一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及检测非洲猪瘟病毒的方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及检测非洲猪瘟病毒的方法。

背景技术：

在科学实验或者其他行业中，对样品中含有的待测病毒进行检测时，一般都需要选用一个阳性对照样本和内参基因样本，来指示实验结果的正确性。现有技术中，错误或者不当选用阳性对照样本和内参基因样本，都不能很好的指示整个病毒检测过程，容易造成假阳性或者假阴性现象，降低检测结果的准确性。因此，需要选择合适的阳性对照样本和内参基因样本，来准确指示检测结果。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒及检测非洲猪瘟病毒的方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒。

进一步地，该试剂盒还包括vp73的上游引物，vp73的下游引物，β-actin的上游引物，β-actin的下游引物；

进一步地，该试剂盒还包括vp73的探针，β-actin的探针。

进一步地，所述vp73的上游引物为：

5’-cggatatgactgggacaacca-3’(seqidno.：1)，

所述vp73的下游引物为：

5’-agggatctacaagcgtgtaaacg-3’(seqidno.：2)，

所述β-actin的上游引物为：

5’-ccagttcgccatggatgac-3’(seqidno.：4)，

所述β-actin的下游引物为：

5’-atgccggagccgttgtc-3’(seqidno.：5)，

进一步地，所述vp73的探针为：

5’-fam-acacctttagagggcg-tamra-3’(seqidno.：3)，

所述β-actin的探针为：

5’-cy5-tattgctgcgctcgtg-bhq2-3’(seqidno.：6)，其中其中vp73探针和β-actin探针中的fam、cy5为荧光基团，tamra和bhq2为淬灭基团。

一种检测非洲猪瘟病毒的方法，该方法采用以上所述的试剂盒，以含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒溶液作为阳性对照标准品，以猪肌动蛋白基因β-actin作为内参对照基因，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的核酸；

(2)以待测样本的核酸和含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒为模板进行基因扩增反应；

(3)对扩增结果进行分析。

进一步地，含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒溶液的配置：

向含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒干粉中加入rnasefreewater溶解，得到质粒溶液，质粒溶液中质粒的浓度为0-10⁶copies/ml。

进一步地，所述基因扩增反应为荧光定量pcr反应。

进一步地，荧光定量pcr反应的反应体系中，vp73的上游引物，vp73的下游引物，β-actin的上游引物，β-actin的下游引物；vp73的探针，β-actin的探针的使用浓度均为0.2-1μm。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的检测asfv的试剂盒通过选取β-actin作为内参质控基因，既监控了样品核酸的提取过程又监控了基因扩增反应过程，增大了检测结果的准确性，减少了假阴性结果。

(2)本发明提供的试剂盒能够广泛用于各种待测样品中asfv的检测；当待测样品为血液样本时，采用该试剂盒能够方便、快速地检测出血液样本中是否含有非洲猪瘟病毒；当待测样本为其他样本，例如科学研究中自行制备的样本时，应用该试剂盒能够快速、准确的检测出待测样本中asfv的浓度。该试剂盒的使用方法操作简便，价格低廉，耗时短，具有较高的灵敏性和特异性，具有广阔的市场前景和商业价值。

(3)本发明以β-actin基因作为内参对照基因，它在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时用来做参照物，可增加了检测结果的准确性。

(4)本发明提供的检测非洲猪瘟病毒(asfv)的检测方法，以含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒溶液作为阳性对照标准品，以猪肌动蛋白基因β-actin作为内参对照基因，从样品处理的最初步骤监测整个病毒检测过程，增加了检测结果的准确性。

附图说明

图1为实施例2所建立的检测非洲猪瘟病毒的方法稳定性验证结果图。

图2为实施例2所建立的检测非洲猪瘟病毒的方法的检测阈值验证结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，该试剂盒以asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒作为阳性对照，以β-actin作为内参对照基因。该试剂盒以β-actin基因作为内参质控，既监控了样品核酸的提取过程又监控了基因扩增反应过程，增大了检测结果的准确性，减少了假阴性结果。

具体地，一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒包括：含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒，vp73的上游引物，vp73的下游引物，β-actin的上游引物，β-actin的下游引物，在一些优选的方式中，该试剂盒还包括vp73的探针，β-actin的探针。

本实施例中，含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒为冻干的质粒干粉，在使用时，通过加入rnasefreewater溶解能够得到质粒溶液。

该试剂盒直接为实验者提供了vp73和β-actin的上、下游引物，免去了实验者自行设计引物的繁琐步骤。

所述vp73的上游引物为：

5’-cggatatgactgggacaacca-3’(seqidno.：1)，

vp73的下游引物为：

5’-agggatctacaagcgtgtaaacg-3’(seqidno.：2)，

vp73的探针为：

5’-fam-acacctttagagggcg-tamra-3’(seqidno.：3)，

β-actin的上游引物为：

5’-ccagttcgccatggatgac-3’(seqidno.：4)，

β-actin的下游引物为：

5’-atgccggagccgttgtc-3’(seqidno.：5)，

β-actin的探针为：

5’-cy5-tattgctgcgctcgtg-bhq2-3’(seqidno.：6)；

其中，vp73探针和β-actin的探针中的fam、cy5为荧光基团，tamra和bhq2为淬灭基团。

该试剂盒的具体使用方法如下：以含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒溶液作为阳性对照标准品，以β-actin作为内参对照基因；β-actin基因在待测样本中，通过核酸提取获得。

(1)取待测样本10μl，使用市售常规核酸提取试剂盒，提取待测样本的核酸；

(2)向试剂盒提供的含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒干粉中加入rnasefreewater溶解，得到质粒溶液，最初质粒溶液的浓度为10⁶copies/ml，按1:10的比例梯度稀释成浓度为10²-10⁶copies/ml，即得到浓度为10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml的质粒溶液；

使用市售常规定量pcr试剂盒，分别以步骤(1)中提取的核酸和上述的质粒溶液中的质粒为模板，以试剂盒内提供的vp73上、下游引物，β-actin上、下游引物为引物，进行定量pcr反应。其中，定量pcr反应中，实验者可加入本试剂盒提供的vp73探针、β-actin探针通过探针法进行定量pcr反应；也可通过染料法进行定量pcr反应。

定量pcr反应条件如下：

(4)反应结束后，得到定量pcr的扩增曲线和溶解曲线，对扩增结果进行分析，计算待测样品中asfv核酸浓度，或者直接判断待测样品中有无asfv。具体地，通过上述反应得到10²-10⁶copies/ml不同浓度质粒溶液扩增的ct值结果，以ct值为横坐标，质粒浓度为纵坐标，生成散点图，并拟合得出该散点图的线性回归方程，在该方程中代入待测样本的ct值，可算出待测样本中asfv核酸浓度(copies/ml)。

实施例2

本发明提供了检测非洲猪瘟病毒的方法，采用以上所述的试剂盒，以含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒溶液作为阳性对照标准品，以猪肌动蛋白基因β-actin作为内参对照基因，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的核酸；

(2)以待测样本的核酸和含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒为模板进行基因扩增反应；

(3)对扩增结果进行分析。

该方法中，选取了含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒作为阳性对照，以猪肌动蛋白基因β-actin作为内参对照基因。从检测的最初阶段进行监控，能够监测整个病毒检测过程，完美的体现了内参对照基因的作用，增加了检测结果的准确性。

当β-actin的检测结果为阴性时，表明该检测结果为假阴性，待测样品的检测结果不可信，需要进一步验证，因此本方法能够对实验结果起到指示作用。

在一些优选的方式中，阳性对照标准品中质粒的浓度为0-10⁶copies/μl，此浓度能够满足检测的需求，实现本发明要达到的功能。

在一些优选的方式中，所述基因扩增反应为荧光定量pcr反应。

在一些优选的方式中，荧光定量pcr反应的反应体系中，vp73的上游引物，vp73的下游引物，β-actin的上游引物，β-actin的下游引物；vp73的探针，β-actin的探针的最佳使用浓度均为0.2-1μm，引物浓度过高或者过低均会对检测结果产生影响。

在一些优选的方式中，定量pcr反应的反应步骤为：

现结合具体实施例对该方法进行详细的介绍。

(2.1)一种非洲猪瘟病毒(asfv)检测方法

以快速检测待测样品中非洲猪瘟病毒asfv为例，对本发明提供的病毒检测方法进行详细介绍。

(一)仪器试剂

主要仪器：荧光定量pcr仪

主要试剂：核酸提取试剂盒、定量pcr试剂盒、含vp73片段的质粒

(二)引物设计

当检测非洲猪瘟病毒(asfv)时，根据asfv结构蛋白基因vp73的序列和猪肌动蛋白基因β-actin的序列，设计vp73和β-actin的上、下游引物以及vp73和β-actin的探针如下，

vp73的上游引物为：

5’-cggatatgactgggacaacca-3’(seqidno.：1)，

vp73的下游引物为：

5’-agggatctacaagcgtgtaaacg-3’(seqidno.：2)，

vp73的探针为：

5’-fam-acacctttagagggcg-tamra-3’(seqidno.：3)，

β-actin的上游引物为：

5’-ccagttcgccatggatgac-3’(seqidno.：4)，

β-actin的下游引物为：

5’-atgccggagccgttgtc-3’(seqidno.：5)，

β-actin的探针为：

5’-cy5-tattgctgcgctcgtg-bhq2-3’(seqidno.：6)。

其中asfv和β-actin的探针引物中的fam、cy5为荧光基团，tamra和bhq2为淬灭基团。

(三)实验

(1)向离心管中加入10μl待测样本，使用市售常规的核酸提取试剂盒，按照其说明书操作步骤，提取待测样本的核酸。

(2)向试剂盒提供的含有asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒干粉中加入rnasefreewater溶解，得到质粒溶液，最初质粒溶液的浓度为10⁶copies/ml，按1:10的比例梯度稀释成浓度为10²-10⁶copies/ml，即得到浓度为10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml的质粒溶液；

分别以待测样本的核酸和含asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒为模板，以试剂盒内提供的vp73上、下游引物，β-actin上、下游引物为引物，进行定量pcr反应；其中，定量pcr反应中，实验者可加入本试剂盒提供的vp73探针、β-actin探针通过探针法进行定量pcr反应；定量pcr反应所用试剂来自定量pcr试剂盒(本实施例中，采用市售的普通定量pcr试剂盒)，具体地，定量pcr反应的反应体系如下：

1xpcrbuffer,5mm的mgcl2,1.6μm的dntps,0.2μm的vp73的上游引物,0.2μm的vp73的下游引物,0.2μm的β-actin的上游引物,0.2μm的β-actin的下游引物，0.8μm的vp73探针，0.8μm的β-actin的探针2.5utaqdna聚合酶，10μl的模板dna。

将定量pcr反应体系中的反应液置于荧光定量pcr仪中进行定量pcr反应，定量pcr反应的反应条件如下：

(3)反应结束后，对反应结果进行分析，荧光定量pcr仪自动分析生成vp73、含vp73片段的质粒和β-actin的溶解曲线和扩增曲线；当需要知道待测样本所含病毒的具体浓度时，由于含asfv结构蛋白基因vp73片段的质粒浓度已知，由此可计算出待测样本中vp73基因的具体浓度，从而得到猪瘟病毒的浓度；具体地，通过上述反应得到10²-10⁶copies/ml不同浓度质粒溶液扩增的ct值结果，以ct值为横坐标，质粒浓度为纵坐标，生成散点图，并拟合得出该散点图的线性回归方程，在该方程中代入待测样本的ct值，即可算出待测样本中vp73基因的具体浓度，从而能够得到猪瘟病毒的浓度(copies/ml)。

当仅需确定样品中有无猪瘟病毒存在时，则只需判断能否得到vp73的扩增ct值，即可确定样本中是否有猪瘟病毒的存在，若β-actin的检测结果为阴性，则表示操作过程或者所用试剂等有可能影响检测结果的因素有误，该检测结果不可信，β-actin起到内参质控的作用；而且β-actin作为非竞争性内参质控，不会抑制vp73的复制。

(2.2)所建立的病毒检测方法稳定性验证

为了验证选用猪肌动蛋白基因β-actin作为内参对照基因的实验结果稳定性和重复性，以检测待测样本中非洲猪瘟病毒asfv为例，进行验证实验如下：

(1)收集100份样本，随机分成5组；此处的样本为猪的血液或血浆或组织液。

(2)使用市售核酸提取试剂盒，按照其说明书操作步骤，提取每组样本的核酸，进行定量pcr反应，定量pcr反应的反应体系如下：

1xpcrbuffer,5mm的mgcl2,1.6μm的dntps,0.2μm的vp73的上游引物,0.2μm的vp73的下游引物,0.2μm的β-actin的上游引物,0.2μm的β-actin的下游引物，0.8μm的vp73探针引物，0.8μm的β-actin的探针引物，2.5utaqdna聚合酶，10μl的模板dna。

将定量pcr反应体系的反应液置于荧光定量pcr仪中进行定量pcr反应，定量pcr反应的反应条件如下：

荧光定量pcr仪自动分析生成各组针对β-actin的溶解曲线和扩增曲线，对反应结果进行分析，将各组中针对β-actin的ct值作图，结果如图1所示，图1中横坐标表示1-5五个组，纵坐标表示β-actin的ct值，柱状图中的n表示每组中样本的个数；以第一组为例，由图1可以看出，第一组中样本的个数为20个，该组检测结果中β-actin的ct值的平均值为33.48。

由图1可知，各组中β-actin的ct平均值维持在33.4-33.8之间，表明实验结果稳定性和重复性良好。

(2.3)所建立的病毒检测方法的检测阈值验证

为了验证应用该病毒检测方法检测asfv时的灵敏性，制作了含有已知核酸浓度的asfv结构蛋白基因vp73基因片段的质粒溶液作为待测样本，待测样本标号以vp73p表示，例如样本vp73p100,000表示该样本中asfv的核酸浓度为100,000copies/ml；样本vp73p10,000表示该样本中asfv的核酸浓度为10,000copies/ml，以此类推。

针对每个待测样本均进行如下操作：

(1)向离心管中加入10μl以上所述的待测样本和一定浓度的含β-actin的质粒，得到混合样本，混合样本中β-actin质粒的浓度为10³copies/ml，使用市售的核酸提取试剂盒，按照其说明书操作步骤，提取混合样本的核酸。

(2)以混合样本的核酸为模板，进行定量pcr反应，定量pcr反应的反应体系如下：

1xpcrbuffer,5mm的mgcl2,1.6μm的dntps,0.2μm的vp73的上游引物,0.2μm的vp73的下游引物,0.2μm的β-actin的上游引物,0.2μm的β-actin的下游引物，0.8μm的vp73探针引物，0.8μm的β-actin的探针引物，2.5utaqdna聚合酶，10μl的模板dna。

将定量pcr反应体系中的反应液置于荧光定量pcr仪中进行定量pcr反应，定量pcr反应的反应条件如下：

得到asfv相应的溶解曲线和扩增曲线，对反应结果进行分析，将待测样本中已知核酸浓度与扩增ct值做图，结果如图2所示，图2中横坐标表示待测样本中已知核酸浓度，纵坐标表示扩增ct值，以vp73p100000为例，图2结果表示：当待测样本中asfv核酸浓度为100000copies/ml时，有扩增ct值，约为29。

由图2可知，当待测样本中asfv核酸的浓度低于100copies/ml时，即有可能无法检测到样本中的核酸，即表示该方法中对待测样本中asfv的可重复检测阈值为100copies/ml，具有较高的灵敏度；且β-actin的ct值稳定在34左右，表明该方法具有较高的稳定性，结果可信度较高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。