一种NMN治疗与改善CMVA的相关性的体外实验法的制作方法

文档序号:19813968发布日期:2020-01-31 18:49阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法,其特征在于,包括如下步骤:

s1:创建两组huvecs模型,分为nmn干预组和对照组,nmn干预组给予nmn进行孵育,且一天更换一次,对照组则对huvecs模型进行常规培养;

s2:对步骤s1中的nmn干预组和对照组均进行划痕实验、transwell实验和成管实验,在所述划痕实验中,观察nmn干预组和对照组的细胞增殖的时间和速度,在transwell实验中,观察nmn干预组和对照组的中迁移的huvecs数量即细胞迁移现象,在成管实验中,检测nmn干预组和对照组中huvecs形成微管网密度及分支点个数即成管密度;

s3:取小鼠胸主动脉环,以0.5mm厚度接种于无血清培养皿,板底含1mg/ml胶原基质,每个主动脉环接种于96孔板中,并在含fbs的培养基中补充vegf刺激血管发芽,培养主动脉环分nmn干预组和对照组,共孵育7天后观察;

s4:对步骤s3中的nmn干预组和对照组均进行主动脉环实验,在主动脉环实验中,观察微血管芽生长度、数量和面积即细胞的成管密度;

s5:建立高龄小鼠模型,并分为nmn治疗组和常规喂养对照组;nmn治疗组为通过饮用水给予nmn喂食高龄小鼠,持续1个月后,针对nmn治疗组和常规喂养对照组的高龄小鼠,利用免疫荧光和激光共聚焦显微镜技术,检测每个高倍视野下的微管数目和微管/肌纤维比,并通过nt-probnp、心脏彩超检测nmn治疗组和常规喂养对照组的高龄小鼠的心功能;

s6:基于步骤s2、s3和s5的实验、检测及观察数据,进一步的利用rt-qpcr和wb,检测细胞和心肌组织的cited2蛋白和基因表达,进而获取cited2表达与cmva的相关性。

2.根据权利要求1所述的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法,其特征在于,在步骤s1中,所述nmn的浓度为0.5mm。

3.根据权利要求1所述的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法,其特征在于,在步骤s2中,所述成管实验过程中铺基质胶、细胞密度为40000/孔,并分别在实验的12h、24、48h和72h观察微血管形成情况。

4.根据权利要求1所述的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法,其特征在于,在步骤s3中,所述培养基中的fbs的含量为2.5%,所述vegf的浓度为30ng/ml。

5.根据权利要求1所述的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法,其特征在于,在步骤s4中,所述主动脉环实验的观察过程为用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜成像拍照观察。

6.根据权利要求1所述的一种nmn治疗与改善cmva的相关性的体外实验法,其特征在于,所述高龄小鼠为大于20月龄的老鼠,所述高龄小鼠所食用的nmn量为400mg/kg/d。

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