技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种快速提取石蜡组织rna的方法。
背景技术：
：：福尔马林固定石蜡包埋组织(formalinfixedandparaffinembeddedtissues，ffpe，以下简称ffpe)处理方法能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本，是医疗机构最常用的保存病理组织的方法。医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，数量巨大的归档ffpe样本为回顾性研究、阐明疾病机制、发现治疗靶标和指示预后等方面提供了宝贵的资源。从归档ffpe组织中提取核酸使研究人员能够进行各种类型的下游研究，包括基于聚合酶链反应(pcr)dna扩增的诊断和回顾性分子遗传学研究，因此从ffpe样品中分离出高纯度高质量的核酸是下游研究顺利进行的最基本前提。然而，从ffpe组织中提取高质量核酸是困难且具有挑战性的。1)生物样本经福尔马林固定以及石蜡包埋，导致组织核酸受损，从而导致广泛的dna和rna片段化且不利于后续的核酸分离。2)目前常规的提取方法大多是先使用有机溶剂进行脱蜡，如二甲苯等，再进行纯化如酚氯仿抽提法，离子交换法，盐析法，硅胶柱法等；但由于脱蜡效率以及试剂残留问题，可能会对下游的实验造成干扰；且得到的dna和rna纯度低，难以满足下游试验的要求。但这些方法往往只能提取出其中一种核酸而浪费另一种核酸，且耗时长，需要的样本数量较多，临床上的分子生物学研究往往需要同时提取dna和rna，当样本有限时，则可能影响下游试验的进行。因此临床上急需一种能够从ffpe样本中共分离dna和rna的试剂盒及方法，所提dna和rna纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下下游试验的正常进行；并可以保证研究中使用的dna和rna的来源完全相同。技术实现要素：：本发明的目的是提供一种快速提取石蜡组织rna的试剂盒和方法。本发明的快速提取石蜡组织rna的试剂盒，包括以下组分：脱蜡混合液bufferal：0.5～1.5％的tween-20(v/v)、5～15mm的tris·cl；裂解液bufferrlt：400～600mm的tris·cl，15～25mm的edta，质量分数0.1～1％的sds，80～120mm的dtt；dnasei工作混合液：8～12mm的tris·cl、0.1mm的cacl2、8～12mm的mncl2和dnasei0.5～7.5u/μl；纯化液1：1～5％chelex-100(m/v，g/ml)，溶剂为te缓冲液；纯化液2：4～7％chelex-100(m/v，g/ml)，溶剂为depc处理水；proteinasek。优选地，所述的脱蜡混合液bufferal包含体积分数1％的tween-20，10mm的tris·cl。优选地，所述的裂解液bufferrlt包含500mm的tris·cl，20mm的edta，质量分数0.5％的sds，100mm的dtt。优选地，所述的dnasei工作混合液包含10mmtris·cl，0.1mmcacl2，10mmmncl2、0.5u/μldnasei。优选地，所述的纯化液1包括5％g/ml的chelex-100，溶剂为te缓冲液。优选地，所述的纯化液2包括6％g/ml的chelex-100，溶剂为depc水。本发明的第二个目的是提供一种快速提取石蜡组织rna的方法，包括以下步骤：a、脱蜡：将ffpe样品置于脱蜡混合液bufferal中进行脱蜡；b、组织的裂解：将脱蜡后的样品用裂解液bufferrlt和proteinasek裂解，得裂解液；c、纯化：裂解液中加入纯化液1，混匀孵育，离心取上清，将上清转入新的管中，再加入氯仿混匀，离心取上清转入新的管中，得到纯化液；d、rna分离：在纯化液中加入dnasei工作混合液，混匀孵育，再加入纯化液2，混匀孵育，离心取上清至无rnase离心管中，得到rna。优选，具体步骤如下：a、脱蜡：刮取1片10μm厚、面积约1×1cm2的ffpe样品至1.5ml离心管中，加入100μl脱蜡混合液bufferal,将贴在管壁上的组织全部浸入其中，90℃孵育10min；b、组织的裂解(1)加入120μl裂解液bufferrlt，2ulproteinasek使其终浓度为10mg/l，涡旋震荡混匀56℃孵育15min400rpm,直至样品完全溶解.80℃孵育15min，离心，使管壁上的溶液收集到管底；c、纯化(1)加入100μl纯化液1,轻轻混匀，99℃450rmp孵育10min,立即放在冰上静置2min,10500xg离心15min；(将孵育后的样本立即放在冰上可以提高石蜡的获得量，脱蜡彻底)(2)转移上清至新的ep管中金属浴加热至45℃后，加入100μl氯仿充分混匀后，10500xg离心15min,吸取上清180μl至新的ep管中。(吸取上层相时切勿吸取过多以免吸到中层相杂质，对后续实验造成影响。)d、rna分离(1)在步骤c的(2)的含有上清的新的ep管中加入2μldnasei工作混合液，使用移液器吹打混匀，37孵育15min,94℃孵育5min；(2)加入100μl纯化液2,轻轻混匀,100℃450rmp孵育15min,10500xg离心15min，转移180μl上清至新的无rnase离心管中。分离所得的rna若不马上使用，建议保存在-80℃冰箱中。本发明的方法脱蜡效率高且不会有试剂残留问题，1～3片肿瘤组织切片即可获得足够的rna，所提取的rna含量和纯度高，操作过程简便快捷，重复性高，且所需样本量少。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：采用试剂盒，对100例样品分离rna，并与常用试剂盒进行平行对比，样品为2年内的石蜡包埋临床样本。1.提取试剂①rna分离所需a、脱蜡混合液bufferal：1％的tween-20(v/v)，10mm的tris·cl，其配制方法为：先配置1m的tris·cl：称取6.055gtris置于100ml烧杯中，用depc水定容至50ml，充分混匀后转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，备用；10mm的tris·cl的配置：吸取100ul1m的tris·cl用depc水定容至10ml转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，充分混匀，备用；取60ul的tween-20，用10mm的tris·cl定容至6ml，涡旋震荡混匀，即为脱蜡混合液bufferal。b、裂解液bufferrlt：500mm的tris·cl，20mm的edta，质量分数0.5％的sds，100mm的dtt，其配制方法为：1m的edta的配置：称取14.612gedta置于100ml烧杯中，用depc水定容至50ml，充分混匀后转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，备用；5％的sds的配置：称取2.5gsds置于100ml烧杯中，用depc水定容至50ml，充分混匀后转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，备用；1m的dtt的配置：称取7.713gdtt置于100ml烧杯中，用depc水定容至50ml，充分混匀后转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，备用；裂解液bufferrlt的配置：取25ml1m的tris·cl、1ml1m的edta、5ml5％的sds、5ml1m的dtt于100ml烧杯中，用depc水定容至50ml，充分混匀后转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，备用。c、dnasei工作混合液：10mmtris·cl，0.1mmcacl2，10mmmncl2、0.5u/μldnasei，其配制方法为：10mm的cacl2的配置：称取0.0555gcacl2置于100ml烧杯中，用depc水定容至50ml，转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，充分摇匀，备用；100mm的mncl2的配置：称取0.629gmncl2置于100ml烧杯中，用depc水定容至50ml，转移至无rnase、dnase的玻璃试剂瓶中，充分摇匀，备用；dnaseibuffer的配置：取100ul100mmtris·cl、10ul10mmcacl2、100ul100mmmncl2，于转移至无rnase、dnase的离心管中再加入790uldepc水定容至1ml，涡旋震荡混匀后备用；dnasei工作混合液配置：dnaseibuffer与1u/μldnasei按体积比1:1的比例配置使用。c、纯化液1：5％chelex-100(m/v，g/ml)溶于te缓冲液，其配制方法为：称取0.5gchelex-100于rnase、dnase的试剂瓶中，加入10mlte缓冲液，切勿震荡，使用之前轻轻摇匀即可；d、纯化液2：6％chelex-100(m/v，g/ml)溶于depc水，其配制方法为：称取0.6gchelex-100于rnase、dnase的试剂瓶中，加入10mldepc水，切勿震荡，使用之前轻轻摇匀即可；2.提取方法步骤1.脱蜡(1)刮取1片10μm厚、面积约1×1cm2的ffpe样品至1.5ml离心管中，加入100μl脱蜡混合液bufferal，将贴在管壁上的组织全部浸入其中，90℃孵育10min；步骤2.组织的裂解(1)再加入120μl裂解液bufferrlt，2ulproteinasek(使终浓度为10mg/l)涡旋震荡混匀，56℃孵育15min400rpm，直至样品完全溶解，80℃孵育15min。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；步骤3.纯化(1)往管中再加入100μl纯化液1，轻轻混匀，99℃450rpm孵育10min,立即放在冰上静置2min,10500×g离心15min；(将孵育后的样本立即放在冰上可以提高石蜡的获得量，脱蜡彻底)(2)转移上清液至新的ep管中金属浴加热至45℃后，加入100μl氯仿充分混匀后，10500×g离心15min,吸取上清180μl至新的ep管中。(吸取上层相时切勿吸取过多以免吸到中层相杂质，对后续实验造成影响。)步骤4.rna分离(1)加入2μldnasei工作混合液至上一步骤的ep管中，使用移液器吹打混匀，37孵育15min,94℃孵育5min；(2)再加入100μl纯化液2，轻轻混匀,100℃450rpm孵育15min,10500×g离心15min；转移180μl上清至新的无rnase离心管中，得到rna。分离所得的rna若不马上使用，建议保存在-80℃冰箱中。3、所提rna含量值检测采用qubit4对本发明试剂盒提取的rna进行含量值检测，结果如表1：表1本发明方法提取的rna含量以及常用试剂盒提取的rna含量结果显示，本发明所述试剂盒所提取的核酸得率显著高于常用离心柱法，且其质量和纯度均优于常用离心柱法。对比例1：本对比例与实施例1基本相同，只是用二甲苯替代脱蜡混合液bufferal用于脱蜡，以及ffpe样品大小不同。结果如表3所示表3从表3可以看出，用tween(脱蜡混合液bufferal)替代二甲苯能够有效的提高rna的浓度和质量(纯度)。对比例2：本对比例与实施例1基本相同，只是用普通缓冲液裂解(50mmtri-hcl、20mmedta、100mmnacl，ph7.5)二甲苯替代裂解液bufferrlt用于脱蜡，以及ffpe样品大小不同。结果如表4所示表4测定值(均值)浓度(ng/μl)a260/a280a260/a230裂解液bufferrlt3462.012.60普通缓冲液裂解2451.762.11从表4可以看出，用tween(脱蜡混合液bufferal)替代二甲苯能够有效的提高rna的浓度和质量(纯度)。对比例3：本对比例与实施例1基本相同，只是用传统柱纯化替代纯化液1和纯化液2用于脱蜡，以及ffpe样品大小不同。结果如表5所示表5测定值(均值)浓度(ng/μl)a260/a280a260/a230本发明的纯化液1和23682.022.54传统柱纯化2571.822.15从表5可以看出，用chelex-100替代传统柱层析能够有效的提高rna的浓度和质量(纯度)。实施例2：本实施例与实施例1基本相同，只是提取试剂不同，具体如下：脱蜡混合液bufferal：0.5％的tween-20(v/v)、5mm的tris·cl；裂解液bufferrlt：400mm的tris·cl，15mm的edta，质量分数0.1％的sds，80mm的dtt和10mg/l的proteinasek；dnasei工作混合液：8mm的tris·cl、0.1mm的cacl2、8mm的mncl2和dnasei0.5u/μl；纯化液1：1％chelex-100(m/v，g/ml)，溶剂为te缓冲液；纯化液2：4％chelex-100(m/v，g/ml)，溶剂为depc处理水。实施例3：本实施例与实施例1基本相同，只是提取试剂不同，具体如下：脱蜡混合液bufferal：1.5％的tween-20(v/v)、15mm的tris·cl；裂解液bufferrlt：600mm的tris·cl，25mm的edta，质量分数1％的sds，120mm的dtt；dnasei工作混合液：12mm的tris·cl、0.1mm的cacl2、12mm的mncl2和dnasei7.5u/μl；纯化液1：5％chelex-100(m/v，g/ml)，溶剂为te缓冲液；纯化液2：7％chelex-100(m/v，g/ml)，溶剂为depc处理水。当前第1页1 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