产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法。

背景技术：

羊毛甾醇别名异胆固醇，分子式为c30h50o。溶于乙醇、乙醚和氯仿；而在甲醇、丙酮中结晶。羊毛甾醇为无色粉末，具有很多重要的生物活性和广泛的药理作用，如降血压、降血糖、抗癌、治疗白内障等。而且羊毛甾醇还是多种重要的甾醇类物质生物合成的中间体，是化工、医药、食品行业的重要原料。

合成生物学的发展为利用快速生长的微生物来异源表达生物合成基因，提供了一种潜在的生产途径。采用大肠杆菌表达系统具有很多优势，如：遗传操作简单、生长速度快，能在廉价培养基中高密度培养等。具报道(图1)，法尼基焦磷酸(fpp)通过鲨烯合成酶(squalenesynthase，ss)催化合成鲨烯(squalene)；而鲨烯通过鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase,se)在nadph-细胞色素p450还原酶(nadph-cytochromep450reductase,cpr)的辅助作用下可以转化为2,3环氧角鲨烯(2,3-oxidosqualene)；而2,3环氧角鲨烯在羊毛甾醇合成酶(lanosterolsynthase,ls)的进一步催化作用下可以转化为羊毛甾醇。通过将这些合成所需的异源基因在大肠杆菌细胞中表达，就可以利用大肠杆菌胞内已有的法尼基焦磷酸为底物，合成羊毛甾醇。目前，还没有利用大肠杆菌进行羊毛甾醇生物合成的报道。而构建这样一个合成系统，一方面可以直接利用大肠杆菌细胞合成羊毛甾醇，为羊毛甾醇的合成提供一个新的途径；另一方面又可以以该系统为平台细胞，进行以羊毛甾醇为中间体的相关代谢路径的开发和研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：

s1：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，优化后的序列如seqidno.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以优化合成的载体为模板，pcr扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；

s2：以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，pcr扩增获得nadph-细胞色素p450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；

s3：通过融合pcr的方法将鲨烯环氧酶、nadph-细胞色素p450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成为dna片段se-cpr-ls，并将所述se-cpr-ls片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c-se-cpr-ls；

s4：通过pcr扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来，并将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pacycduet-1上，构建表达载体pacycduet-ss；

s5：将所述载体pet21c-se-cpr-ls和pacycduet-ss通过化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞，得产羊毛甾醇大肠杆菌菌株。

进一步的，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。

本发明还提供了一种含鲨烯环氧酶、nadph-细胞色素p450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段的表达载体，其序列如seqidno.13所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。

本发明还提供了一种含上述鲨烯合成酶基因片段的表达载体，其序列如seqidno.14所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。

本发明还提供了含上述两种表达载体的工程菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明的方法通过外源质粒导入方法改造大肠杆菌bl21(de3)系统，使其能够合成羊毛甾醇，并通过密码子优化技术提高了外源基因在大肠杆菌系统中的表达量。

附图说明

图1为现有的羊毛甾醇合成路径；

图2本发明实施例制备的羊毛甾醇表达载体的载体图谱，其中a为pet21c-se-cpr-ls载体图谱，b为pacycduet-ss载体图谱；

图3为羊毛甾醇标准品与本发明实施例的菌体样本吸收光谱的对比图，其中，a为羊毛甾醇标准品的吸收光谱，b为菌体样本的吸收光谱。

具体实施方式：

本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。大肠杆菌(escherichiacoli)xl10gold作为dna操作时使用的宿主菌，包含100g/ml氨苄青霉素的luria-bertani(lb)培养基用作培养e.coli。大肠杆菌bl21(de3)用于表达构建的路径基因，包含0.01mmol/l异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，100g/ml氨苄青霉素和170g/ml氯霉素的lb液体培养基作为诱导表达培养基。引物及基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1：羊毛甾醇合成路径基因的合成及克隆

1.鲨烯环氧酶的基因序列的密码子优化、合成和扩增。

根据大肠杆菌bl21(de3)密码子，使用在线软件dnaworks进行荚膜甲氧球菌(methylococcuscapsulatus)的鲨烯环氧酶的密码子优化。优化后的序列(seqidno.1)送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以优化合成的载体为模板，采用primstardna聚合酶(takaraco,japan)pcr扩增获得鲨烯环氧酶基因片段。pcr产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。

鲨烯环氧酶基因pcr扩增体系：

pcr程序

公司合成的克隆有密码子优化的鲨烯环氧酶基因序列的载体名称为：pmal-mcse。

2.nadph-细胞色素p450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶的克隆。

1)酿酒酵母基因组的制备

使用tianampyeastdnakit酵母基因组dna提取试剂盒(离心柱型)(天根生化科技(北京)有限公司)，根据试剂盒使用说明书进行酿酒酵母w303基因组的提取。

2)以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，采用primstardna聚合酶(takaraco,japan)pcr扩增获得nadph-细胞色素p450还原酶(seqidno.4)、鲨烯合成酶(seqidno.5)和羊毛甾醇合成酶(seqidno.6)基因全长片段。pcr产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。

①nadph-细胞色素p450还原酶基因pcr扩增体系：

pcr程序

②鲨烯合成酶基因pcr扩增体系：

pcr程序

③羊毛甾醇合成酶基因pcr扩增体系：

pcr程序

3)扩增基因片段的ta克隆及测序

①基因片段末端加a

使用taqdna聚合酶(上海生工)，对上述扩增的基因片段进行末端加a。

加a体系：

加a程序：

72℃，1小时。

②ta克隆及测序确认

以上述步骤获得的末端加a的基因片段，使用pgem-teasy载体系统(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)根据产品使用说明书进行基因克隆；克隆获得的目标载体送上海生工测序公司进行测序确认。测序结果使用bioedit序列分析软件进行比对分析。构建的nadph-细胞色素p450还原酶克隆载体命名为“pgem-cpr”、鲨烯合成酶克隆载体命名为“pgem-ss”和羊毛甾醇合成酶克隆载体命名为“pgem-ls”

实施例2：羊毛甾醇表达载体的构建

该实施例中，首先，通过融合pcr的方法将鲨烯环氧酶、nadph-细胞色素p450还原酶和羊毛甾醇合成酶片段融合成为dna片段“se-cpr-ls”。并将该片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体“pet21c-se-cpr-ls”(图2a)，其原全序列如seqidno.13。然后，通过pcr扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来。并将该片段通过同源重组的方法克隆到载体pacycduet-1上，构建表达载体“pacycduet-ss”(图2b)，其全序列如seqidno.14所示。

具体的实施步骤为：

1.“pet21c-se-cpr-ls”表达载体的构建

(1)融合pcr制备dna片段“se-cpr-ls”

融合pcr扩增体系：

pcr程序

(2)pcr产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。

(3)“se-cpr-ls”的酶切

酶切体系：

酶切条件：

步骤1：37℃3小时

步骤2：4℃保持

酶切产物使用axygenpcr产物回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。

(4)pet21c载体的酶切

酶切体系：

酶切条件：

步骤1：37℃3小时

步骤2：4℃保持

酶切产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。

(5)“pet21c-se-cpr-ls”载体的构建

连接体系：

pet21c酶切产物0.3pmol

se-cpr-ls酶切产物0.03pmol

solutioni连接酶(宝生物工程(大连)有限公司)5μl

16℃,16h

2.“pacycduet-ss”表达载体的构建

(1)pcr制备dna片段“ceii-ss”

pcr扩增体系：

pcr程序

(2)pcr产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。

(3)pacycduet-1载体的酶切

酶切体系：

酶切条件：

步骤1：37℃3小时

步骤2：4℃保持

酶切产物使用1％琼脂糖凝胶进行分离，切割目标长度片段，使用axygen凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)进行回收。

(4)“pacycduet-ss”载体的构建。重组反应使用clonexpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司(vazymebiotechco.,ltd))按照产品使用说明书进行。

实施例3、羊毛甾醇大肠杆菌合成菌株的构建及发酵

1.羊毛甾醇大肠杆菌合成菌株的构建

将实施例2中构建的载体“pet21c-se-cpr-ls”和“pacycduet-ss”利用化学转化方法转化进入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中。具体操作如下：

1)取大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞于冰上融化。

2)取pet21c-se-cpr-ls和pacycduet-ss质粒各100ng混匀后，加入感受态细胞中；冰上静置30分钟。

3)将感受态和质粒混合物，42℃，热激90秒。立即放入冰上静止2分钟。

4)向细胞中加入800μllb液体培养基，37℃，200rpm培养1小时。

5)取100μl涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和170μg/ml氯霉素的lb固体培养基上，37℃，过夜培养。平板上所长克隆即为含有羊毛甾醇合成路径质粒的菌株。

实施例4、羊毛甾醇的提取及hplc检测

1.羊毛甾醇提取

称取3.5g湿菌，加入新鲜配置的含有10％koh的甲醇溶液20ml，混匀。于80℃水浴，皂化100分钟。加入20ml石油醚(沸程30～60℃)，回流提取3次，提取液至于分液漏斗中，加入20ml超纯水洗涤。醚层于60℃水浴挥发，得到未皂化脂。将未皂化脂用甲醇定容至5ml。定容后的样本使用0.45um有机微孔滤器过滤。获得的样本可直接用于hplc检测。羊毛甾醇标准品：将羊毛甾醇标准品配制成1mg/ml浓度。

2.hplc检测

色谱柱：液相色谱柱halo多孔壳层色谱柱c184.6×150mm，5um

柱温：35℃

流动相：80％甲醇-20％水，等度洗脱

检测波长：205mm

进样量：20ul

检测结果如图3所示，羊毛甾醇标准品在出峰时间18.97min处有个明显的特征峰，而以构建菌株的细胞裂解液提取的样本中在该处也有一个明显的特征峰，说明所构建的菌株具有羊毛甾醇合成能力。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1347

<212>dna

<213>荚膜甲氧球菌(methylococcuscapsulatus)

<400>1

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<210>2

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgcggatcccttagcacggagtgcttgattc31

<210>4

<211>1977

<212>dna

<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

<400>4

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<211>1260

<212>dna

<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

<400>5

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<210>6

<211>2196

<212>dna

<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)

<400>6

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>13

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<212>dna

<213>载体(pet21c-se-cpr-ls)

<400>13

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