含咪唑的体外无细胞蛋白合成体系及其应用的制作方法

本发明属于蛋白质合成技术领域，具体涉及一种含咪唑的体外无细胞蛋白合成体系。

背景技术：

蛋白质是细胞中的重要分子，几乎参与了细胞所有功能的执行。蛋白的序列和结构不同，决定了其功能的不同(1)。在细胞内，蛋白可以作为酶类催化各种生化反应，可以作为信号分子协调生物体的各种活动，可以支持生物形态，储存能量，运输分子，并使生物体运动(2)。在生物医学领域，蛋白质抗体作为靶向药物，是治疗癌症等疾病的重要手段(1,2)。

咪唑类（imidazoles）为常见的抗真菌药。作用机制为抑制真菌细胞膜麦角固醇的生物合成。其能选择性抑制真菌细胞色素p-450依赖性的14-α-去甲基酶，使14-α-甲基固醇蓄积，细胞膜麦角固醇不能合成，使细胞膜通透性改变，导致胞内重要物质丢失而使真菌死亡。现有文献或专利中报道的咪唑在生产蛋白过程中作为一种纯化试剂或者洗脱试剂成分，主要是发挥纯化蛋白、洗脱蛋白的功能（如cn101479379b、cn105283556a）。

随着科学技术的发展，无细胞表达体系也称为体外蛋白合成系统应运而生，其是以外源目的mrna或dna为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成(3)，是一种快速、省时、便捷的蛋白质表达方式。虽然无细胞蛋白质合成系统有很多优点，但要大量合成蛋白质，能量的供应和反应时间是影响系统效率和成本的关键问题(4)。然而延长体外蛋白质合成的反应时间可能遇到的问题是非特异性物质的合成，会消耗蛋白质合成所需的底物、能量等。因此，通过其他途径提高无细胞蛋白合成的蛋白合成水平是亟需解决的问题。

鉴于此，本发明为了解决上述问题，提供一种全新的体外无细胞蛋白合成体系，其能够提高体外无细胞蛋白合成的能力。

参考文献

1.garciara,rileymr.appliedbiochemistryandbiotechnology.humanapress,1981.263-264p.

2.frommhj,hargrovem.essentialsofbiochemistry.2012.

3.assenbergr,wanpt,geisses,mayrlm.advancesinrecombinantproteinexpressionforuseinpharmaceuticalresearch.curropinstructbiol[internet].2013;23(3):393–402.

4.annezemella,lenathoring,christianhoffmeister,andstefankubick.cell-freeproteinsynthesis:prosandconsofprokaryoticandeukaryoticsystems.chembiochem.2015,16:2420-2431.

技术实现要素：

本发明提供一种全新的体外无细胞蛋白合成体系，其能够提高体外无细胞蛋白合成的能力。其无需从分子水平进行改造，体系组成成分来源常规，能够达到节约成本、操作简单、应用范围广泛的效果。

本发明包括以下几个方面：

第一方面，提供一种提高蛋白表达量的无细胞蛋白合成体系，在无细胞蛋白合成体系中添加咪唑，其中所述咪唑在合成体系中不发挥抗生素功能。

进一步的，所述咪唑的浓度至少为0.199mm。

进一步的，所述咪唑的浓度为0.199-2.27mm。

进一步的，所述咪唑的浓度为0.448mm。

进一步的，所述无细胞蛋白合成体系包含细胞提取物、rna聚合酶、核苷酸混合物、氨基酸混合物。

进一步的，所述体系还包括缓冲剂、钾离子、镁离子、二硫苏糖醇、聚乙二醇及能量再生系统中的一种或多种成分。

进一步的，所述细胞提取物的细胞来源选自原核细胞、真核细胞之一或其组合。

在另一优选例中，所述细胞提取物的细胞来源选自下组的一种或多种类型的细胞：大肠杆菌、哺乳动物细胞(如hf9、hela、cho、hek293)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞。

所述细胞提取物的含量和纯度没有特别限制。优选的，所述细胞提取物或细胞裂解液的浓度(v/v)为20%-70%，较佳地，30-60%，更佳地，40%-50%，以所述蛋白合成体系的总体积计。

在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母或其组合；较佳地，所述的克鲁维酵母细胞包括：乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母，更佳地为乳酸克鲁维酵母。

克鲁维酵母(kluyveromyces)是一种子囊孢子酵母，其中的马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)和乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)是工业上广泛使用的酵母。与其他酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点，如超强的分泌能力，更好的大规模发酵特性、食品安全的级别、以及同时具有蛋白翻译后修饰的能力等。

其中，所述rna聚合酶没有特别限制，可以选自一种或多种rna聚合酶，典型的rna聚合酶为t7rna聚合酶。

其中，所述镁离子来源于镁离子源，没有特别限制，所述镁离子源选自下组：醋酸镁、谷氨酸镁、柠檬酸镁之一或其组合。

其中，所述钾离子来源于钾离子源，没有特别限制，所述钾离子源选自下组：醋酸钾、谷氨酸钾、柠檬酸钾之一或其组合。

其中，所述能量再生系统选自下组：磷酸肌酸/磷酸肌酸酶系统、糖酵解途径及其中间产物能量系统、多糖和磷酸盐能量体系、糖类之一或其组合。

其中，所述缓冲剂选自下组：tris-hcl、tris碱、hepes、tris-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸盐、tris-柠檬酸盐之一或者组合。

其中，聚乙二醇或其类似物的浓度没有特别限制，通常，聚乙二醇或其类似物的浓度(w/v)为0.1-8%，较佳地，0.5-4%，更佳地，1-2%，以所述蛋白合成体系的总重量计。代表性的peg选自下组：peg3000、peg8000、peg6000、peg3350之一或其组合。

其中，所述聚乙二醇包括分子量(da)为200-10000的聚乙二醇，如peg200、400、1500、2000、4000、6000、8000、10000等，较佳地，分子量为3000-10000的聚乙二醇。

其中，核苷酸混合物，选自核苷单磷酸、核苷三磷酸、脱氧核苷酸之一或其组合。

其中，氨基酸混合物，包括至少20种氨基酸，例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。氨基酸也可包括非天然氨基酸，也可包括放射性同位素标记的氨基酸，进一步的，也可以包含经过修饰的氨基酸。

其中，咪唑在合成体系中不发挥抗生素功能是通过真菌培养基进行鉴定。真菌培养基选自不含抗生素的沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、聚山梨酯80培养基、玉米吐温80琼脂培养基、麦芽浸汁琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（ypd或yepd培养基）。

第二方面，一种咪唑在提高蛋白表达量的无细胞蛋白合成体系中的应用。

第三方面，提供一种利用无细胞蛋白合成体系合成外源蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(i)提供第一方面中任一种所述的无细胞蛋白合成体系；

(ii)添加编码外源蛋白的dna模板，反应合成所述的外源蛋白；

还包括可选的步骤(iii)分离或检测所述外源蛋白。

进一步的，反应合适的条件包括反应温度在10℃-40℃，优选的为20-35℃，优选的为20-30℃，更优选的为25℃。

进一步的，反应时间为1-72小时，优选的是2-24小时，更优选的为3-12h；上述反应时间可根据具体情况（如反应底物量、预期获得的蛋白含量等）人为确定，也可以为3-15h，也可以为3-20h，也可以为具体的时间点，如3h、5h、10h、15h、18h、20h。

本发明的优点和有益效果主要为：

（1）在不需要分子改造的基础上，在无细胞蛋白合成体系中添加咪唑能够提高体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力；

（2）验证咪唑在无细胞蛋白合成体系中并非发挥抗真菌作用，在排除咪唑发挥抗菌作用的同时，也说明该体系的安全性；

（3）含有咪唑的无细胞蛋白合成体系操作简单、节约成本、且具有通用性，可用于任何一种无细胞蛋白合成体系。

附图说明

图1是咪唑浓度对体外蛋白质合成体系的影响示意图，其中pc是不加咪唑的阳性对照，nc是不加咪唑和dna模板阴性对照。

图2真菌培养鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。本发明以乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis，简称k.lactis或kl)作为实施例中的细胞提取物来源，但同样的设计和分析、实验方法也适用于其他酵母细胞、动物细胞等真核细胞(哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞)，以及原核细胞(如大肠杆菌)。

如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

技术术语

本发明中，细胞提取物、细胞裂解物、细胞破碎物、细胞溶解产物表达的含义相同。

对比例1不含咪唑的体外无细胞蛋白合成体系

体外无细胞蛋白质合成反应体系：终浓度为9.78mmph为8.0的三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl），80mm醋酸钾，5.0mm醋酸镁，1.5mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.5mm)，0.7mm的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.7mm)，1.7mm二硫苏糖醇（dtt），2%的聚乙二醇，15mm葡萄糖，24mm磷酸三钾，50%体积的酵母细胞提取物，15ng/µl增强型绿色荧光蛋白（egfp）dna。

体外蛋白质合成反应：将上述的反应体系混匀后放置在20-30℃的环境中反应20小时。

荧光蛋白活性测定：反应结束后，立即放置于envision2120多功能酶标仪(perkinelmer)，检测荧光信号强弱，以相对荧光单位值(relativefluorescenceunit,rfu)作为活性单位。

实施例1含咪唑的体外无细胞蛋白合成体系

体外无细胞蛋白质合成反应体系：终浓度为9.78mmph为8.0的三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl），80mm醋酸钾，5.0mm醋酸镁，1.5mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.5mm)，0.7mm的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.7mm)，1.7mm二硫苏糖醇（dtt），2%的聚乙二醇，15mm葡萄糖，24mm磷酸三钾，0.012-2.27mmph为8.0的咪唑（imidazole），50%体积的酵母细胞提取物，15ng/µl增强型绿色荧光蛋白（egfp）dna。

体外蛋白质合成反应：与对比例1的反应条件相同，将上述的反应体系混匀后放置在20-30℃的环境中反应20小时。

荧光蛋白活性测定：反应结束后，立即放置于envision2120多功能酶标仪(perkinelmer)，检测荧光信号强弱，以相对荧光单位值(relativefluorescenceunit,rfu)作为活性单位。

实施例2真菌培养鉴定

在超净工作台中取对比例1体外无细胞蛋白质合成反应体系200μl，滴到不含抗菌素的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（1%酵母提取物、2%葡萄糖、2%蛋白胨和2%琼脂粉）中，用酒精高温灭菌的玻璃涂布棒涂布均匀（注：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂），置于37℃恒温培养箱中60min直到表面的液体都渗透到培养基后，倒置放入37℃恒温培养箱过夜。观察有无菌落产生。

实验结果

从图1中可看出，相对于不含有咪唑的体外无细胞蛋白合成体系（即pc），0.199-2.27mm的咪唑浓度的egfprfu值提高，其中效果最好的为0.448mm咪唑，其荧光蛋白rfu值达4608，比pc提高了13.9%。从真菌培养鉴定结果可以看出，不含咪唑的体外蛋白质合成反应体系液经过培养皿培养无菌落产生，即说明在未添加咪唑的体外蛋白质合成反应体系内自身并不含有真菌，故含有咪唑的体外蛋白质合成反应体系中的咪唑并不是发挥抗真菌作用，即咪唑在合成体系中并不发挥抗生素的作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。