实施例91～100，说明实施例51～70采用的核酸释放剂的效果略逊于实施例91～100采用的核酸释放剂。四、呼吸道病毒检测实施例71～90：准备20份呼吸道病毒咽拭子样品(生理盐水基质)，分别取100μl样品于12000rpm/min离心10min，弃去上清并加入50μl核酸释放剂，静置10min，然后取10μl与40μlpcr反应液混合进行实时荧光定量pcr扩增，扩增曲线如图4所示。所用核酸释放剂包括tris-hcl、氯化钠、氯化钾、吐温20、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇和氢氧化钠。其中，tris-hcl的摩尔浓度为400mm，氯化钠的摩尔浓度为150mm，吐温20的体积百分比为0.8％，曲拉通x-100的体积百分比为1.2％，乙基苯基聚乙二醇的体积百分比为1.5％，氯化钾的质量浓度为6mg/ml，氢氧化钠的质量浓度为15mg/ml。实施例111～130：使用与实施例71～90相同的呼吸道病毒咽拭子样品，分别取100μl样品于12000rpm/min离心10min，弃去上清并加入50μl核酸释放剂，静置10min，然后取10μl与40μlpcr反应液混合进行实时荧光定量pcr扩增，所用核酸释放剂与实施例51～70所用核酸释放剂相同。各实施例的ct值如表4所示，pcr扩增的条件为：逆转录反应：50℃反应30min；热变性反应：95℃反应1min；扩增反应：95℃反应15s，60℃反应30s，45个循环；冷却：25℃反应10s。表4实施例111～120实施例71～80实施例121～130实施例81～90样本123.6426.05样本1127.5628.69样本225.9728.77样本1228.6729.61样本329.5531.28样本1326.2228.32样本430.5232.65样本1427.8829.78样本528.1028.55样本1531.3631.54样本631.6934.12样本1630.6933.69样本725.1926.12样本1729.8929.47样本830.2632.36样本1830.7932.34样本928.9631.59样本1929.2032.69样本1031.6031.35样本2033.5933.06根据图4可知，采用本发明核酸释放剂及核酸pcr扩增方法的实施例均能检测出呼吸道病毒的阳性样本，稳定性较好。另外，从表4可以看到实施例71～90的检测灵敏度略差于实施例111～130，说明实施例71～90采用的核酸释放剂的效果略逊于实施例111～130采用的核酸释放剂。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12