一种NMN治疗与改善CMVA的相关性的体外实验法的制作方法

本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法。

背景技术：

伴随着当今社会的发展，结合科学技术的进行，人们时刻在进行着人类血管抗衰老的研究，在人类血管抗衰老的研究过程中，nmn治疗与改善cmva的相关性的问题一直是人们所研究的，在针对nmn治疗与改善cmva的相关性进行研究的过程中，现有技术没有相关的体外实验法。为此，我们提出了一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法，包括如下步骤：

s1：创建两组huvecs模型，分为nmn干预组和对照组，nmn干预组给予nmn进行孵育，且一天更换一次，对照组则对huvecs模型进行常规培养；

s2：对步骤s1中的nmn干预组和对照组均进行划痕实验、transwell实验和成管实验，在所述划痕实验中，观察nmn干预组和对照组的细胞增殖的时间和速度，在transwell实验中，观察nmn干预组和对照组的中迁移的huvecs数量即细胞迁移现象，在成管实验中，检测nmn干预组和对照组中huvecs形成微管网密度及分支点个数即成管密度；

s3：取小鼠胸主动脉环，以0.5mm厚度接种于无血清培养皿，板底含1mg/ml胶原基质，每个主动脉环接种于96孔板中,并在含fbs的培养基中补充vegf刺激血管发芽，培养主动脉环分nmn干预组和对照组，共孵育7天后观察；

s4：对步骤s3中的nmn干预组和对照组均进行主动脉环实验，在主动脉环实验中，观察微血管芽生长度、数量和面积即细胞的成管密度；

s5：建立高龄小鼠模型，并分为nmn治疗组和常规喂养对照组；nmn治疗组为通过饮用水给予nmn喂食高龄小鼠，持续1个月后，针对nmn治疗组和常规喂养对照组的高龄小鼠，利用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术，检测每个高倍视野下的微管数目和微管/肌纤维比，并通过nt-probnp、心脏彩超检测nmn治疗组和常规喂养对照组的高龄小鼠的心功能；

s6：基于步骤s2、s3和s5的实验、检测及观察数据，进一步的利用rt-qpcr和wb，检测细胞和心肌组织的cited2蛋白和基因表达，进而获取cited2表达与cmva的相关性。

优选的，在步骤s1中，所述nmn的浓度为0.5mm。

优选的，在步骤s2中，所述成管实验过程中铺基质胶、细胞密度为40000/孔，并分别在实验的12h、24、48h和72h观察微血管形成情况。

优选的，在步骤s3中，所述培养基中的fbs的含量为2.5％，所述vegf的浓度为30ng/ml。

优选的，在步骤s4中，所述主动脉环实验的观察过程为用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜成像拍照观察。

优选的，所述高龄小鼠为大于20月龄的老鼠，所述高龄小鼠所食用的nmn量为400mg/kg/d。

本发明提出的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法，有益效果在于：本方案在进行的过程中，利用huvecs模型和小鼠胸主动脉环，分为nmn干预组和常规对照组，利用划痕实验、transwell实验、成管实验，观察huvecs增殖、迁移、成管情况，通过主动脉环实验观察微血管芽生长度、交叉点数和面积的情况,然后检测cited2基因和蛋白表达水平；进一步的给予高龄小鼠喂养nmn后，利用nt-probnp、心脏彩超、免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察小鼠心脏功能和心肌切片中微血管密度等变化，然后检测cited2基因和蛋白表达水平，在针对cited2基因和蛋白表达完成后，即能够获得nmn治疗与改善cmva的相关性，因此本方案实现了nmn治疗与改善cmva的相关性的实验，在试验后能获得nmn治疗与改善cmva的相关性，且整个实验过程程序简单，便于进行操作，进而有利于进行推广运用。

附图说明

图1为本发明提出的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法的流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1，一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法，包括如下步骤：

s1：创建两组huvecs模型，分为nmn干预组和对照组，nmn干预组给予nmn进行孵育，且一天更换一次，对照组则对huvecs模型进行常规培养；

s2：对步骤s1中的nmn干预组和对照组均进行划痕实验、transwell实验和成管实验，在所述划痕实验中，观察nmn干预组和对照组的细胞增殖的时间和速度，在transwell实验中，观察nmn干预组和对照组的中迁移的huvecs数量即细胞迁移现象，在成管实验中，检测nmn干预组和对照组中huvecs形成微管网密度及分支点个数即成管密度；

s3：取小鼠胸主动脉环，以0.5mm厚度接种于无血清培养皿，板底含1mg/ml胶原基质，每个主动脉环接种于96孔板中,并在含fbs的培养基中补充vegf刺激血管发芽，培养主动脉环分nmn干预组和对照组，共孵育7天后观察；

s4：对步骤s3中的nmn干预组和对照组均进行主动脉环实验，在主动脉环实验中，观察微血管芽生长度、数量和面积即细胞的成管密度；

s5：建立高龄小鼠模型，并分为nmn治疗组和常规喂养对照组；nmn治疗组为通过饮用水给予nmn喂食高龄小鼠，持续1个月后，针对nmn治疗组和常规喂养对照组的高龄小鼠，利用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术，检测每个高倍视野下的微管数目和微管/肌纤维比，并通过nt-probnp、心脏彩超检测nmn治疗组和常规喂养对照组的高龄小鼠的心功能；

s6：基于步骤s2、s3和s5的实验、检测及观察数据，进一步的利用rt-qpcr和wb，检测细胞和心肌组织的cited2蛋白和基因表达，进而获取cited2表达与cmva的相关性。

在步骤s1中，所述nmn的浓度为0.5mm。

在步骤s2中，所述成管实验过程中铺基质胶、细胞密度为40000/孔，并分别在实验的12h、24、48h和72h观察微血管形成情况。

在步骤s3中，所述培养基中的fbs的含量为2.5％，所述vegf的浓度为30ng/ml。

在步骤s4中，所述主动脉环实验的观察过程为用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜成像拍照观察。

所述高龄小鼠为大于20月龄的老鼠，所述高龄小鼠所食用的nmn量为400mg/kg/d。

综上所述：本发明在进行的过程中，利用huvecs模型和小鼠胸主动脉环，分为nmn干预组和常规对照组，利用划痕实验、transwell实验、成管实验，观察huvecs增殖、迁移、成管情况，通过主动脉环实验观察微血管芽生长度、交叉点数和面积的情况,然后检测cited2基因和蛋白表达水平；进一步的给予高龄小鼠喂养nmn后，利用nt-probnp、心脏彩超、免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察小鼠心脏功能和心肌切片中微血管密度等变化，然后检测cited2基因和蛋白表达水平，在针对cited2基因和蛋白表达完成后，即能够获得nmn治疗与改善cmva的相关性，因此本发明实现了nmn治疗与改善cmva的相关性的实验，在试验后能获得nmn治疗与改善cmva的相关性，且整个实验过程程序简单，便于进行操作，进而有利于进行推广运用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。