一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法与流程

文档序号：20004196发布日期：2020-02-22 03:27阅读：181来源：国知局

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法。

背景技术：

法尼基转移酶是他汀类药物生产的重要催化剂，获取法尼基转移酶基因家族成员能为法尼基转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。目前，克隆法尼基转移酶基因家族成员的方法是首先在基因库中确定法尼基转移酶基因序列，然后根据法尼基转移酶基因序列设计引物克隆已知菌种的法尼基转移酶基因；这种方法获取的法尼基转移酶基因十分有限，仅局限于基因库中已公开的法尼基转移酶基因，不能获取未公开在基因库中法尼基转移酶基因，这种方法不能全面获取法尼基转移酶基因家族成员。

技术实现要素：

为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法，能够获取大量的法尼基转移酶基因家族成员，为法尼基转移酶基因研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。

为实现上述目的，本发明所设计的克隆法尼基转移酶基因家族成员的方法，包括步骤：

(1)选取细菌一；

(2)利用pcr技术扩增细菌一的部分法尼基转移酶基因，pcr扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如seqidno.1所示，下游引物如seqidno.2所示，模板为细菌一的基因组dna；

(3)将扩增得到的部分法尼基转移酶基因做blast比对，获得亲缘关系最近的菌种并获得亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶的基因序列；

(4)根据步骤(3)亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶基因序列设计第二简并引物，利用pcr技术扩增细菌一的完整法尼基转移酶基因，该步骤的pcr扩增技术中引物为第二简并引物，模板为细菌一的基因组dna；

(5)再选取细菌二，按照上述步骤(2)至步骤(4)的方法获取细菌二的完整法尼基转移酶基因，按照该方法依次得到多个细菌的完整法尼基转移酶基因，建构法尼基转移酶基因家族成员群。

作为优选方案，所述步骤2)和步骤4)中pcr扩增体系为10×pcr反应缓冲液5μl、25mmol/lmgso42μl、10mmoldntp5μl、10nmol/l引物各1μl、模板80ng、kod-plusdna聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。

本发明的优点在于：本发明利用第一简并引物克隆出细菌一法尼基转移酶基因的部分碱基序列，将扩增得到的部分法尼基转移酶基因做blast比对获得亲缘关系最近的菌种并确定亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶基因的序列，根据该法尼基转移酶基因的序列设计第二简并引物，利用第二简并引物和基因组dna，扩增得到细菌一的完整法尼基转移酶基因基因。采用这种方法能得到大量的完整法尼基转移酶基因序列，相比于基因库中的法尼基转移酶基因，本发明能得到基因库中未公开的法尼基转移酶基因，显著增加了法尼基转移酶基因的种类，为法尼基转移酶研究和他汀类药物生产提供丰富的候选基因资源。

附图说明

图1为cryobacteriumsp.gcj06细菌的完整法尼基转移酶基因的核酸电泳图；

图2为重组表达质粒pet21a-ftr构建示意图；

图3为4个菌种的法尼基转移酶基因碱基序列比对图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。

克隆法尼基转移酶基因家族成员的方法，包括步骤：

(1)选取细菌一：细菌cryobacteriumsp.gcj06；

(2)利用pcr技术扩增cryobacteriumsp.gcj06细菌的部分法尼基转移酶基因，pcr扩增技术中引物采用第一简并引物，第一简并引物的上游引物如seqidno.1所示，下游引物如seqidno.2所示，模板为细菌一的基因组dna；

2.1)第一简并引物碱基序列的设计过程：

利用ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库，以“farnesyltransferase”为检索词，进行“nucleotide”及“protein”检索，获得多条多条法尼基转移酶基因蛋白序列及编码基因序列，分别下载蛋白氨基酸序列，并进入identicalproteins引导界面中cdsregioninnucleotide下载相对应核酸序列，为了避免赘述，本发明仅罗列cryobacteriumarcticum、cryobacteriumsp.lw097、leifsoniaxyli、rathayibacterfestucaedsm15932，4个菌种的法尼基转移酶基因碱基序列，需要说明的是，本发明实际进行了10个以上的菌种的法尼基转移酶碱基序列对比，以确保得到的保存序列的准确性。

cryobacteriumarcticum的法尼基转移酶基因碱基序列如seqidno.3所示，cryobacteriumsp.lw097的法尼基转移酶基因碱基序列如seqidno.4所示，leifsoniaxyli的法尼基转移酶基因碱基序列如seqidno.5所示，rathayibacterfestucaedsm15932的法尼基转移酶基因碱基序列如seqidno.6所示；将上述4条法尼基转移酶基因碱基序列进行比对，如图3所示，图3中框线中为4条法尼基转移酶基因碱基序列的高度保守序列。

根据高度保守序列设计得到第一简并引物，第一简并引物的上游引物：cgggatcccagcagcgarcasgcsac；下游引物：ggaattccgyccsctsgtsaccggs。引物碱基序列中“s”＝c/g、“r”＝a/g、“y”＝c/t。

2.2)提取细菌的基因组dna作为模板：

细菌的基因组dna按照常规细菌基因组dna操作进行，提取细菌的基因组dna属于分子生物领域的常规技术手段，在此不再赘述。

2.3)pcr扩增

pcr扩增体系为10×pcr反应缓冲液5μl、25mmol/lmgso42μl、10mmoldntp5μl、10nmol/l第一简并引物(上游引物和下游引物)各1μl、模板80ng、kod-plusdna聚合酶1μl、双蒸去离子水定容至50μl；反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。将如图1所示的pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，克隆测序，测序由abi3100测序仪完成。测序后获得部分法尼基转移酶基因序列如seqidno.7所示。

(3)获得与cryobacteriumsp.gcj06细菌亲缘关系最近菌种的完整阿尔多酮还原酶基因序列：

将扩增得到的部分法尼基转移酶基因做blast比对获得亲缘关系最近的菌种并确定与cryobacteriumsp.gcj06细菌亲缘关系最近菌种的完整法尼基转移酶基因的序列。

具体为，将seqidno.7的序列进行blast比对，通过比对后获得亲缘关系细菌cryobacteriumarcticum，cryobacteriumarcticum的完整法尼基转移酶基因序列如seqidno.8所示。

(4)克隆cryobacteriumsp.gcj06细菌的完整阿尔多酮还原酶基因序列。

(4.1)根据步骤(3)cryobacteriumarcticum的完整阿尔多酮还原酶基因序列(seqidno.8)设计第二简并引物，利用pcr技术扩增未知细菌的完整阿尔多酮还原酶基因，该步骤的pcr扩增技术中引物为第二简并引物，模板为cryobacteriumsp.gcj06的基因组dna。

第二简并引物的序列(seqidno.9和seqidno.10)：上游引物：atggataccgccgaacagac，下游引物：tagaagggcagcagcggg。

(4.2)pcr扩增

采用聚合酶链式方应(pcr)扩增得到cryobacteriumsp.gcj06的完整法尼基转移酶基因(如seqidno.11)，结合图2所示，完整法尼基转移酶基因的琼脂糖凝胶电泳，如图3所示，并将其克隆入商业化质粒pet21a(+)中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>湖北工业大学

<120>一种克隆法尼基转移酶基因家族成员群的方法

<160>11

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