一种检测乙肝病毒的RPA引物、试剂、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体的涉及一种检测乙肝病毒的rpa引物、试剂、试剂盒及其应用。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hbv)属于嗜肝脱氧核糖核酸(dna)病毒组。是引起人类肝脏疾病的主要致病原之一。人体感染乙型肝炎病毒后，可引起细胞免疫及体液免疫应答，并激发自身免疫反应及免疫调节功能紊乱，致使病变的肝细胞产生或释放大量正常或异常的蛋白质，进一步促使免疫损害加重，使病情不断发展，严重危害人类健康。hbv感染是全球性的公共卫生问题，近年来随着科技发展，对hbv的准确及时检测也在不断改进简化。

目前，检测乙肝病毒的方法主要有：酶联免疫吸附法(elisa)、时间分辨荧光免疫分析法(trfia)、荧光定量聚合酶链反应(fq-pcr)等。国内外已有很多利用elisa方法检测乙肝病毒的报道，该方法灵敏度高，操作简单，但所需检测时间也在1～2天，而且抗体制备周期长，费用较高，灵敏度不及fq-pcr。利用分子生物学技术建立的fq-pcr的探针杂交检测等方法，使得乙肝病毒的检测结果更为快速、灵敏、准确。但传统基于pcr的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的热循环仪来进行，限制了其使用范围。

rpa(recombinasepolymeraseamplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板dna上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链dna结合蛋白的帮组下使模板dna解链，引物于模板dna开始配对，并在dna聚合酶的作用下复制延伸。

技术实现要素：

1.要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题在于提供一种检测乙肝病毒的rpa引物、试剂、试剂盒及其应用，其rpa扩增引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，适用范围广；基于该引物建立的乙肝病毒的rpa检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义。

2.技术方案

为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：

一种检测乙肝病毒的rpa引物，该引物由seqidno.1所示的单链dna分子和seqidno.2所示的单链dna分子组成，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-cttgagtatttggtgtcttttggagtgtgg-3’(seqidno.1)；

下游引物：5’-attgagatcttctgcgacgcggcgattgag-3’(seqidno.2)；

所述上游引物的5’端采用fam进行标记，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记。

本发明还提供了一种检测乙肝病毒的rpa试剂，包括上述rpa引物，且所述rpa试剂中，所述上游引物和下游引物在所述rpa试剂终浓度均为0.48μmol/l。

本发明还提供了一种检测乙肝病毒的试剂盒，包括上述rpa引物或上述rpa试剂，以及试纸条。

本发明还提供了上述引物或上述试剂或上述试剂盒的新用途：

(1)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测乙肝病毒中的应用；

(2)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测乙肝病毒的产品中的应用；

(3)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否感染乙肝病毒中的应用；

(4)上述引物或上述试剂或上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品是否感染乙肝病毒的产品中的应用；

(5)上述引物或上述rpa试剂或上述试剂盒在检测乙肝病毒中的应用；

(6)上述引物或上述rpa试剂或上述试剂盒在制备检测乙肝病毒的产品中的应用。

本发明还提供了检测乙肝病毒的方法，包括如下步骤：

(1)用权利要求1所述rpa引物对待测病毒进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；

(2)将步骤(1)中所得的rpa扩增产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析待测病毒是否为乙肝病毒，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为乙肝病毒；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有乙肝病毒。

上述方法中，步骤(1)中所述rpa扩增的模板为待测病毒的dna。

上述方法中，所述rpa扩增的温度为37℃，所述rpa扩增的时间为20-60min。

上述方法应用于检测或辅助检测乙肝病毒。

3.有益效果

(1)本发明针对乙肝病毒的dna序列，设计特异性rpa扩增引物，并基于该引物建立了乙肝病毒的rpa检测方法，可对乙肝病毒进行定性检测。

(2)本发明所提供的乙肝病毒的rpa检测方法具备如下优点：

①仅需一对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；

②本发明只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；

③反应时间仅需20-60min；

④结果易于判断；

⑤检测灵敏度高，可检测到唾液样本中提取的乙肝病毒dna。

综上，本发明的rpa扩增引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，适用范围广；基于该引物建立的乙肝病毒的rpa检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中用于检测和/或辅助检测乙型肝炎病毒的侧向层析试纸示意图；

图2为本发明实施例2中用于检测和/或辅助检测乙型肝炎病毒的引物组特异性检测结果，图中a为阳性对照质粒，b为乙肝病毒dna，c为阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的乙型肝炎病毒dna来源为唾液样本，为中国医科大学附属第一医院提供。

下述实施例中采用英国twistdxinc公司的twistbasic试剂盒进行rpa扩增反应，采用milenia公司的hybridetect1lateralflowstrips侧向层析试纸检测结果。

实施例1、rpa引物及阳性对照质粒的设计

针对乙肝病毒的保守序列，设计检测乙肝病毒的rpa引物组，产物大小为187bp；针对引物组和扩增片段设计阳性对照样品为含有阳性对照的dna质粒。具体引物组和阳性对照样品中含有的阳性对照质粒的序列见表1：

表1引物组和阳性对照的序列

实施例2、用于检测乙肝病毒的rpa试剂盒及其使用方法

1、用于检测乙肝病毒的rpa试剂盒

用于检测乙肝病毒的rpa试剂盒包括实施例1中设计的引物、阳性对照质粒、水化缓冲液、醋酸镁(初始浓度为280mm)、模板dna及无核酸酶纯水，其中，水化缓冲液、醋酸镁(初始浓度为280mm)及无核酸酶纯水均来源于rpa扩增试剂盒twistampbasickits；侧向层析试纸条及分析溶液均来源于hybridetect1lateralflowstrips侧向层析试纸产品。

2、用于检测乙肝病毒的rpa试剂盒的使用方法

(1)实验组设置：以待测样品的dna为模板，采用rpa引物进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；其rpa扩增体系的配制方法为：将水化缓冲液29.5μl，醋酸镁(初始浓度为280mm)2.5μl，18μl的引物、模板dna和无核酸酶纯水进行混合，其中，上游引物和下游引物(终浓度为0.48μmol/l))各2μl，模板dna2μl，无核酸酶纯水12μl；rpa扩增反应条件：先将上述rpa扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到rpa扩增产物；再取20μl扩增产物，与80μl分析溶液混匀后滴加于试纸条加样区，室温孵育5min，观察条带；

(2)对照组设置：设置阳性对照组，将步骤(1)中的rpa引物替换成阳性对照质粒，其他同步骤(1)；设置阴性对照组，将步骤(1)中的dna模板替换成超纯水，其他同步骤(1)。

结果如图2(a：阳性对照样品；b：乙肝病毒dna；c：阴性对照)所示：由图2可知，阳性对照及乙肝病毒扩增后产物滴加在试纸条上，有两条清晰条带，而阴性对照只有一条质控带。即可知检测判定规则为：如图1所示，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为乙肝病毒；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有乙肝病毒。

由上述内容可知，本发明提供的用于检测和/或辅助检测乙肝病毒的引物、试剂及试剂盒可以有效检测乙肝病毒。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。