一种强启动子及其质粒载体和应用的制作方法

技术领域：本发明属于生物技术领域，涉及一种强启动子，尤其涉及从黏着剑菌中分离、克隆得到的强启动子，还涉及包含该强启动子的质粒及含有该质粒载体的转化子，以及他们在异源或同源蛋白表达方面的应用。

背景技术：

启动子是基因的一个组成部分可以被rna聚合酶识别，并起始启动子后面基因的转录，启动子启动强度的强弱对基因操作中外源基因的表达效率有着直接的影响。代谢工程常常需要表达外源基因或者调控內源基因的表达，而启动子的选择对基因的表达调控至关重要。启动子影响基因的转录水平，影响人工合成途径或本源途径中各基因间协调性，继而影响菌株的代谢功能。

变形菌门是细菌中最大的一门，根据16srna可以分为五个纲，分别为α-变形菌、β-变形菌、γ-变形菌、δ-变形菌和ε-变形菌。其中α-变形菌中，包括很多动物和植物致病菌，如：流产布鲁氏菌、致瘤农杆菌等，以及很多可以产生具有一定功能次级代谢产物的菌种，如可以产生物乙醇的运动发酵单胞菌，可以产维生素b12的脱氮假单胞菌、苜蓿中华根瘤菌和黏着剑菌等。为了进一步研究这些菌种的生理特征，以及扩大某一α-变形菌产次级代谢产物的能力，往往需要在菌体内过量表达一个或多个基因，这时就需要一个高效的启动子原件作为基础。然而，α-变形菌中可用的高效启动子数量非常有限。

发明人经过长期研究探索，发现了可以应用于多种α-变形菌的一种强启动子。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一个强启动子，包含该强启动子的质粒载体及其应用。本发明以ensiferadhaerenscasidaa(黏着剑菌)为模板，扩增获得了一个强启动子序列，以绿色荧光蛋白为报告基因，对该启动子进行了评价。这个强启动子还可以应用于黏着剑菌外的其他多种α-变形菌门菌种中。该发明扩展了α-变形菌门的启动子元件，对于α-变形菌门菌种中的基因表达、遗传基因操作和菌株改良有重要意义。

第一方面，本发明提供了一种强启动子，其核苷酸序列任选自如下(a)、(b)或(c)所述的序列：

(a)强启动子为序列表seqidno:1所示的核苷酸序列；

(b)与序列表seqidno:1具有75％以上一致性，且具有启动子功能的核苷酸序列；

(c)在高严谨条件下与(a)或(b)所述的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列。

优选地，所述(b)为与序列表seqidno:1具有95％以上同源性，且具有启动子功能的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了一种含有强启动子的质粒载体，所述质粒载体为游离型或整合型载体。优选地，所述游离型载体为含有革兰氏阴性菌均可识别的复制子和mob基因的广泛宿主穿梭质粒载体，进一步优选pbbr1mcs2；所述整合型载体为携带有靶基因翼侧500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体，进一步优选puc系列质粒。

所述质粒载体还包括编码目的多肽的核酸序列。所述编码目的多肽的核酸序列包括荧光蛋白；优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有第二方面所述的质粒载体。

优选地，宿主细胞为α-变形菌门；进一步优选地，为苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)、新月柄杆菌(caulobactercrescentus)、脱氮假单胞菌(pseudomonasdenitrificans)、致瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、豆科根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)或黏着剑菌(sinorhizobiumadhaerensorensiferadhaerens)中的一种；更优选地为黏着剑菌(sinorhizobiumadhaerensorensiferadhaerens)。

第四方面，本发明提供第一方面所述强启动子或第二方面所述质粒载体或第三方面所述宿主细胞在启动目的基因表达的应用。

附图说明

图1：质粒载体pbbr-p21-gfp的图谱。

图2：启动子在不同菌株中的表达效果图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

实施例1：含启动子质粒载体的构建

1、含报告基因载体的制备

利用表1的引物gfp-ecori-f、gfp-xhoi-r，以ece164质粒为模板，通过pcr扩增，引入ecori和xhoi酶切位点，得到绿色荧光蛋白基因gfp片段。经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收，得到纯化的gfp片段。将纯化的gfp片段和pbbr1mcs2质粒分别用ecori和xhoi进行双酶切，将两种双酶切产物经过t4连接酶4℃过夜连接。连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-gfp。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-gfp备用。

2、含强启动子质粒的制备

分别利用表1的引物对p21-xbai-f和p21-ecori-r，以ensiferadhaerenscasidaa(黏着剑菌)基因组为模板，通过pcr扩增，引入ecori和xbai酶切位点，得到启动子p21片段，经电泳验证，dpni酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的p21片段。

将上述纯化的p21片段和pbbr-gfp质粒分别用ecori和xbai进行双酶切，将p21片段的双酶切产物分别与pbbr-gfp质粒双酶切的产物经过t4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固体平板上，培养16h后进行菌落pcr检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pbbr-p21-gfp。用质粒试剂盒提取质粒pbbr-p21-gfp备用，质粒图谱如图1所示。启动子p21的核苷酸序列如seqidno.1所示。

实施例2：启动子p21在不同菌种中的活性测定

1、转化——三亲本转化法

以苜蓿中华根瘤菌为例，将实施例1中的质粒pbbr-p21-gfp按照三亲本方法转入苜蓿中华根瘤菌中，得到苜蓿中华根瘤菌:sm/pbbr-p21-gfp。具体步骤如下：

(1)接种新活化的苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638、大肠杆菌(含有相应的质粒)以及辅助载体mt616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到od值为1.0左右；

(2)无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌cgmccno.9638的菌液、mt616和大肠杆菌的菌液各500μl转移至1.5ml无菌ep管中并在4℃，12,000rpm条件下离心1min。

(3)在无菌条件下弃掉上清液，并用1ml0.85％的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

(4)再次在4℃，12,000rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

(5)分别采用500μl新鲜的lb液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和mt616的沉淀进行悬浮。

(6)分别取各2μl的三种菌液，滴在不添加抗性的lb固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

(7)待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

(8)挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

(9)从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落pcr验证。得到阳性菌，命名为sm/pbbr-p21-gfp。

2、不同菌株的制备

按三亲本转化法，将实施例1中的质粒pbbr-p21-gfp转入到运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis，简写为zm)、致瘤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens，简写为at)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus，简写为ba)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens，简写为pf)、豆科根瘤菌(rhizobiumleguminosarum，简写为rl)、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti，简写为sm)和黏着剑菌(ensiferadhaerens，简写为ea)又叫跟黏着中华根瘤菌(sinorhizobiumadhaerens)中，得到含质粒的运动发酵单胞菌：zm/pbbr-p21-gfp；致瘤农杆菌：at/pbbr-p21-gfp；流产布鲁氏菌：ba/pbbr-p21-gfp；荧光假单胞菌：pf/pbbr-p21-gfp；豆科根瘤菌：rl/pbbr-p21-gfp；苜蓿中华根瘤菌sm/pbbr-paraa-gfp；黏着剑菌：ea/pbbr-p21-gfp。

3、启动子p21在运动发酵单胞菌中的活性测定

将实施例2第2部分中的菌株zm/pbbr-p21-gfp在含有卡那霉素100mg/l的lb/mc固体平板上划线活化，挑取单菌落接种至5ml的含卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基中。28℃、200r/min培养16h后，以10％的接种量将上述菌液转接至1.8ml的含有卡那霉素100mg/l的lb/mc液体培养基的24孔板中，置于孔板摇床中28℃、700rpm、80％湿度震荡培养。定时取样测定od600和荧光(细胞以4000转/分离心10分钟，弃上清，用等量双蒸馏水重悬细胞)，测定菌株在吸收波长为488nm和放射波长为523nm下的荧光表达强度。不含质粒的出发菌株为对照。结果见图2。

4、启动子p21在致瘤农杆菌中的活性测定

yeb培养基：牛肉浸膏5g/l、酵母浸膏1g/l、蛋白胨5g/l、蔗糖5g/l、mgso4·h2o0.5g/l(ph调到7.0)。

将实施例2第2部分中的菌株at/pbbr-p21-gfp在含有卡那霉素100mg/l的yeb固体平板上划线活化，其后续操作同实施例2第3部分。不含质粒的出发菌株为对照。结果见图2。

5、启动子p21在流产布鲁氏菌中的活性测定

流产布鲁氏菌培养基：蛋白胨10g/l、牛肉浸粉5g/l、葡萄糖10g/l、氯化钠5g/l(ph调到7.5)。

将实施例2第2部分中的菌株ba/pbbr-p21-gfp在含有卡那霉素100mg/l的流产布鲁氏菌培养基固体平板上划线活化，其后续操作同实施例2第3部分。不含质粒的出发菌株为对照。结果见图2。

6、启动子p21在荧光假单胞菌中的活性测定

将实施例2第2部分中的菌株pf/pbbr-p21-gfp在含有卡那霉素100mg/l的yeb固体平板上划线活化，其后续操作同实施例2第3部分。不含质粒的出发菌株为对照。结果见图2。7、启动子p21在豆科根瘤菌中的活性测定

yem培养基：甘露醇5g/l、酵母抽提物0.5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、nacl0.1g/l、k2hpo40.5g/l、葡萄糖酸钠5g/l。

将实施例2第2部分中的菌株rl/pbbr-p21-gfp在含有卡那霉素100mg/l的yem固体平板上划线活化，其后续操作同实施例2第3部分。不含质粒的出发菌株为对照。结果见图2。

8、启动子p21在苜蓿中华根瘤菌中的活性测定

lb/mc培养基：lb培养基补充有mgcl2(2.5mm)、cacl2(2.5mm)。

将实施例2第2部分中的菌株sm/pbbr-p21-gfp在含有卡那霉素100mg/l的lb/mc固体平板上划线活化，其后续操作同实施例2第3部分。不含质粒的出发菌株为对照。结果见图2。

9、启动子p21在跟黏着中华根瘤菌中的活性测定

将实施例2第2部分中的菌株sa/pbbr-p21-gfp在含有卡那霉素100mg/l的lb/mc固体平板上划线活化，其后续操作同实施例2第3部分。不含质粒的出发菌株为对照。结果见图2。

10、启动子p21在7种不同菌株中的表达强度分析

由图2可知，启动子p21在7种菌株中对绿色荧光蛋白表达基因均有较强的启动效果。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>一种强启动子及其质粒载体和应用

<130>2019.9.12

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1000

<212>dna

<213>黏着剑菌(ensiferadhaerens)

<400>1

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