本发明属于植物杀菌剂技术领域，具体是涉及筛选有效杀菌剂的方法。
背景技术：
甘蔗(saccharumofficinaruml.)是最主要的糖料作物之一。我国作为世界第三大蔗糖生产国，蔗糖总产量达到1367.9万t/年，占全国食糖总产量的92.2％以上，可见甘蔗生产对国民经济的可持续发展具有重要意义。然而，甘蔗生产长期受到病害的影响，严重影响了甘蔗蔗茎产量以及蔗糖分，对蔗糖产业造成了巨大损失，严重阻碍了蔗糖产业的可持续发展。甘蔗梢腐病是甘蔗伸长期最主要的一种真菌性病害，该病主要发生在高温高湿的7-9月份，易感病品种发病率高达70％-90％，抗病品种发病率也有5％-30％。该病最早发现于爪哇，随后迅速传播，目前几乎遍及所有甘蔗生产国和地区，已发展成为一种世界性真菌病害。甘蔗梢腐病病原菌主要通过气流传播到甘蔗心叶侵染为害，造成叶片死亡，植株生长受阻，严重可造成植株死亡，导致甘蔗减产5％-20％，甘蔗糖分降低3％，对感病甘蔗品种造成的影响更加显著。我国各甘蔗生产区均有发生梢腐病危害，近几年，甘蔗梢腐病在我国广大蔗区呈现出了逐渐加重的趋势，严重影响了当季甘庶产量和庶糖分，阻碍了甘庶产业的可持续发展。
目前，利用杀菌剂防治甘蔗梢腐病是最快捷、最有效的措施，而杀菌剂的选择对梢腐病的防治效果起决定性作用。目前，对于杀菌剂的筛选试验一般采用活体植株法，即在实验大棚中布置桶栽实验，种植经不同杀菌剂处理的甘蔗种茎，在甘蔗苗3-4片叶时接种梢腐病病原菌，10天后调查梢腐病发病率，计算田间人工接种条件下各杀菌剂处理的防治效果；该方法存在着测定周期长、影响因素多、工作量大等弊端。而对于离体条件下甘蔗梢腐病病原菌有效杀菌剂的筛选方法尚未见有相关报道。因此，迫切的需要建立一种快速、准确和有效的杀菌剂对甘蔗梢腐病病原菌的毒力检测方法，以确定和比较不同杀菌剂对甘蔗梢腐病病原菌的抑菌效果和毒力，为进一步的田间药效试验和混配药剂的研制提供理论依据，
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种离体条件下快速、有效甘蔗梢腐病病原菌有效杀菌剂的筛选方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种甘蔗梢腐病病原菌有效杀菌剂的筛选方法，包括以下步骤：
(1)病原菌株活化：取保存于实验室中的甘蔗梢腐病病原菌株接种于含有氨苄青霉素的pda培养基中，放置于28℃恒温培养箱中培养5天；
(2)含药平板的配置：用无菌水将拟进行筛选的杀菌剂配置成10-15g/l的母液，再用无菌水稀释成6个浓度梯度的药液，取2ml不同稀释浓度的药液分别加入98ml冷却至
50-55℃pda培养基中，充分混匀后分装于5个培养皿(φ＝9cm)中，冷却后即可得含药平板，以无药平板为对照；
(3)接种：用打孔器(φ＝5mm)在活化好的甘蔗梢腐病病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼转接于含药平板中央，每个处理5次重复，放置于28℃恒温培养箱中培养4-5天；
(4)抑制数据测定：培养结束后，以菌饼为中心在平板底部画两条垂直线，用直尺沿垂直线测量菌落直径，取平均值，测定杀菌剂抑制率，计算ec50；
(5)根据步骤(4)计算出来的ec50，筛选出ec50≤30mg/l的杀菌剂或者复配杀菌剂进行田间防治试验。
本发明中的含有氨苄青霉素的pda培养基的配制是先按照现有的pda培养基配方配制，灭菌后冷却至50-55℃再添加100μg/ml的氨苄青霉素，即可得到。
本发明的含有氨苄青霉素的pda培养基中含100μg/ml氨苄青霉素，其可以起到抑制其他杂菌污染的作用。氨苄青霉素不能过多，也不能太少；少了难以起到有效的抑制作用，杂菌依然会生长，影响后续的操作及检测；也不要添加过多，否则会抑制梢腐病病原菌的生长。
作为技术方案的优选，所述含有氨苄青霉素的pda培养基均需121℃高压灭菌20min后使用。
作为技术方案的优选，所述培养皿需经121℃高压灭菌20min后使用。
作为技术方案的优选，所述无药平板为等体积无菌水代替药液配置成的平板。
作为技术方案的优选，所述打孔器需经过酒精灯灼烧灭菌，冷却后方可使用。
作为技术方案的优选，所述接种操作均需在无菌条件下进行。
本发明的有益效果：
本发明的方法杀菌剂测定周期短，仅需要5天时间；测定过程中供试杀菌剂均为高含量原药，不受施药方法和剂型的影响；测定过程在离体条件下进行，不受作物生长情况的影响；试验操作简单，耗费试材少，简便、准确、快速的确定和比较不同杀菌剂对甘蔗梢腐病病原菌的抑菌效果和毒力，为筛选出田间药效试验和混配药剂的研制提供依据。克服了传统活体植株法中存在的试验周期长、影响因素多、工作量大等缺陷。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施过程中需要预先制备含有氨苄青霉素的pda培养基：200g马铃薯去皮洗净切成小块，加水1000ml，煮沸半小时，用四层纱布过滤，在滤液中加蔗糖20g，琼脂2％，加热溶解后补足水分，ph自然，121℃高压灭菌20min，冷却至50-55℃再添加100μg/ml的氨苄青霉素即可。
实施例1
一种甘蔗梢腐病病原菌有效杀菌剂的筛选方法，包括以下步骤：
1、病原菌株活化：取保存于实验室中的甘蔗梢腐病病原菌株接种于预先配置好的含有氨苄青霉素的pda培养基中，放置于28℃恒温培养箱中培养5天；
2、含药平板的配置：用无菌水分别将50％嘧菌环胺水分散粒剂、50％啶酰菌胺水分散粒剂、240g·l-1噻呋酰胺悬浮剂、22.5％啶氧菌酯悬浮剂、430g.l-1戊唑醇悬浮剂和50％醚菌酯水分散粒剂6种杀菌剂配置成10g/l的母液，再用无菌水稀释成6个浓度梯度的药液(见表1)，取2ml不同稀释浓度的药液分别加入98ml，冷却至50℃左右的pda培养基中，充分混匀后分装于5个培养皿(φ＝9cm，预先经121℃高压灭菌20min)中，冷却后即可得含药平板，平板含药浓度见表1；取2ml无菌水加入98ml，冷却至50℃左右的pda培养基中，配置成无药平板，作为对照；
表1杀菌剂稀释浓度和平板含药浓度
3、接种：用打孔器(φ＝5mm，经过酒精灯灼烧灭菌，冷却)在活化好的甘蔗梢腐病病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼转接于含药平板中央，每个处理5次重复，放置于28℃恒温培养箱中培养5天；
4、抑制数据测定：培养5天后，以菌饼为中心在平板底部画两条垂直线，用直尺沿垂直线测量菌落直径，取平均值，测定杀菌剂抑制率。
根据公式计算抑制率：
抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5mm)]×100％
表26种杀菌剂产生的菌落直径及对甘蔗梢腐病病原菌的抑制率
根据生物统计机率值换算表，将抑制率换算成抑制机率值；用spss软件进行统计分析，以处理浓度(mg/l)的对数值为横坐标，相应抑制机率值为纵坐标求出毒力回归方程，并求出抑制中浓度ec50；实验结果见表3。
表36种杀菌剂对甘蔗梢腐病病原菌的毒力
5、根据表3，筛选出ec50≤30mg/l的杀菌剂进行田间防治试验，本次筛选出来的是22.5％啶氧菌酯悬浮剂、430g.l-1戊唑醇悬浮剂、50％醚菌酯水分散粒剂。
实施例2
一种甘蔗梢腐病病原菌有效杀菌剂的筛选方法，包括以下步骤：
1、病原菌株活化：取保存于实验室中的甘蔗梢腐病病原菌株接种于预先配置好的含有氨苄青霉素的pda培养基pda培养基中，放置于28℃恒温培养箱中培养5天；
2、含药平板的配置：用无菌水分别将50％多菌灵、65％代森锌、75％百菌清、50％咪鲜胺锰盐、70％甲基硫菌灵、70％代森锰锌和10％苯醚甲环唑7种杀菌剂配置成10g/l的母液，再用无菌水稀释成6个浓度梯度的药液(见表4)，取2ml不同稀释浓度的药液分别加入98ml，冷却至50℃左右的pda培养基中，充分混匀后分装于5个培养皿(φ＝9cm，预先经121℃高压灭菌20min)中，冷却后即可得含药平板，平板含药浓度见表4；取2ml无菌水加入98ml，冷却至50℃左右的pda培养基中，配置成无药平板，作为对照；
表4杀菌剂稀释浓度和平板含药浓度
3、接种：用打孔器(φ＝5mm，经过酒精灯灼烧灭菌，冷却)在活化好的甘蔗梢腐病病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼转接于含药平板中央，每个处理5次重复，放置于28℃恒温培养箱中培养5天；
4、抑制数据测定：培养5天后，以菌饼为中心在平板底部画两条垂直线，沿垂直线测量菌落直径，取平均值，，测定杀菌剂抑制率。
根据公式计算抑制率：
抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-5mm)]×100％
表57种杀菌剂产生的菌落直径及对甘蔗梢腐病病原菌的抑制率
根据生物统计机率值换算表，将抑制率换算成抑制机率值；用spss软件进行统计分析，以处理浓度(mg/l)的对数值为横坐标，相应抑制机率值为纵坐标求出毒力回归方程，并求出抑制中浓度ec50；实验结果见表6。
表67种杀菌剂对甘蔗梢腐病病原菌的毒力
5、根据表6筛选出ec50≤30mg/l的杀菌剂进行田间防治试验，本次筛选出来的是50％咪鲜胺锰盐、10％苯醚甲环唑。