发明领域发明涉及her2靶向性4-1bb激动剂,特别是包含能够特异性结合her2的抗原结合域的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和它们在治疗癌症中的用途。本发明进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。发明背景tnf受体超家族的一个成员,4-1bb(cd137)最初被鉴定为由活化的t细胞表达的可诱导分子(kwonandweissman,1989,procnatlacadsciusa86,1963-1967)。随后的研究证明许多其它免疫细胞也表达4-1bb,包括nk细胞,b细胞,nkt细胞,单核细胞,嗜中性细胞,肥大细胞,树突细胞(dc)和非造血起源的细胞,诸如内皮和平滑肌细胞(vinayandkwon,2011,cellmolimmunol8,281-284)。4-1bb在不同细胞类型中的表达大多通过各种刺激性信号,诸如t细胞受体(tcr)或b细胞受体触发,以及经由共刺激性分子或促炎性细胞因子的受体诱导的信号传导而可诱导和驱动(diehletal.,2002,jimmunol168,3755-3762；zhangetal.,2010,clincancerres13,2758-2767)。4-1bb配体(4-1bbl或cd137l)在1993年鉴定(goodwinetal.,1993,eurjimmunol23,2631-2641)。已经显示4-1bbl的表达局限在专职抗原呈递细胞(apc)上,诸如b细胞,dc和巨噬细胞。4-1bbl的可诱导表达对于包括αβ和γδt细胞子集二者的t细胞,和内皮细胞是特征性的(shaoandschwarz,2011,jleukocbiol89,21-29)。经由4-1bb受体(例如通过4-1bbl接合)的共刺激活化t细胞(cd4+和cd8+子集二者)内的多种信号传导级联,强力提升t细胞活化(bartkowiakandcurran,2015)。与tcr触发组合,激动性4-1bb特异性抗体增强t细胞的增殖,刺激淋巴因子分泌并降低t淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(snelletal.,2011,immunolrev244,197-217)。这种机制作为癌症免疫疗法中的第一个概念证据得到进一步发展。在一种临床前模型中针对4-1bb的激动性抗体在荷瘤小鼠中的施用导致有力的抗肿瘤效果(meleroetal.,1997,natmed3,682-685)。后来,越来越多的证据指示4-1bb通常只在与其它免疫调控性化合物,化疗试剂,肿瘤特异性疫苗接种或放疗组合施用时展现它作为抗肿瘤剂的效力(bartkowiakandcurran,2015,frontoncol5,117)。tnfr超家族的信号传导需要三聚化配体的交联来与受体啮合,因此需要野生型fc结合的4-1bb激动性抗体也如此(liandravetch,2011,science333,1030-1034)。然而,在小鼠中具有功能性活性fc域的4-1bb特异性激动性抗体的系统施用导致与肝毒性相关的cd8+t细胞的流入(dubrotetal.,2010,cancerimmunolimmunother59,1223-1233),这在功能性fc受体缺失下减弱或显著减轻。在临床中,一种fc胜任的4-1bb激动性抗体(bms-663513)(nct00612664)引起4级肝炎,导致试验终止(simeoneandascierto,2012,jimmunotoxicol9,241-247)。因此,需要有效且更加安全的4-1bb激动剂。人表皮生长因子受体-2(her2；erbb2)是一种受体酪氨酸激酶和跨膜受体的表皮生长因子受体(egfr)家族的成员。her2在一系列肿瘤类型中过表达,而且它涉及疾病起始和进展。它与较差的预后有关。例如,在大约30％的人乳腺癌中观察到her2的过表达,而且它涉及与这些肿瘤有关的攻击性生长和较差的临床结局(slamonetal.(1987)science235:177-182)。人源化抗her2单克隆抗体曲妥珠单抗(cas180288-69-1,humab4d5-8,rhumabher2,genentech)靶向her2的胞外域(us5677171；us5821337；us6054297；us6165464；us6339142；us6407213；us6639055；us6719971；us6800738；us7074404；coussensetal.(1985)science230:1132-9；slamonetal.(1989)science244:707-12；slamonetal.(2001)newengljmed344:783-792)。已经显示曲妥珠单抗抑制过表达her2的人肿瘤细胞的增殖且是抗体依赖性细胞性细胞毒性(adcc)的介导物(hudziaketal.(1989)molcellbiol9:1165-72；lewisetal.(1993)cancerimmunolimmunother37:255-63；baselgaetal.(1998)cancerres58:2825-2831；hotalingetal.(1996)[摘要]procannualmeetingamassoccancerres37:471；pegrammdetal.(1997)[摘要]procamassoccancerres38:602；sliwkowskietal.(1999)seminarsinoncology26(4),suppl12:60-70；yardeny.andsliwkowski,m.(2001)naturereviews:molecularcellbiology,macmillanmagazines,ltd.,vol.2:127-137)。(曲妥珠单抗,genentechinc.)在1998年批准用于治疗具有her2过表达性转移性乳腺癌的患者(baselgaetal.(1996)jclinoncol14:737-744)。在2006年,fda批准作为含有多柔比星,环磷酰胺和帕利他赛的治疗方案的一部分,用于具有her2阳性,结阳性乳腺癌的患者的辅助治疗。帕妥珠单抗(也称作重组人源化单克隆抗体2c4,rhumab2c4,genentech,inc.,southsanfrancisco)是另一种靶向her2的抗体治疗。帕妥珠单抗是her二聚化抑制剂(hdi)且发挥抑制her2与其它her受体(诸如egfr/her1,her2,her3和her4)形成活性异二聚体或同二聚体的能力的功能。见例如harariandyarden,oncogene19:6102-14(2000)；yardenandsliwkowski,natrevmolcellbiol2:127-37(2001)；sliwkowski,natstructbiol10:158-9(2003)；choetal.,nature421:756-60(2003)；和maliketal.,proamsoccancerres44:176-7(2003)；us7560111。首先在2012年批准与曲妥珠单抗和多西他赛组合用于治疗具有高级或晚期(转移性)her2阳性乳腺癌的患者。使用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合疗法同时还批准用于her2阳性,局部晚期,炎性,或早期乳腺癌的新辅助(在手术之前)治疗和用于处于复发高风险的her2阳性早期乳腺癌(ebc)的辅助(在手术之后)治疗。相信perjeta和herceptin的作用机制彼此互补,因为二者均结合her2受体但结合不同位置。认为perjeta和herceptin的组合提供对her信号传导途径的更加全面的双重阻断,如此阻止肿瘤细胞生长和存活。针对人erbb2的ii,iii和iv域的双特异性,二价her2抗体公开于wo2012/143523。称作herceptarg的包含抗体rhumab2c4和hu4d5的优化变体的双特异性her-2抗体描述于wo2015/091738。尽管曲妥珠单抗在乳腺癌中的治疗功效得到较好证明,有许多患者因抗性而没有受益于曲妥珠单抗。鉴于在表达低水平的her2的特定癌症中缺乏有效的抗her2疗法,对当前疗法的抗性,和her2相关癌症的流行度,需要新的疗法来治疗此类癌症。本发明的新的抗原结合分子组合抗her2抗原结合域与能够形成共刺激性4-1bb配体三聚体且足够稳定,从而在药学上有用的模块。由针对cd137的结合特异性和针对her2/neu的结合特异性构成的融合蛋白公开于wo2016/177802。这些分子是抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合多肽,意味着具有针对cd137的结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白融合至抗her2抗体。脂质运载蛋白突变蛋白(抗运载蛋白(anticalin))是非抗体支架,而且将此类模态转变成分化药物具有挑战性(vazquez-lombardietal.,2015,drugdiscoverytoday20,1271-1283)。与抗体相比,鉴于不同的血清半衰期,组织渗透性和免疫原性,可能出现挑战。如此,仍然需要基于抗体技术或人样蛋白质的具有改良特性的药物候选。发明概述本发明的新的抗原结合分子组合抗her2抗原结合域与能够形成共刺激性4-1bbl三聚体且足够稳定,从而在药学上有用的模块。令人惊讶地,本发明的抗原结合分子提供三聚体且因此有生物学活性的人4-1bb配体,尽管三聚化4-1bbl外域之一与该分子的其它两个4-1bbl外域位于不同多肽上。通过抗her2抗原结合域的靶向,本发明的包含天然人4-1bb配体的抗原结合分子在肿瘤位点上具有升高的活性且因此应当造成与常规4-1bb激动性抗体或更多人工融合蛋白相比更少的安全性问题。在一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1bbl外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该4-1bbl外域或其片段包含选自由seqidno:1,seqidno:2,seqidno:3,seqidno:4,seqidno:5,seqidno:6,seqidno:7和seqidno:8组成的组的氨基酸序列,特别是seqidno:1或seqidno:5的氨基酸序列。在又一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由seqidno:9,seqidno:10,seqidno:11和seqidno:12组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由seqidno:1,seqidno:5,seqidno:3和seqidno:4组成的组的氨基酸序列,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个方面,该fc域是igg,特别是igg1fc域或igg4fc域。更加特别地,该fc域是igg1fc域。在一个特定方面,该fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。在一个特定方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的节-入-穴修饰。在一个具体方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该fc域的第一亚基包含氨基酸替代s354c和t366w(编号方式依照kabateu索引)且该fc域的第二亚基包含氨基酸替代y349c,t366s,l368a和y407v(编号方式依照kabateu索引)。在另一个方面,本发明涉及如本文中之前定义的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该fc域包含一处或多处降低对fc受体,特别是对fcγ受体的结合的氨基酸替代。特别地,该fc域包含igg重链的位置234和235(依照kabat的eu编号方式)和/或329(依照kabat的eu编号方式)处的氨基酸替代。特别地,提供的是含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该fc域是包含氨基酸替代l234a,l235a和p329g(编号方式依照kabateu索引)的igg1fc域。在一个方面,该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子是如下的,其中其中该能够特异性结合her2的抗原结合域是能够特异性结合her2的fab分子。在另一个方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域是能够特异性结合her2的交换fab分子或scfv分子。在一个方面,本发明提供如本文中之前描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含一个能够特异性结合her2的fab域,意味着它包含针对her2的单价结合。在又一个方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含(a)vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l3,或(c)vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)包含seqidno:19的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:20的氨基酸序列的vl域,或(b)包含seqidno:27的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:28的氨基酸序列的vl域,或(c)包含seqidno:35的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:36的氨基酸序列的vl域。在又一个方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含均包含能够特异性结合her2的fab分子的第一重链和第一轻链,分别地,在它的c端通过第二肽接头融合至第二重或轻链的包含恒定域和通过第一肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段的第二重链,和在它的c端通过第三肽接头融合至第二轻或重链的包含恒定域和一个4-1bbl外域或其片段的第二轻链。更加特别地,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段的第一肽在它的c端通过第二肽接头融合至作为重链一部分的cl域,且该包含一个所述4-1bbl外域或其片段的第二肽在它的c端通过第三肽接头融合至作为轻链一部分的ch1域。在一个特定方面,本发明涉及如上文定义的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该肽接头是(g4s)2,即seqidno:68的肽接头。在一个方面,该肽接头在所有情况中是(g4s)2。进一步提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中在邻近该tnf配体家族成员的cl域中位置123(eu编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(r)替代且位置124(eu编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(k)替代,且其中在邻近该tnf配体家族成员的ch1域中位置147(eu编号方式)处和位置213(eu编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(e)替代。在另一个方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:19的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:20的氨基酸序列的vl域的第一轻链,或包含包含seqidno:27的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:28的氨基酸序列的vl域的第一轻链,或包含包含seqidno:35的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:36的氨基酸序列的vl域的第一轻链,(ii)包含选自由seqidno:37,seqidno:39,seqidno:41和seqidno:43组成的组的氨基酸序列的第二重链,和(iii)包含选自由seqidno:38,seqidno:40,seqidno:42和seqidno:44组成的组的氨基酸序列的第二轻链。在一个特定方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)包含seqidno:45的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:46的氨基酸序列的第一轻链,包含seqidno:37的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:38的氨基酸序列的第二轻链,或(b)包含seqidno:47的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:48的氨基酸序列的第一轻链,包含seqidno:37的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:38的氨基酸序列的第二轻链,或(c)包含seqidno:49的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:50的氨基酸序列的第一轻链,包含seqidno:37的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:38的氨基酸序列的第二轻链。依照本发明的另一个方面,提供有一种分离的核酸分子,其编码如本文中之前限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。本发明进一步提供一种载体,特别是表达载体,其包含本发明的分离的核酸分子,和一种宿主细胞,其包含本发明的分离的核酸或载体。在一些实施方案中,该宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。在另一个方面,提供的是一种用于生成本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的方法,其包含在适合于该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞,和分离该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。本发明进一步提供一种药用组合物,其包含本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。在另一个方面,提供了一种药学组合物,其包含本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂,进一步包含另外的治疗剂,例如化疗剂和/或供癌症免疫疗法中使用的其它药剂。在又一个方面,提供的是一种药学组合物,其进一步包含t细胞活化性抗cd3双特异性抗体,特别是抗her2/抗cd3双特异性抗体。本发明还涵盖的是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或本发明的药用组合物,其供作为药物使用。在一个方面提供的是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或本发明的药用组合物,其供在有所需要的个体中治疗疾病中使用。在一个具体实施方案中,提供的是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或本发明的药用组合物,其供在治疗癌症中使用。在另一个方面,提供的是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或本发明的药用组合物,其供在上调或延长细胞毒性t细胞活性中使用。在另一个方面,提供的是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或本发明的药学组合物,供在治疗癌症中使用,其中该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子与另一种治疗剂,特别是t细胞活化性抗cd3双特异性抗体组合使用。在一个方面,该t细胞活化性抗cd3双特异性抗体与该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子并行,在该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子之前,或在该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子之后施用。还提供的是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子用于制造用于在有所需要的个体中治疗疾病的药物,特别是用于制造用于治疗癌症的药物的用途,以及一种在个体中治疗疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的包含药学可接受形式的如本文中公开的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的组合物。在一个具体方面,该疾病是癌症。进一步提供的是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子用于制造用于治疗癌症的药物的用途,其中该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子与t细胞活化性抗cd3双特异性抗体,特别是抗her2/抗cd3抗体组合使用。而且,提供的是一种用于治疗具有癌症的个体的方法,其包含对该受试者施用有效量的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其药学组合物,和有效量的t细胞活化性抗cd3双特异性抗体,特别是抗her2/抗cd3抗体。还提供的是一种在具有癌症的个体中上调或延长细胞毒性t细胞活性的方法,其包含对该个体施用有效量的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或本发明的药用组合物。在任何上述实施方案中,该个体优选是哺乳动物,特别是人。附图简述图1显示用于组装单价her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子的构件。图1a显示二聚体4-1bb配体在c端融合至具有突变e123r和q124k(带电荷变体)的人igg1-cl域而图1b显示单体4-1bb配体在它的c端融合至具有突变k147e和k213e(带电荷变体)的人igg1-ch1域。图2a示意性图示包含具有带电荷残基的ch-cl交叉的单价her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)融合抗原结合分子的结构。粗黑色点代表节-入-穴修饰。*表示ch1和cl域中的氨基酸修饰(所谓的带电荷变体)。图2b图示小鼠替代物,即具有对小鼠4-1bb的二价结合和对her2的单价结合的双特异性4-1bb抗体(抗-4-1bb/抗her2moigg1ddkkdapg,称作mu4-1bb-her2)。粗黑色点代表dd/kk节-入-穴修饰。dapg突变消除融合蛋白经由小鼠fcγ受体的交联或补体的结合但容许结合fcrn,使得该分子保留它的抗体样药动学。图3a显示用于本发明的her2靶向性含有分拆三聚体4-1bb配体抗原结合分子的同时结合的spr实验的设置。her2(per)-4-1bbl(分析物1)对固定化人4-1bb和人her2(分析物2)的同时结合显示于图3b。her2(affper)-4-1bbl对人4-1bb和人her2的同时结合显示于图3c。图4a至4d显示her2靶向性4-1bb分拆三聚体配体fc融合抗原结合分子对由人乳腺癌细胞系sk-br3(图4a和4c)或人胃癌细胞系nci-n87(图4b和4d)在细胞表面上表达的her2的结合。以x轴所示不同浓度将图例中所示展示her2结合物帕妥珠单抗(per)或亲和力成熟的帕妥珠单抗(aff-per)的her2靶向性分拆4-1bbl抗原结合分子或融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg4(如描述于专利wo2016/177802)或先前描述的激动性抗人4-1bb抗体抗人4-1bb克隆20h4.9huigg4(描述于us7659384b2)或抗人4-1bb克隆mor-7480huigg2(描述于wo2012/032433)或对照分子与her2表达性细胞系sk-br3(图4a和4c)或nci-n87(图4b和4d)一起温育。之后,清洗掉过量的和不结合的分子并用二抗结合性pe缀合的抗人fc片段特异性山羊iggf(ab`)2片段检测结合的分子。中值荧光强度(mfi)是通过流式细胞术测量的并以剂量依赖性方式指示测试分子的亲和力(单价结合物)或亲合力(二价结合物)。通过减去空白对照(例如仅用二抗检测片段染色)对值进行基线修正,以均值+/-sem显示。图5a和5b图示her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子对由人乳腺癌细胞系kpl-4在细胞表面上表达的her2的结合。以x轴所示不同浓度将图例中所示包含her2结合物per,aff-per或曲妥珠单抗(tras)的her2靶向性分拆4-1bbl抗原结合分子,融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg4(如描述于专利wo2016/177802)或先前描述的激动性抗人4-1bb抗体20h4.9huigg4或mor-7480huigg2或对照分子与her2表达性细胞系kl-4一起温育。之后,清洗掉过量的和不结合的分子并用二抗结合性pe缀合的抗人fc片段特异性山羊iggf(ab`)2片段检测结合的分子。中值荧光强度(mfi)是通过流式细胞术测量的并以剂量依赖性方式指示测试分子的亲和力(单价结合物)或亲合力(二价结合物)。通过减去空白对照(例如仅用二抗检测片段染色)对值进行基线修正,以均值+/-sem显示。图6显示一幅示意图,图示使用人4-1bb表达性jurkat报告细胞系的nfκb活化测定法的一般原理。报告细胞上表达的人4-1bb的交联诱导nfκb活化和nfκb介导的萤光素酶表达。在裂解细胞后,萤光素酶能催化萤光素氧化成氧化萤光素。这个化学反应与nfκb介导的萤光素酶表达的强度正相关且可通过发光的强度(光释放单位)来测量。jurkat-hu4-1bb-nfkb-luc2报告细胞系中的nfκb介导的萤光素酶活性显示于图7a至7f。在96孔板中,将jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2报告细胞与用不同浓度(x轴所示)的图例中所示her2(per)-4-1bbl或her2(per)-4-1bbl分子或融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg4或激动性抗人4-1bb抗体20h4.9huigg4或mor-7480huigg2或对照分子一起温育。在her2+细胞缺失下的结果显示于图7a和7d,在人her2+乳腺癌细胞系sk-br3存在下的结果显示于图7b和7e,或在her2+人胃癌细胞系nci-n87存在下的结果显示于图7c和7f。以1:5比报告细胞与her2表达性肿瘤细胞一起温育6小时。之后,将细胞清洗,裂解并与检测缓冲液中的萤光素一起温育。作为光释放单位(y轴)经由发光检测萤光素酶催化的萤光素氧化。显示的是均值+/-sem。通过减去基线发光对所有值进行基线修正。比较her2(per)-4-1bbl与her2(tras)-4-1bbl的第二项实验的结果显示于图8a至8h。在348孔板中,将jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2报告细胞与不同浓度(x轴所示)的图例中所示her2(per)-4-1bbl或her2(tras)-4-1bbl或融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg4或激动性抗人4-1bb抗体20h4.9huigg4或mor-7480huigg2或对照分子一起温育。显示的是当以报告细胞系对肿瘤细胞系1:5比给与达6小时时在人her2+乳腺癌细胞系sk-br3缺失(图8a和8e)或存在(图8b和8f)下,在人乳腺癌细胞系kpl-4(图8c和8g)或her2+人胃癌细胞系nci-n87(图8d和8h)存在下jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2报告细胞系中nfκb介导的萤光素酶表达。将细胞清洗,裂解并与检测缓冲液中萤光素一起温育。作为光释放单位(y轴)经由发光检测萤光素酶催化的萤光素氧化。显示的是均值+/-sem。通过减去基线发光对所有值进行基线修正。图9显示一幅示意图,图示如实施例3.2.2中所述使用人pbmc的活化测定法的一般原理。将t细胞用2nm激动性cd3抗体活化并在her2表达性胃癌nci-n87细胞存在下用不同浓度的激动性4-1bb分子共刺激。内容物/孔包含50gy经过辐照的2x104个nci-n87细胞,7.5x104个cfse标记的人pbmc,2nm激动性抗人cd3人iggwt(克隆v9)和不同浓度的her2靶向性4-1bb激动性分子(这里显示为her2-4-1bbl)。将细胞温育4天,然后通过流式细胞术测定t细胞活化。结果作为cd8+t细胞的活化显示于图10a至10f。将自健康供体的血沉棕黄层分离的静息pbmc用2nm激动性cd3抗体活化并如x轴和图例所示在her2表达性胃癌nci-n87细胞存在下用不同浓度的激动性4-1bb分子共刺激4天。在活cd8+t细胞上对细胞设门并分析它们的cd25+(图10a和10d),粒酶b高(图10b和10e)或增殖性(低cfsemfi)cd8+t细胞(图10c和10f)频率。显示的是均值+/-sd。cd4+t细胞的活化显示于图11a至11f。将自健康供体的血沉棕黄层分离的静息pbmc用2nm激动性cd3抗体活化并在her2表达性胃癌nci-n87细胞存在下用x轴所示不同浓度的激动性4-1bb分子共刺激4天。在活cd4+t细胞上对细胞设门并分析它们的cd25+(图11a和11d),粒酶b高(图11b和11e)或增殖性(低cfsemfi)cd4+t细胞(图11c和11f)频率。显示的是均值+/-sd。图12显示一幅示意图,图示如实施例3.2.3所述使用小鼠脾细胞的活化测定法的一般原理。将t细胞用0.5μg/ml(～3.6nm)激动性抗小鼠cd3亚美尼亚仓鼠igg抗体(克隆1452c11)活化并在her2表达性人乳腺癌细胞系kpl-4存在下用不同浓度的激动性小鼠替代物mu4-1bb-her2共刺激。内容物/孔包含50gy经过辐照的2x104个kpl-4细胞,15x104个紫色增殖染料标记的小鼠脾细胞,0.5μg/ml(～3.6nm)激动性抗小鼠cd3亚美尼亚仓鼠igg抗体(克隆1452c11)和不同浓度的小鼠替代物mu4-1bb-her2或非靶向性对照mu4-1bbmuigg1dapg。将细胞温育3天,然后通过流式细胞术测定t细胞活化。结果作为小鼠cd8+和cd4+t细胞的活化显示于图13a至13d。将自c57bl/6脾分离的静息小鼠脾细胞用0.5μg/ml(～3.6nm)激动性抗小鼠cd3亚美尼亚仓鼠igg抗体(克隆1452c11)活化并如x轴和图例所示在her2表达性人乳腺癌kpl-4细胞存在下用不同浓度的小鼠替代物mu4-1bb-her2或非靶向性对照共刺激3天。在活cd8+或cd4+t细胞上对细胞设门并分析它们的cd25+表达(图13a和13c)或增殖(低紫色增殖染料mfi)(图13b和13d)频率。显示的是每个点技术上一式三份的均值+/-sd。在图14a中显示抗her2/抗cd3双特异性抗体(her2tdb)与her2(per)-4-1bbl的组合的t细胞活化和单一药剂的t细胞活化。单独的her2tdb以及两种药剂的组合诱导强健的t细胞活化。抗her2/抗cd3双特异性抗体(her2tdb)与her2(per)-4-1bbl的组合和单一药剂的靶细胞杀伤显示于图14b。抗her2/抗cd3双特异性抗体(her2tdb)与her2(per)-4-1bbl的组合的t细胞增殖测定法的结果显示于图15a和15b。在体外添加her2-4-1bbl实质性增强抗her2/cd3-tdb诱导的t细胞增殖/存活。图16a至16d显示在植入有人her2表达性fo5肿瘤同种移植物并用媒介(图16a),单独的her2tdb(图14b),单独的mu4-1bb-her2小鼠替代物(图14c)和her2tdb和mu4-1bb-her2的组合(图14d)治疗的免疫胜任小鼠中观察到的肿瘤生长动力学(线性标度)。显示了所有治疗组的每只动物的个体肿瘤生长动力学。cr意味着在研究结束时没有可检测的肿瘤,pr意味着观察到与第0天相比至少50％的肿瘤缩小。7只用mu4-1bb-her2激动剂组合治疗的小鼠中的4只(57％)在研究结束时展现完全响应而没有可检测的肿瘤(cr＝57％)。发明详述定义除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。在抗原较大的情况中,抗原结合分子可仅仅结合抗原的特定部分,该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称作可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。如本文中使用的,术语“能够特异性结合her2的抗原结合域”或“能够特异性结合her2的模块”指特异性结合her2的多肽分子。在一个方面,抗原结合域能够经由her2活化或抑制信号传导。在一个特定方面,抗原结合域能够将其附着的实体(例如4-1bbl三聚体)引导至靶位点,例如携带her2的特定类型的肿瘤细胞。能够特异性结合her2的抗原结合域包括本文中进一步定义的抗体和其片段。关于抗体或其片段,术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”指分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供能够进行特异性抗原结合的模块。特别地,能够进行特异性抗原结合的模块包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。典型地,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。如本申请内使用的术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。照此,术语“单价”,“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中一个结合位点,两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然igg类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自n端至c端,每条重链具有一个可变区(vh),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(ch1,ch2,和ch3),也称作重链恒定区。类似地,自n端至c端,每条轻链具有一个可变区(vl),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(cl),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(iga),δ(igd),ε(ige),γ(igg),或μ(igm),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(igg1),γ2(igg2),γ3(igg3),γ4(igg4),α1(iga1)和α2(iga2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于fv,fab,fab’,fab’-sh,f(ab’)2；双抗体,三抗体,四抗体,交叉fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)。关于scfv片段的综述,参见例如plückthun,inthepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)；还参见wo93/16185；和美国专利no.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的fab和f(ab’)2片段的讨论,参见美国专利no.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如ep404,097；wo1993/01161；hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)；和hollingeretal.,procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；参见例如美国专利no.6,248,516b1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。如此,如本文中使用的,术语“fab片段”指包含包含轻链的vl域和恒定域(cl)的轻链片段,和重链的vh域和第一恒定域(ch1)的抗体片段。fab’片段因在重链ch1域的羧基末端增加少数残基而与fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’-sh是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个fab片段)和fc区的一部分的f(ab’)2片段。术语“交叉fab片段”或“xfab片段”或“交换fab片段”指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的fab片段。交换fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,fab重和轻链的可变区交换,即交换fab分子包含由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链,和由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(vlvh)。另一方面,当fab重和轻链的恒定区交换时,交换fab分子包含由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链,和由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(clch1)。“单链fab片段”或“scfab”是由抗体重链可变域(vh),抗体恒定域1(ch1),抗体轻链可变域(vl),抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以n端至c端方向具有下述次序之一:a)vh-ch1-接头-vl-cl,b)vl-cl-接头-vh-ch1,c)vh-cl-接头-vl-ch1或d)vl-ch1-接头-vh-cl；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链fab片段经由cl域和ch1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链fab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。“交换单链fab片段”或“x-scfab”是由抗体重链可变域(vh),抗体恒定域1(ch1),抗体轻链可变域(vl),抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以n端至c端方向具有下述次序之一:a)vh-cl-接头-vl-ch1和b)vl-ch1-接头-vh-cl；其中vh和vl一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scfab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。“单链可变片段(scfv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(vh)和轻(vl)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将vh的n端与vl的c端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scfv抗体描述于例如houston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有vh域的特征(即能够与vl域一起装配)或vl域的特征(即能够与vh域一起装配)的单链多肽,vh域与vl域一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如gebauerandskerra,engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.curropinchembiol13:245-255(2009)和stumppetal.,darpins:anewgenerationofproteintherapeutics.drugdiscoverytoday13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由ctla-4(evibody),脂质运载蛋白(抗运载蛋白),蛋白a衍生的分子,诸如蛋白a的z域(affibody),a域(avimer/maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(darpin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdab),抗体重链的可变域(纳米抗体,avh),vnar片段,纤连蛋白(adnectin),c型凝集素域(tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(vnar片段),人γ-晶体蛋白或泛素(affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4)是一种主要在cd4+t细胞上表达的cd28家族受体。它的胞外域具有可变域样ig折叠。可以用异源序列替代与抗体cdr对应的环以赋予不同的结合特性。改造成具有不同结合特异性的ctla-4分子也称作evibody(例如us7166697b1)。evibody的尺寸与抗体的分离的可变区(例如域抗体)大致相同。进一步的详情参见journalofimmunologicalmethods248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是一个细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,诸如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有一些环,能改造成结合不同靶抗原。抗运载蛋白的尺寸介于160-180个氨基酸之间,而且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见biochimbiophysacta1482:337-350(2000),us7250297b1和us20070224633。affibody是一种自金黄色葡萄球菌蛋白a衍生的支架,能改造成结合抗原。该域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见proteineng.des.sel.17,455-462(2004)和ep1641818a1。avimer是自a域支架家族衍生的多域蛋白。大约35个氨基酸的天然域采取限定的成二硫键的结构。多样性是通过由a域家族展现的天然变异的改组而产生的。进一步的详情参见naturebiotechnology23(12),1556-1561(2005)和expertopiniononinvestigationaldrugs16(6),909-917(june2007)。转铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。通过在允许的表面环中插入肽序列,转铁蛋白能改造成结合不同靶抗原。经过改造的转铁蛋白支架的例子包括trans-body。进一步的详情参见j.biol.chem274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白附着至细胞骨架的一个蛋白质家族。单个锚蛋白重复是一个33个残基的基序,由两个α-螺旋和一个β-转角组成。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们能改造成结合不同靶抗原。通过增加模块的数目(亲和力成熟的一种方法)能增加它们的结合界面。进一步的详情参见j.mol.biol.332,489-503(2003),pnas100(4),1700-1705(2003)和j.mol.biol.369,1015-1028(2007)和us20040132028a1。单域抗体是由单个单体可变抗体域组成的抗体片段。第一种单域是自来自骆驼科动物(camelids)的抗体重链的可变域衍生的(纳米抗体或vhh片段)。而且,术语单域抗体包括自主的(autonomous)人重链可变域(avh)或自鲨鱼衍生的vnar片段。纤连蛋白是一种能改造成结合抗原的支架。adnectin由人纤连蛋白iii型(fn3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以改造β-夹心一端处的三个环,使得adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶。进一步的详情参见proteineng.des.sel.18,435-444(2005),us20080139791,wo2005056764和us6818418b1。肽适体是由恒定支架蛋白组成的组合识别分子,所述恒定支架蛋白典型地是含有在活性位点处插入的受到约束的可变肽环的硫氧还蛋白(trxa)。进一步的详情参见expertopin.biol.ther.5,783-797(2005)。微体衍生自长度为25-50个氨基酸的天然发生微蛋白,其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的例子包括kalatabi和芋螺毒素和knottin。微蛋白具有能改造成包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的总体折叠的环。经过改造的knottin域的进一步详情参见wo2008098796。脂质运载蛋白是一个细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,诸如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有一些环,能改造成结合不同靶抗原。抗运载蛋白的尺寸介于160-180个氨基酸之间,而且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见biochimbiophysacta1482:337-350(2000),biodrugs19(5),279-288(2005),us7250297b1和us20070224633。与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ecm)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。术语“能够特异性结合her2”指能够以足够亲和力结合her2,使得该抗原结合分子在靶向her2中作为诊断和/或治疗剂是有用的抗原结合分子。抗原结合分子包括但不限于抗体,fab分子,交换fab分子,单链fab分子,fv分子,scfv分子,单域抗体,和vh和支架抗原结合蛋白。在一个方面,抗her2抗原结合分子结合无关的,非her2的蛋白质的程度小于该抗原结合分子对her2的结合的约10％,如例如通过表面等离振子共振(spr)测量的。特别地,能够特异性结合her2的抗原结合分子具有≤1μm,≤100nm,≤10nm,≤1nm,≤0.1nm,≤0.01nm,或≤0.001nm(例如10-8m或更少,例如10-8m至10-13m,例如10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。在某些方面,抗her2抗原结合分子结合来自不同物种的her2。特别地,抗her2抗原结合分子结合人和食蟹猴her2。术语“表位”表示抗原(或是蛋白质性质的或是非蛋白质性质的)上受到抗[[pro]]抗体结合的位点。表位可以自连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位),例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。线性表位典型地在蛋白质性质的抗原暴露于变性剂之后仍然受到抗体结合,而构象表位典型地在用变性剂处理之后遭到破坏。表位包含处于独特空间构象的至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,或8-10个氨基酸。“表位4d5”或“4d5表位”或“4d5”指her2的胞外域中与抗体4d5(atcccrl10463)和曲妥珠单抗结合的区域。此表位接近her2的跨膜域,且在her2的域iv内。为了筛选结合4d5表位的抗体,可以实施常规的交叉阻断测定法,诸如antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,edharlow和davidlane,1988中所记载的。或者,可以实施表位作图以评估抗体是否结合her2的4d5表位(例如人her2(seqidno:54)的大约残基550至大约残基610的区域(含两端点)中的任何一个或多个残基)。“表位2c4”或“2c4表位”指her2的胞外域中与抗体2c4结合的区域。为了筛选结合2c4表位的抗体,可以实施常规的交叉阻断测定法,诸如antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,edharlowanddavidlane(1988)中所记载的。或者,可以实施表位作图以评估抗体是否结合her2的2c4表位。表位2c4包含来自her2胞外域中的域ii的残基。2c4抗体和帕妥珠单抗在域i,ii和iii的连接处结合her2的胞外域(franklinetal.,cancercell5:317-328(2004))。“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(spr)技术(在biacore仪器上分析)(liljebladetal.,glycoj17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如spr测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μm,≤100nm,≤10nm,≤1nm,≤0.1nm,≤0.01nm,或≤0.001nm(例如10-8m或更小,例如10-8m至10-13m,例如10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶y的亲和力一般可以用解离常数(kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是koff和kon)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(spr)。如本文中使用的“靶细胞抗原”指在靶细胞(例如t细胞或b细胞,肿瘤中的细胞,诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)的表面上呈现的抗原性决定簇。在某些方面,靶细胞抗原是癌细胞的表面上的抗原。在一个方面,靶细胞抗原是her2。术语“her2”,也称作“erbb2”,“erbb2受体”,或“c-erb-b2”,指起因于细胞中加工her2前体蛋白的任何天然,成熟her2。除非另外指示,该术语包括来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人和食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的her2。该术语还包括her2的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性人her2蛋白质的的氨基酸序列显示于seqidno:54。如本文中使用的,“t细胞抗原”指t淋巴细胞,特别是细胞毒性t淋巴细胞的表面上呈递的抗原性决定簇。如本文中使用的,“t细胞活化性治疗剂”指能够在受试者中诱导t细胞活化的治疗剂,特别是设计用于在受试者中诱导t细胞活化的治疗剂。t细胞活化性治疗剂的例子包括特异性结合活化性t细胞抗原,诸如cd3,和靶细胞抗原,诸如cea或叶酸受体的双特异性抗体。如本文中使用的,“活化性t细胞抗原”指由t淋巴细胞,特别是细胞毒性t淋巴细胞表达的抗原性决定簇,其在与抗原结合分子相互作用后能诱导或增强t细胞活化。具体地,抗原结合分子与活化性t细胞抗原的相互作用可诱导t细胞活化,其通过触发t细胞受体复合物的信号传导级联进行。一种例示性活化性t细胞抗原是cd3。除非另外指示,术语“cd3”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然cd3。该术语涵盖“全长”,未加工的cd3以及起因于细胞中加工的cd3的任何形式。该术语还涵盖cd3的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,cd3是人cd3,特别是人cd3的厄普西隆亚基(cd3ε)。人cd3ε的氨基酸序列显示于uniprot(www.uniprot.org)登录号p07766(版本144),或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_000724.1。还见seqidno:85。食蟹猴[macacafascicularis]cd3ε的氨基酸序列显示于ncbigenbankno.bab71849.1。还见seqidno:86。术语“可变域”或“可变区”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是vh和vl)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(fr)和三个高变区(hvr)。参见例如kindtetal.,kubyimmunology,6thed.,w.h.freemanandco.,p.91(2007)。单个vh或vl域可足以赋予抗原结合特异性。如本文中使用的,术语“高变区”或“hvr”指抗原结合可变域中在序列上高变和决定抗原结合特异性的每个区,例如“互补决定区”(“cdr”)。一般地,抗原结合域包含6个hvr:三个在vh中(cdr-h1,cdr-h2,cdr-h3),且三个在vl中(cdr-l1,cdr-l2,cdr-l3)。本文中的例示性cdr包括:(a)高变环,存在于氨基酸残基26-32(l1),50-52(l2),91-96(l3),26-32(h1),53-55(h2),和96-101(h3)(chothiaandlesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))；(b)cdr,存在于氨基酸残基24-34(l1),50-56(l2),89-97(l3),31-35b(h1),50-65(h2),和95-102(h3)(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))；和(c)抗原接触,存在于氨基酸残基27c-36(l1),46-55(l2),89-96(l3),30-35b(h1),47-58(h2),和93-101(h3)(maccallumetal.j.mol.biol.262:732-745(1996))。除非另外指明,cdr是依照kabat等人,见上文确定的。本领域技术人员会理解,cdr指派也可以依照chothia,见上文,mccallum,见上文,或任何其它科学界接受的命名法来确定。kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将“kabat编号方式”的这种系统指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“kabat编号方式”是指由kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequenceofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)中列出的编号系统。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照kabat编号系统。如本文中使用的,在抗原结合分子(例如抗体)的语境中术语“亲和力成熟的”指如下的抗原结合分子,其例如通过突变而自参照抗原结合分子衍生,与参照抗体结合相同抗原,优选结合相同表位；且对抗原具有比参照抗原结合分子要高的亲和力。亲和力成熟一般牵涉修饰抗原结合分子的一个或多个cdr中的一个或多个氨基酸残基。典型地,亲和力成熟的抗原结合分子与初始参照抗原结合分子结合相同表位。“框架”或“fr”指除了高变区(hvr)残基之外的可变域残基。可变域的fr一般由四个fr域组成:fr1,fr2,fr3,和fr4。因而,hvr和fr序列一般在vh(或vl)中以下述顺序出现:fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。出于本文中的目的,“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(vl)框架或重链可变域(vh)框架的氨基酸序列的框架。“自”人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列,或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,vl受体人框架在序列上与vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:iga,igd,ige,igg,和igm,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。术语“自人起源衍生的恒定区”或“人恒定区”表示亚类igg1,igg2,igg3,或igg4的人抗体的恒定重链区和/或卡帕或拉姆达的恒定轻链区。此类恒定区是本领域公知的且例如描述于kabat,e.a.,etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)(还见例如johnson,g.,andwu,t.t.,nucleicacidsres.28(2000)214-218；kabat,e.a.etal.,proc.natl.acad.sci.usa72(1975)2785-2788)。除非本文中另有规定,恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照eu编号系统,也称作kabat的eu索引,如描述于kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242。“人源化”抗体指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个hvr(例如cdr)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个fr对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于c1q结合和/或fc受体(fcr)结合的那些。“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。本文中的术语“fc域”或“fc区”用于定义抗体重链中含有恒定区的至少一部分的c端区域。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个实施方案中,人igg重链fc区自cys226或pro230延伸至重链的羧基末端。然而,由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割,自重链的c端切除一个或多个,特别是一个或两个氨基酸。因此,通过编码全长重链的特定核酸分子的表达由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个c端氨基酸是甘氨酸(g446)和赖氨酸(k447,编号方式依照kabateu索引)时可能就是这种情况。因此,fc区的c端赖氨酸(lys447),或c端甘氨酸(gly446)和赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。如果没有另外指明的话,包括fc区的重链的氨基酸序列在本文中在没有c端甘氨酸-赖氨酸二肽的情况下表示。在一个实施方案中,依照本发明的抗体中包含的包括本文中规定的fc区的重链包含另外的c端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447,编号方式依照kabat的eu索引)。在一个实施方案中,依照本发明的抗体中包含的包括本文中规定的fc区的重链包含另外的c端甘氨酸残基(g446,编号方式依照kabat的eu索引)。除非本文中另有规定,fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照eu编号系统,也称作eu索引,如kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中描述的。iggfc区包含iggch2和iggch3域。人iggfc区的“ch2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于ch2域。本文中的ch2域可以是天然序列ch2域或变体ch2域。“ch3域”包含fc区中在ch2域c端的那段残基(即自igg的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的ch3区可以是天然序列ch3域或变体ch3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的ch3域；参见美国专利no.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体ch3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。“节-入-穴”技术在例如us5,731,168；us7,695,936；ridgwayetal.,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代t366w,而穴修饰包含fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代t366s,l368a和y407v。在又一个具体实施方案中,fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代s354c,而fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代y349c。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。编号方式依照kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中的eu索引。“与免疫球蛋白的fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的fc区的n端或c端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如bowie,j.u.etal.,science247:1306-10(1990))。术语“效应器功能”指那些可归于抗体的fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc),fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc),抗体依赖性细胞吞噬(adcp),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调,和b细胞活化。“活化性fc受体”是在受到抗体的fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的fc受体。活化性fc受体包括fcγriiia(cd16a),fcγri(cd64),fcγriia(cd32),和fcαri(cd89)。一种特定活化性fc受体是人fcγriiia(参见uniprot登录号p08637,版本141)。术语“tnf配体家族成员”或“tnf家族配体”指促炎性细胞因子。细胞因子,特别是tnf配体家族的成员,一般在免疫系统的刺激和协调中发挥至关紧要的作用。目前,基于序列,功能,和结构相似性,已经将19种细胞因子鉴定为tnf(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是具有c端细胞外结构域(外域),n端细胞内结构域和单个跨膜结构域的ii型跨膜蛋白。称作tnf同源域(thd)的c端细胞外结构域在超家族成员之间具有20-30％氨基酸同一性且负责结合受体。tnf外域还负责tnf配体形成受到其特异性受体识别的三聚体复合物。tnf配体家族的成员选自由淋巴毒素α(也称作lta或tnfsf1),tnf(也称作tnfsf2),ltβ(也称作tnfsf3),ox40l(也称作tnfsf4),cd40l(也称作cd154或tnfsf5),fasl(也称作cd95l,cd178或tnfsf6),cd27l(也称作cd70或tnfsf7),cd30l(也称作cd153或tnfsf8),4-1bbl(也称作tnfsf9),trail(也称作apo2l,cd253或tnfsf10),rankl(也称作cd254或tnfsf11),tweak(也称作tnfsf12),april(也称作cd256或tnfsf13),baff(也称作cd257或tnfsf13b),light(也称作cd258或tnfsf14),tl1a(也称作vegi或tnfsf15),gitrl(也称作tnfsf18),eda-a1(也称作外胚层发育异常蛋白a1)和eda-a2(也称作外胚层发育异常蛋白a2)组成的组。该术语指来自任何脊椎动物来源的任何天然tnf家族配体,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。术语“共刺激性tnf配体家族成员”或“共刺激性tnf家族配体”指能够共刺激t细胞的增殖和细胞因子生成的tnf配体家族成员亚群。这些tnf家族配体能在与其相应的tnf受体相互作用时共刺激tcr信号,而且与其受体的相互作用导致tnfr相关因子(traf)的募集,这启动导致t细胞活化的信号传导级联。共刺激性tnf家族配体选自由4-1bbl,ox40l,gitrl,cd70,cd30l和light组成的组,更加特别地,共刺激性tnf配体家族成员是4-1bbl。如本文中之前描述的,4-1bbl是一种ii型跨膜蛋白且是tnf配体家族的一个成员。已经描述了具有seqidno:69的氨基酸序列的完整或全长4-1bbl在细胞的表面上形成三聚体。通过4-1bbl的外域的特定基序而实现三聚体的形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区”。人4-1bbl序列的氨基酸50-254(seqidno:70)形成4-1bbl的细胞外结构域,但是甚至其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中,术语“4-1bbl的外域或其片段”指具有选自seqidno:4(人4-1bbl的氨基酸52-254),seqidno:1(人4-1bbl的氨基酸71-254),seqidno:3(人4-1bbl的氨基酸80-254)和seqidno:2(人4-1bbl的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽或具有选自seqidno:5(人4-1bbl的氨基酸71-248),seqidno:8(人4-1bbl的氨基酸52-248),seqidno:7(人4-1bbl的氨基酸80-248)和seqidno:6(人4-1bbl的氨基酸85-248)的氨基酸序列的多肽,但是能够三聚化的外域的其它片段也包括在本文中。“外域”是膜蛋白中延伸入细胞外空间(即靶细胞以外的空间)的结构域。外域通常是蛋白质中启动与表面接触的部分,这导致信号转导。如此,如本文中定义的tnf配体家族成员的外域指tnf配体蛋白中延伸入细胞外空间的部分(细胞外结构域),但还包括负责三聚化和结合相应的tnf受体的更短部分或其片段。如此,术语“tnf配体家族成员的外域或其片段”指tnf配体家族成员中形成细胞外结构域的细胞外结构域或其仍然能够结合受体的部分(受体结合域)。术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(g4s)n,(sg4)n或g4(sg4)n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于1和4之间的数目,特别是2,即肽选自由ggggs(seqidno:71),ggggsggggs(seqidno:68),sggggsgggg(seqidno:72),(g4s)3或ggggsggggsggggs(seqidno:73),ggggsggggsgggg或g4(sg4)2(seqidno:74),和(g4s)4或ggggsggggsggggsggggs(seqidno:75)组成的组,但是还包括序列gspgssssgs(seqidno:76),gsgsgsgs(seqidno:77),gsgsgngs(seqidno:78),ggsgsgsg(seqidno:79),ggsgsg(seqidno:80),ggsg(seqidno:81),ggsgngsg(seqidno:82),ggngsgsg(seqidno:83)和ggngsg(seqidno:84)。特别感兴趣的肽接头是(g4s)1或ggggs(seqidno:71),(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:68)和(g4s)3(seqidno:73)。如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:a),精氨酸(arg,r),天冬酰胺(asn,n),天冬氨酸(asp,d),半胱氨酸(cys,c),谷氨酰胺(gln,q),谷氨酸(glu,e),甘氨酸(gly,g),组氨酸(his,h),异亮氨酸(ile,i),亮氨酸(leu,l),赖氨酸(lys,k),甲硫氨酸(met,m),苯丙氨酸(phe,f),脯氨酸(pro,p),丝氨酸(ser,s),苏氨酸(thr,t),色氨酸(trp,w),酪氨酸(tyr,y),和缬氨酸(val,v)。如本文中使用的“融合多肽”或“融合蛋白”指由抗体片段和并非自抗体衍生的肽构成的单链多肽。在一个方面,融合多肽由与抗原结合域或fc部分的一部分融合的一个或两个4-1bbl的外域或其片段构成。融合可通过经由肽接头将抗原结合模块的n端或c端氨基酸与所述4-1bbl的外域或其片段的c或n端氨基酸直接连接而发生。“融合”或“连接”意味着各构件(例如多肽和所述tnf配体家族成员的外域)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如blast,blast-2,align.sawi或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序align-2生成％氨基酸序列同一性值。align-2序列比较计算机程序由genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(washingtond.c.,20559),以美国版权注册号txu510087注册。公众自genentech公司(southsanfrancisco,california)可得到align-2程序,或者可以自源代码编译。align-2程序应当编译成在unix操作系统,包括数码unixv4.0d上使用。所有序列比较参数由align-2程序设置且不变。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列a相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列a具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列b的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:100乘分数x/y其中x是由序列比对程序align-2在该程序的a和b的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中y是b中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况中,a相对于b的％氨基酸序列同一性会不等于b相对于a的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用align-2计算机程序获得的。在某些实施方案中,涵盖本文中提供的含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可进行删除,插入,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括hvr和框架(fr)。保守替代在表a中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的adcc或cdc。表a氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:(1)疏水性的:正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile；(2)中性亲水性的:cys,ser,thr,asn,gln；(3)酸性的:asp,glu；(4)碱性的:his,lys,arg；(5)影响链取向的残基:gly,pro；(6)芳香族的:trp,tyr,phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个cdr残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个cdr内发生替代,插入,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在cdr中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由cunninghamandwells(1989)science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如arg,asp,his,lys,和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n端甲硫氨酰基残基的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。分子的其它插入变体包括与延长含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的血清半衰期的多肽的n或c端的融合。在某些实施方案中,改变本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过n连接附着至fc区的ch2域的asn297。参见例如wrightetal.,tibtech15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,n-乙酰葡糖胺(glcnac),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的adcc功能,参见例如美国专利公开号us2003/0157108(presta,l.)或us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd)。本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的别的变体包括那些具有两分寡糖的,例如,其中附着于fc区的双触角寡糖通过glcnac两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能,参见例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利no.6,602,684(umana等人)；和us2005/0123546(umana等人)。还提供附着于fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的cdc功能且在例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；和wo1999/22764(raju,s.)中描述。在某些实施方案中,可能想要创建本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thiomab”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的v205(kabat编号方式)；重链的a118(eu编号方式)；和重链fc区的s400(eu编号方式)。可以如例如美国专利no.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。在某些方面,可一步修饰本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(peg),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(或是均聚物或是随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可基于下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,双特异性抗体衍生物是否会用于限定条件下的疗法,等。在另一个方面,提供抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(kam,n.w.etal.,proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长的,而且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。在另一个方面,可获得本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基(具体是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(c),鸟嘌呤(g),腺嘌呤(a),胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)),糖(即脱氧核糖或核糖),和磷酸基团构成。常常,核酸分子通过碱基序列来描述,由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列典型地以5’至3’呈现。在本文中,术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(dna)(包括例如互补dna(cdna)和基因组dna),核糖核酸(rna)(特别是信使rna(mrna)),合成形式的dna或rna,和包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。另外,术语核酸分子包括有义和反义链二者,以及单链和双链形式。此外,本文中描述的核酸分子可含有天然发生的或非天然发生的核苷酸。非天然发生的核苷酸的例子包括具有衍生化的糖或磷酸主链连接的经修饰核苷酸碱基或经化学修饰的残基。核酸分子还涵盖适合作为用于在体外和/或在体内(例如在宿主或患者中)直接表达本发明的抗体的载体的dna和rna分子。此类dna(例如cdna)或rna(例如mrna)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如,可以化学修饰mrna以增强rna载体的稳定性和/或编码分子的表达,使得能将mrna注射入受试者以在体内生成抗体(见例如stadleretal.,naturemedicine2017,2017年6月12日在线发表,doi:10.1038/nm.4356或ep2101823b1)。“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,dna或rna。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。分离的rna分子包括本发明的体内或体外rna转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括多至该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中多至5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的多至5％的数目的多个核苷酸可插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如align-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体dna,质体dna,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的dna分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mrna的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如cho细胞,bhk细胞,ns0细胞,sp2/0细胞,yo骨髓瘤细胞,p3x63小鼠骨髓瘤细胞,per细胞,per.c6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。药剂(例如药用组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。术语“药用组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。“药学可接受赋形剂”指药用组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。如本文中使用的,“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。如本文中使用的术语“癌症”指增殖性疾病,诸如淋巴瘤,癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,白血病,淋巴细胞性白血病,肺癌,非小细胞肺(nscl)癌,支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈癌,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,肛门区癌,胃癌,胃的癌,结肠直肠癌(crc),胰腺癌,乳腺癌,三重阴性乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,宫颈癌,阴道癌,外阴癌,霍奇金(hodgkin)氏病,食管癌,小肠癌,内分泌系统的癌症,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,前列腺癌,膀胱癌,肾或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆道癌,中枢神经系统(cns)赘生物,脊索瘤,脑干胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,施旺细胞瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,脑膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤和尤因氏肉瘤,黑素瘤,多发性骨髓瘤,b细胞癌(淋巴瘤),慢性淋巴细胞性白血病(cll),急性成淋巴细胞性白血病(all),毛细胞白血病,慢性成髓细胞性白血病,包括任何上述癌症的顽固性形式,或一种或多种上述癌症的组合。“her2阳性”癌症包含具有高于正常的her2水平的癌细胞。her2阳性癌症的例子包括her2阳性乳腺癌和her2阳性胃癌。任选地,her2阳性癌症具有2+或3+的免疫组织化学(ihc)得分和/或>2.0的原位杂交(ish)扩增比率。“早期阶段乳腺癌(ebc)”或“早期乳腺癌”在本文中用于指尚未扩散到乳腺或腋淋巴结之外的乳腺癌。这包括原位导管癌和i期,iia期,iib期,和iiia期乳腺癌。将肿瘤或癌症称为“0期”,“i期”,“ii期”,“iii期”,或“iv期”,和此分类内的各个亚阶段指示使用本领域中已知的总体阶段分组(overallstagegrouping)或roman数字分期(romannumeralstaging)方法分类肿瘤或癌症。虽然癌症的实际阶段取决于癌症的类型,但是一般地,0期癌症是原位损伤,i期癌症是小局部化肿瘤,ii和iii期癌症是展现局部淋巴结累及的局部晚期肿瘤,而iv期癌症代表转移性癌症。每种类型的肿瘤的具体阶段是熟练内科医生已知的。术语“转移性乳腺癌”意指癌细胞通过血管或淋巴管自初始部位传播至身体中别处的一个或多个部位以在乳房外的一种或多种器官中形成一个或多个继发性肿瘤的乳腺癌状态。“晚期”癌症是已经通过局部侵入或转移在起源的部位或器官外部扩散的癌症。因而,术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病两者。“复发性”癌症是在响应初始疗法,诸如手术后在初始部位处或在远端部位处已经再生长的癌症。“局部复发性”癌症是与先前治疗的癌症在相同位置中在治疗后复发的癌症。“能施手术的”或“可切除的”癌症是局限于原发性器官且适合于手术(切除)的癌症。“非可切除的”或“不可切除的”癌症不能通过手术去除(切除)。本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子本发明提供新颖的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其具有特别有利特性,诸如可生产性,稳定性,结合亲和力,生物学活性,靶向效率,降低的毒性和降低的免疫原性。在第一方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1bbl外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在又一个方面,提供的是如本文中之前限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于(i)分别地,该第一多肽含有ch1或cl域且该第二多肽含有cl或ch1域,其中通过该ch1和cl域之间的二硫键该第二多肽连接至该第一多肽,且所述多肽中其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch1或cl域且彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与该cl或ch1域连接的一个所述4-1bbl外域或其片段,或(ii)分别地,该第一多肽含有ch3域且该第二多肽含有ch3域,且所述多肽中其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch3域的c端且彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与该ch3域的c端连接的仅仅一个所述4-1bbl外域或其片段,或(iii)分别地,该第一多肽含有vh-cl或vl-ch1域且该第二多肽含有vl-ch1域或vh-cl域,其中通过该ch1和cl域之间的二硫键该第二多肽连接至该第一多肽,且所述多肽中其中该第一多肽包含通过肽接头与vh或vl且彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与vl或vh连接的一个4-1bbl外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在另一个方面,提供的是如本文中之前限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于(i)分别地,该第一多肽含有ch1或cl域和该第二多肽含有cl或ch1域,其中通过该ch1和cl域之间的二硫键该第二多肽连接至该第一多肽,且所述多肽中其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch1或cl域且彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与该cl或ch1域连接的一个所述4-1bbl外域或其片段,或(ii)分别地,该第一多肽含有ch3域且该第二多肽含有ch3域,且所述多肽中其中该第一多肽包含通过肽接头与该ch3域的c端且彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与该ch3域的c端连接的仅仅一个所述4-1bbl外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个方面,该4-1bbl外域包含选自由seqidno:1,seqidno:2,seqidno:3,seqidno:4,seqidno:5,seqidno:6,seqidno:7和seqidno:8组成的组的氨基酸序列,特别是seqidno:1或seqidno:5的氨基酸序列。更加特别地,该4-1bbl外域包含seqidno:1或seqidno:5的氨基酸序列。最特别地,该4-1bbl外域包含seqidno:5的氨基酸序列。特别是,提供的是如本文中之前限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中所有三个4-1bbl外域或其片段是相同的。在又一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由seqidno:9,seqidno:10,seqidno:11和seqidno:12组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由seqidno:1,seqidno:5,seqidno:3和seqidno:4组成的组的氨基酸序列,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:10的氨基酸序列且在于该第二多肽包含seqidno:5的氨基酸序列,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在又一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:9的氨基酸序列且在于该第二多肽包含seqidno:1的氨基酸序列,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在另一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)分别地,含有ch1或cl域的第一多肽和含有cl或ch1域的第二多肽,其中通过该ch1和cl域之间的二硫键该第二多肽连接至该第一多肽,且所述多肽中其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该ch1或cl域且彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且在于该第二多肽包含通过肽接头与该cl或ch1域连接的仅仅一个4-1bbl外域或其片段。在一个方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)含有ch1域的第一多肽和含有cl域的第二多肽,其中通过该ch1和cl域之间的二硫键该第二多肽连接至该第一多肽,且所述多肽中其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该ch1域且彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与该cl域连接的一个4-1bbl外域或其片段。在另一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)一个能够特异性结合her2的抗原结合域,和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1bbl外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在还有另一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)多于一个能够特异性结合her2的抗原结合域,和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1bbl外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合her2的抗原结合域,和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1bbl外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在又一个方面,本发明提供如本文中之前限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域选自由抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白组成的组。在一个方面,提供的是如本文中之前描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域选自由抗体片段,fab分子,交换fab分子,单链fab分子,fv分子,scfv分子,单域抗体,avh和支架抗原结合蛋白组成的组。在一个方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域是avh或支架抗原结合蛋白。在一个特定方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域是能够特异性结合her2的fab分子或交换fab分子。特别地,该能够特异性结合her2的抗原结合域是能够特异性结合her2的fab。在又一个方面,提供的是依照本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中包含通过第一肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段的肽在它的c端通过第二肽接头与重链的ch1域融合且其中一个所述4-1bbl外域或其片段在它的c端通过第三肽接头与轻链上的cl域融合。在另一个方面,提供的是依照本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中包含通过第一肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段的肽在它的c端通过第二肽接头与重链的cl域融合且其中一个所述4-1bbl外域或其片段在它的c端通过第三肽接头与轻链上的ch1域融合。在又一个方面,本发明涉及依照本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中包含通过第一肽接头彼此连接的两个4-1bbl外域或其片段的肽在它的c端通过第二肽接头与轻链的cl域融合且其中一个所述4-1bbl外域或其片段在它的c端通过第三肽接头与重链的ch1域融合。在一个特定方面,本发明涉及如上文限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该肽接头是(g4s)2。在一个方面,该第一肽接头是(g4s)2(seqidno:68),该第二肽接头是(g4s)2(seqidno:68)且该第三肽接头是(g4s)2(seqidno:68)。在另一个方面,如本文中之前限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。特别地,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)能够特异性结合her2的fab分子,其中该fab重链在c端与该fc域中的ch2域的n端融合,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在又一个方面,该fc域是igg,特别是igg1fc域或igg4fc域。更加特别地,该fc域是igg1fc域。在一个特定方面,该fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。降低fc受体结合和/或效应器功能的fc域修饰本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的fc域由包含免疫球蛋白分子的重链域的一对多肽链组成。例如,免疫球蛋白g(igg)分子的fc域是二聚体,其每个亚基包含ch2和ch3igg重链恒定域。fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。fc域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药动学特性,包括有助于较好的在靶组织中的积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而,与此同时,这可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而,在特定方面,与天然igg1fc域相比,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的fc域展现降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面,fc并不实质性结合fc受体和/或并不诱导效应器功能。在一个特定方面,fc受体是fcγ受体。在一个方面,fc受体是人fc受体。在一个具体方面,fc受体是活化性人fcγ受体,更具体地是人fcγriiia,fcγri或fcγriia,最具体地是人fcγriiia。在一个方面,fc域并不诱导效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下述一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(cdc),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc),降低的抗体依赖性细胞吞噬(adcp),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,降低的对nk细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的t细胞引发。在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的fc区,由此生成fc区变体。fc区变体可包含包含一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如替代)的人fc区序列(例如人igg1,igg2,igg3或igg4fc区)。在一个特定方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的4-1bbl的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含4-1bbl的一个外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该fc域包含一处或多处降低对fc受体,特别是对fcγ受体的结合的氨基酸替代。在一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的fc域包含一处或多处降低fc域对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地,在fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。特别是,fc域包含位置e233,l234,l235,n297,p331和p329(eu编号方式)处的氨基酸替代。特别是,fc域包含igg重链的位置234和235(eu编号方式)和/或329(eu编号方式)处的氨基酸替代。更特别地,提供的是依照本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含具有igg重链中的氨基酸替代l234a,l235a和p329g(“p329glala”,eu编号方式)的fc域。氨基酸替代l234a和l235a指所谓的lala突变。“p329glala”氨基酸替代组合几乎完全消除人igg1fc域的fcγ受体结合且在国际专利申请公开号wo2012/130831a1中描述,其还描述了制备此类突变体fc域的方法及用于测定其特性诸如fc受体结合或效应器功能的方法。“eu编号方式”指依照kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991的eu索引的编号方式。具有降低的fc受体结合和/或效应器功能的fc域还包括那些具有一个或多个fc域残基238,265,269,270,297,327和329的替代的(美国专利no.6,737,056)。此类fc突变体包括具有两个或更多个氨基酸位置265,269,270,297和327处的替代的fc突变体,包括具有残基265和297替代变成丙氨酸的替代的所谓的“dana”fc突变体(美国专利no.7,332,581)。在另一个方面,fc域是igg4fc域。与igg1抗体相比,igg4抗体展现降低的对fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。在一个更具体方面,fc域是包含位置s228(kabat编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代s228p的igg4fc域。在一个更具体方面,fc域是包含氨基酸替代l235e和s228p和p329g(eu编号方式)的igg4fc域。此类igg4fc域突变体和其fcγ受体结合特性也在wo2012/130831中描述。突变体fc域可使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码dna序列的位点特异性诱变,pcr,基因合成,等等。正确的核苷酸变化可例如通过测序来验证。对fc受体的结合可例如通过elisa或通过使用标准仪器诸如biacore仪(gehealthcare)的表面等离振子共振(spr),和fc受体(诸如可通过重组表达获得的)容易地测定。一种合适的此类结合测定法在本文中描述。或者,fc域或包含fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对fc受体的结合亲和力可使用已知表达特定fc受体的细胞系,诸如表达fcγiiia受体的人nk细胞来评估。fc域或包含fc域的本发明的双特异性抗体的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。一种合适的用于测量adcc的测定法在本文中描述。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的其它例子在美国专利no.5,500,362；hellstrometal.,procnatlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrometal.,procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利no.5,821,337；bruggemannetal.,jexpmed166,1351-1361(1987)中描述。或者,可采用非放射性测定法方法(参见例如actitm用于流式细胞术的非放射性细胞毒性测定法(celltechnology,inc.,mountainview,ca)；和cytotox非放射性细胞毒性测定法(promega,madison,wi))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(pbmc)和天然杀伤(nk)细胞。或者/另外,可以在体内,例如在动物模型中评估感兴趣分子的adcc活性,诸如clynesetal.,procnatlacadsciusa95,652-656(1998)中公开的。在一些实施方案中,fc域对补体成分,具体是c1q的结合降低。因而,在其中将fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的cdc。可以进行c1q结合测定来确定本发明的双特异性抗体是否能够结合c1q并因此具有cdc活性。参见例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c结合elisa。为了评估补体活化,可实施cdc测定法(参见例如gazzano-santoroetal.,jimmunolmethods202,163(1996)；craggetal.,blood101,1045-1052(2003)；和craggandglennie,blood103,2738-2743(2004))。在一个特定方面,fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。促进异二聚化的fc域修饰在一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的4-1bbl的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含4-1bbl的一个外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。如此,它们包含与典型地包含在两条不相同多肽链(“重链”)中的fc域的两个亚基之一或另一融合的不同模块。这些多肽的重组共表达和后续二聚化导致两条多肽的数种可能组合。为了改善重组生成中含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的产率和纯度,在本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的fc域中引入促进想要的多肽的联合的修饰如此会是有利的。因而,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人iggfc域的两个亚基之间最广泛蛋白质-蛋白质相互作用的位点在fc域的ch3域中。如此,所述修饰特别是在fc域的ch3域中。在一个具体方面,所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,包含fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。如此,在一个特定方面,本发明涉及如本文中之前描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包括igg分子,其中第一重链的fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的fc部分包含第二二聚化模块,容许igg分子的两条重链异二聚化,而且依照节入穴技术,第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包括穴。“节-入-穴”技术在例如us5,731,168；us7,695,936；ridgwayetal.,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。因而,在一个特定方面,在本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的fc域的第一亚基的ch3域中将氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的ch3域内生成隆起,其可放置在第二亚基的ch3域内的空腔中,并且在fc域的第二亚基的ch3域中将氨基酸残基用具有较小侧链体积的氨基酸酸残基替换,由此在第二亚基的ch3域内生成空腔,其内可放置第一亚基的ch3域内的隆起。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体方面,在fc域的第一亚基的ch3域中将位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(t366w),并且在fc域的第二亚基的ch3域中将位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(y407v)。更特别地,在fc域的第二亚基中另外将位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(t366s)并将位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(l368a)。更特别地,在fc域的第一亚基中另外将位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(s354c),并且在fc域的第二亚基中另外将位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(y349c)。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步稳定化二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一个备选方面,促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如如pct公开文本wo2009/089004中描述的。一般地,这种方法牵涉将两个fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基用带电荷氨基酸残基替换,使得同二聚体形成变成在静电方面不利但异二聚化在静电方面有利。ch1/cl域中的修饰为了进一步改善正确配对,该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子可含有不同的带电荷氨基酸替代(所谓的“带电荷残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉ch1和cl域。在一个特定方面,本发明涉及一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中在cl域之一中位置123(eu编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(r)替换且位置124(eu编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(k)替换,且其中在ch1域之一中位置147(eu编号方式)处和位置213(eu编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(e)替换。更特别地,本发明涉及一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中在邻近该tnf配体家族成员的cl域中位置123(eu编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(r)替换且位置124(eu编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(k)替代,且其中在邻近该tnf配体家族成员的ch1域中位置147(eu编号方式)处和位置213(eu编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(e)替代。如此,在一个特定方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合her2的抗原结合域,(b)含有包含氨基酸突变e123r和q124k的cl域的第一多肽和含有包含氨基酸突变k147e和k213e的ch1域的第二多肽,其中该第二多肽通过该ch1和cl域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该cl域且彼此连接的4-1bbl的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的ch1域连接的4-1bbl的一个外域或其片段；和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中在邻近该tnf配体家族成员的cl域中位置123(eu编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(r)替换且位置124(eu编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(k)替代,且其中在邻近该tnf配体家族成员的ch1域中位置147(eu编号方式)处和位置213(eu编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(e)替代。这些修饰导致所谓的带电荷残基,其具有避免不想要的结果诸如例如错配的有利特性。特别地,该cl域包含氨基酸突变e123r和q124k且该ch1域包含氨基酸突变k147e和k213e。特定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含能够特异性结合her2的抗原结合域。在一个特定方面,该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含一个能够特异性结合her2的模块,意味着该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子是单价的。在另一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其包含两个能够特异性结合her2的模块,意味着该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子是二价的。在一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含(a)vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l3,或(c)vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:21的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:22的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:23的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:24的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含vh域和vl域,该vh域包含(i)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:31的氨基酸序列的cdr-h3,该vl域包含(iv)包含seqidno:32的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域包含包含与seqidno:19的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno:20的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域包含包含与seqidno:27的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno:28的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域包含包含与seqidno:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含与seqidno:36的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含(a)包含seqidno:19的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:20的氨基酸序列的vl域,或(b)包含seqidno:27的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:28的氨基酸序列的vl域,或(c)包含seqidno:35的氨基酸序列的vh域和包含seqidno:36的氨基酸序列的vl域。在一个方面,提供的是如本文中之前限定的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含包含seqidno:19的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:20的氨基酸序列的可变轻链或其中该能够特异性结合her2的抗原结合域包含包含seqidno:35的氨基酸序列的可变重链和包含seqidno:36的氨基酸序列的可变轻链。在一个特定方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域包含包含seqidno:19的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:20的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域包含包含seqidno:35的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:36的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面,该能够特异性结合her2的抗原结合域包含由seqidno:27的氨基酸序列组成的vh域和由seqidno:28的氨基酸序列组成的vl域。在又一个方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:19的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:20的氨基酸序列的vl域的第一轻链,或包含包含seqidno:27的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:28的氨基酸序列的vl域的第一轻链,或包含包含seqidno:35的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:36的氨基酸序列的vl域的第一轻链,(ii)包含选自由seqidno:37,seqidno:39,seqidno:41和seqidno:43组成的组的氨基酸序列的第二重链,和(iii)包含选自由seqidno:38,seqidno:40,seqidno:42和seqidno:44组成的组的氨基酸序列的第二轻链。在一个特定方面,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子包含(a)特异性结合her2的抗原结合域,其包含包含seqidno:19的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:20的氨基酸序列的轻链可变区或包含seqidno:27的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸序列的轻链可变区或包含seqidno:35的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:36的氨基酸序列的轻链可变区,和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含seqidno:10的氨基酸序列且该第二多肽包含seqidno:5的氨基酸序列。在一个特定方面,提供的是一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含(i)包含包含seqidno:19的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:20的氨基酸序列的vl域的第一轻链,或包含包含seqidno:27的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:28的氨基酸序列的vl域的第一轻链,或包含包含seqidno:35的氨基酸序列的vh域的第一重链和包含包含seqidno:36的氨基酸序列的vl域的第一轻链,(ii)包含选自由seqidno:37,seqidno:39,seqidno:41和seqidno:43组成的组的氨基酸序列的第二重链,和(iii)包含选自由seqidno:38,seqidno:40,seqidno:42和seqidno:44组成的组的氨基酸序列的第二轻链。在另一个方面,本发明提供一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含(a)包含seqidno:45的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:46的氨基酸序列的第一轻链,包含seqidno:37的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:38的氨基酸序列的第二轻链,或(b)包含seqidno:47的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:48的氨基酸序列的第一轻链,包含seqidno:37的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:38的氨基酸序列的第二轻链,或(c)包含seqidno:49的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:50的氨基酸序列的第一轻链,包含seqidno:37的氨基酸序列的第二重链和包含seqidno:38的氨基酸序列的第二轻链。多核苷酸本发明进一步提供分离的核酸分子,其编码如本文中描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其片段。该分离的编码本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的多核苷酸可以作为编码整个抗原结合分子的单一多核苷酸或作为共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如,免疫球蛋白的轻链部分与免疫球蛋白的重链部分可以由分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽会与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。在一些方面,该分离的核酸分子编码整个依照如本文中描述的发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。特别地,该分离的多核苷酸编码该依照如本文中描述的发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子中包含的多肽。在一个方面,本发明涉及分离的核酸分子,其编码一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,其中该核酸分子包含(a)编码能够特异性结合her2的抗原结合域的序列,(b)编码包含通过肽接头彼此连接的4-1bbl的两个外域或其片段的多肽的序列和(c)编码包含所述4-1bbl的一个外域或其片段的多肽的序列。在另一个方面,提供的是一种分离的多核苷酸,其编码含有4-1bb配体三聚体的抗原结合分子,其中该多核苷酸包含(a)编码能够特异性结合her2的模块的序列,(b)编码包含通过肽接头彼此连接的4-1bbl的两个外域或两个其片段的多肽的序列和(c)编码包含4-1bbl一个外域或其片段的多肽的序列。在某些方面,该多核苷酸或核酸是dna。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是rna,例如以信使rna(mrna)的形式。本发明的rna可以是单链的或双链的。重组方法本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子可通过例如固态肽合成(例如merrifield固相合成)或重组生成来获得。对于重组生成,分离编码例如如上文描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的一种或多种多核苷酸并插入一个或多个载体供进一步克隆和/或宿主细胞中的表达。此类多核苷酸可使用常规规程容易地分离和测序。在本发明的一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子(片段)的编码序列连同适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如maniatisetal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.(1989)中描述的技术。表达载体可以是病毒,质粒的部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括其中与启动子和/或其它转录或翻译控制元件可操作联合地克隆编码含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(tag,tga,或taa)不翻译成氨基酸,但是如果存在的话,它可考虑作为编码区的一部分,但是任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5’和3’非翻译区,等等不是编码区的部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建物中,例如在单个载体上,或在分开的多核苷酸构建物中,例如在分开的(不同的)载体上。而且,任何载体可含有单个编码区,或者可包含两个或更多个编码区,例如,本发明的载体可编码一种或多种多肽,其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译地分开成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸,或核酸可编码异源编码区,或是与编码本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段,或其变体或衍生物的多核苷酸融合或是不融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,诸如分泌信号肽或异源功能域。可操作联合是这样一种方式,当基因产物,例如多肽的编码区与一种或多种调节序列这样联合时,将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码想要的基因产物的mrna转录的话且如果两个dna片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰dna模板被转录的能力的话,两个dna片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)是“可操作联合的”。如此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录的话,启动子区与该核酸会是可操作联合的。启动子可以是仅仅在预定细胞中指导dna实质性转录的细胞特异性启动子。在启动子以外,其它转录控制元件,例如增强子,操纵基因,阻抑物,和转录终止信号可与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员知道的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区,诸如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,连同内含子a),猿病毒40(例如早期启动子),和逆转录病毒(诸如例如劳斯(rous)肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白衍生的,以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件是本领域普通技术人员知道的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子,和自病毒系统衍生的元件(特别是内部核糖体进入位点或ires,也称作cite序列)。表达盒还可包括其它特征,诸如复制起点,和/或染色体整合元件,诸如逆转录病毒长末端重复(ltr),或腺伴随病毒(aav)反向末端重复(itr)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌或信号肽(其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌)的编码区联合。例如,如果想要分泌含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的话,可以将编码信号序列的dna放置在编码本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。依照信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,其在一旦启动生长中的蛋白质链输出穿过粗面内质网时自成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的n端融合的信号肽,其自翻译的多肽切割下来以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或该序列保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者,可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化物(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。编码可用于推动稍后纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的dna可以包括在编码本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。在本发明的又一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体分别可单一地或组合地并入本文中关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”指可以工程化改造以生成本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域公知的。可以用特定的表达载体适当地转染或转导此类细胞,并且可以培养大量的含有载体的细胞供接种大规模发酵罐以获得足够数量的抗原结合分子供临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,诸如大肠杆菌,或各种真核细胞,诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞,昆虫细胞,等等。例如,特别是在不需要糖基化时,可以在细菌中生成多肽。表达后,多肽可以在可溶性级分中自细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。在原核生物以外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母对于编码多肽的载体是合适的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母株。参见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004),和lietal.,natbiotech24,210-215(2006)。对于表达(糖基化)多肽合适的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞联合使用,特别是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的众多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利no.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适应在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经sv40转化的猴肾cv1系(cos-7),人胚肾细胞系(例如grahametal.,jgenvirol36,59(1977)中描述的293或293t细胞),幼仓鼠肾细胞(bhk),小鼠塞托利(sertoli)细胞(如例如mather,biolreprod23,243-251(1980)中描述的tm4细胞),猴肾细胞(cv1),非洲绿猴肾细胞(vero-76),人宫颈癌细胞(hela),犬肾细胞(mdck),牛鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a),人肺细胞(w138),人肝细胞(hepg2),小鼠乳房肿瘤细胞(mmt060562),tri细胞(如例如matheretal.,annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)中描述的),mrc5细胞,和fs4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞,包括dhfr-cho细胞(urlaubetal.,procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如yo,ns0,p3x63和sp2/0。关于适合于蛋白质生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如yazakiandwu,methodsinmolecularbiology,vol.248(b.k.c.lo,ed.,humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(cho)细胞,人胚肾(hek)细胞或淋巴样细胞(例如y0,ns0,sp20细胞)。在这些系统中表达外来基因的标准技术是本领域已知的。可以工程化改造表达包含免疫球蛋白重链或轻链任一的多肽的细胞,从而还表达另一条免疫球蛋白链,使得所表达的产物是具有重和轻链二者的免疫球蛋白。在一个方面,提供一种生成本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的方法,其中该方法包含在适于本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段表达的条件下培养如本文中提供的包含编码本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞,和自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其多肽片段。在本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子中,各构件(至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块,一条包含tnf配体家族成员的两个外域或其片段的多肽和一条包含所述4-1bbl家族成员的一个外域或其片段的多肽)在遗传上并非彼此融合。多肽设计成使得其构件(tnf配体家族成员的两个外域或其片段和其它构件诸如ch或cl)直接地或经由接头序列彼此融合。可以依照本领域公知的方法确定接头的组成和长度,而且可以测试功效。本发明的抗原结合分子的不同构件之间的接头序列的例子见本文中提供的序列。如果想要的话,还可以包括另外的序列以掺入切割位点以分开融合蛋白的各个构件,例如内肽酶识别序列。在某些实施方案中,形成抗原结合分子的一部分的能够特异性结合靶细胞抗原的模块(例如fab片段)至少包含能够结合抗原的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然发生的抗体和其片段的一部分且自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见例如harlowandlane,"antibodies,alaboratorymanual",coldspringharborlaboratory,1988)。非天然发生抗体可以使用固相肽合成来构建,可以重组生成(例如如美国专利no.4,186,567中描述的)或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如授予mccafferty的美国专利no.5,969,108)。任何动物物种的免疫球蛋白均可在本发明中使用。在本发明中有用的非限制性免疫球蛋白可以是鼠,灵长类,或人起源的。如果融合蛋白旨在供人使用的话,可使用嵌合形式的免疫球蛋白,其中免疫球蛋白的恒定区来自人。还可依照本领域公知的方法制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如授予winter的美国专利no.5,565,332)。人源化可通过多种方法来实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)cdr嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,有或没有保留关键框架残基(例如那些对于保留优秀的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(sdr或a-cdr；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植整个非人可变域,但通过替换表面残基用人样区段“遮盖”它们。人源化抗体和生成它们的方法在例如almagroandfransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)中综述,而且在例如riechmannetal.,nature332,323-329(1988)；queenetal.,procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美国专利no.5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；jonesetal.,nature321,522-525(1986)；morrisonetal.,procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrisonandoi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyenetal.,science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmirietal.,methods36,25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)嫁接)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；dall’acquaetal.,methods36,43-60(2005)(描述“fr改组”)；和osbournetal.,methods36,61-68(2005)和klimkaetal.,brjcancer83,252-260(2000)(描述用于fr改组的“导向选择”办法)中进一步描述。依照本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。人抗体和人可变区可使用本领域已知的多种技术来生成。人抗体在vandijkandvandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)和lonberg,curropinimmunol20,450-459(2008)中一般性描述。人可变区能形成通过杂交瘤方法生成的人单克隆抗体的一部分且自其衍生(参见例如monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。人抗体和人可变区还可以通过将免疫原施用于已经修饰以响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备(参见例如lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005)。人抗体和人可变区还可以通过分离自人衍生噬菌体展示文库选择的fv克隆可变区序列来生成(参见例如hoogenboometal.,inmethodsinmolecularbiology178,1-37(o’brienetal.,ed.,humanpress,totowa,nj,2001)；和mccaffertyetal.,nature348,552-554；clacksonetal.,nature352,624-628(1991))。噬菌体典型地或是以单链fv(scfv)片段或是作为fab片段展示抗体片段。在某些方面,依照例如pct公开文本wo2012/020006(参见关于亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本no.2004/0132066中公开的方法工程化改造本发明的抗原结合分子中包含的能够特异性结合靶细胞抗原的模块(例如fab片段)以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力可经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振技术(liljebladetal.,glycoj17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。可使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参照抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子结合的表位的作图的详细的例示性方法在morris(1996)“epitopemappingprotocols”,inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中提供。在一种例示性竞争测定法中,在包含结合抗原的第一经标记抗原结合分子和第二未标记抗原结合分子(测试其与第一抗原结合分子竞争结合抗原的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗原结合分子但不包含第二未标记抗原结合分子的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育后,去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果在测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么这指示第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见harlowandlane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。如本文中所述制备的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子可通过本领域已知的技术来纯化,诸如高效液体层析术,离子交换层析术,凝胶电泳,亲和层析术,大小排阻层析术,等等。用于纯化特定蛋白质的实际条件会部分取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,而且对于本领域技术人员会是显而易见的。对于亲和层析术纯化,可使用结合含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的抗体,配体,受体或抗原。例如,对于本发明的融合蛋白的亲和层析术纯化,可使用具有蛋白a或蛋白g的基质。可以本质上如实施例中所述使用顺序蛋白a或g亲和层析术和大小排阻层析术来分离抗原结合分子。含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其片段的纯度可通过多种公知的分析方法任一来测定,包括凝胶电泳,高压液体层析术,等等。例如,如实施例中所述表达的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子显示是完整的且正确装配的,如通过还原性和非还原性sds-page证明的。测定法本文中提供的抗原结合分子可通过本领域已知的多种测定法来鉴定,筛选,或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。生物学活性可包括例如增强不同免疫细胞,尤其是t细胞的活化和/或增殖的能力。例如,它们增强免疫调控性细胞因子的分泌。增强的或能增强的其它免疫调控性细胞因子是例如il2,粒酶b等。生物学活性还可包括食蟹猴结合交叉反应性,以及对不同细胞类型的结合。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗原结合分子。1.亲和力测定法本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子对4-1bb(cd137)的亲和力可依照实施例中提出的方法通过表面等离振子共振(spr),使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子对her2的亲和力也可以通过表面等离振子共振(spr),使用标准仪器诸如biacore仪器(gehealthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。用于测量结合亲和力的一种具体的说明性和例示性实施方案在实施例4中描述。依照一个方面,于25℃使用t100机器(gehealthcare)通过表面等离振子共振测量kd。2.结合测定法和其它测定法本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子对相应的表达受体的细胞的结合可例如通过流式细胞术(facs),使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估。在一个方面,可以在结合测定法中使用表达4-1bb的新鲜外周血单个核细胞(pbmc)。在分离后(幼稚pmbc)或刺激后(活化的pmbc)直接使用这些细胞。在另一个方面,可以使用活化的小鼠脾细胞(表达4-1bb)来证明本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子对表达4-1bb的细胞的结合。在又一个方面,使用表达her2的细胞系来证明抗原结合分子对此靶细胞抗原的结合。在另一个方面,可以使用竞争测定法来鉴定与具体抗体或抗原结合分子分别竞争结合her2或4-1bb的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与具体抗her2抗体或具体抗4-1bb抗体结合的相同。用于抗体结合的表位的作图的详细例示性方法在morris(1996)“epitopemappingprotocols”,inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中提供。3.活性测定法在一个方面,提供用于鉴定具有生物学活性的结合her2和4-1bb的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的测定法。生物学活性可包括例如经由表达her2的癌细胞上的4-1bb的激动性信号传导。还提供通过该测定法鉴定为在体外具有此类生物学活性的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在某些方面,对本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子测试此类生物学活性。用于检测本发明的分子的生物学活性的测定法是实施例3中描述的那些。而且,用于检测细胞裂解(例如通过测量ldh释放),诱导的凋亡动力学(例如通过测量胱天蛋白酶3/7活性)或凋亡(例如使用tunel测定法)的测定法是本领域公知的。另外,此类复合物的生物学活性可通过评估它们对多种淋巴细胞子集诸如nk细胞,nkt细胞或γδt细胞的存活,增殖和淋巴因子分泌的影响或评估它们调控抗原呈递细胞诸如树突细胞,单核细胞/巨噬细胞或b细胞的表型和功能的能力来评估。药用组合物,配制剂和施用路径在又一个方面,本发明提供药用组合物,其包含本文中提供的任何含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,例如供任何下述治疗方法中使用。在一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的任何含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的任何含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和至少一种例如如下文描述的另外的治疗剂。本发明的药用组合物包含溶解或分散在药学可接受赋形剂中的治疗有效量的一种或多种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。短语“药用或药学可接受”指在采用的剂量和浓度一般对接受者无毒,即在适当施用于动物,诸如例如人时不产生不利的,变应性的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。含有至少一种含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和任选地另外的活性组分的药用组合物的制备会是本领域技术人员根据本公开内容知道的,如由remington'spharmaceuticalsciences,18thed.mackprintingcompany,1990例示的,通过援引收入本文。特别地,组合物是冻干配制剂或水溶液。如本文中使用的,“药学可接受赋形剂”包括任何和所有溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗细菌剂,抗真菌剂),等张剂,盐,稳定剂和其组合,正如本领域普通技术人员会知道的。胃肠外组合物包括那些为通过注射,例如皮下,皮内,损害内,静脉内,动脉内,肌肉内,鞘内或腹膜内注射的施用而设计的。对于注射,可以在水溶液中,优选在生理学相容缓冲液诸如汉克斯(hanks)氏溶液,林格(ringer)氏溶液,或生理盐水缓冲液中配制本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。溶液可含有配制用剂,诸如悬浮,稳定和/或分散剂。或者,融合蛋白可处于粉末形式,供在使用前用合适的媒介,例如无菌无热原水建构。根据需要,通过与下文列举的多种其它组分一起以要求的量在适宜的溶剂中掺入本发明的融合蛋白来制备无菌可注射溶液。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。一般地,通过将多种经过灭菌的活性组分掺入含有基础分散介质和/或其它组分的无菌媒介中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,其自其先前无菌过滤的液体介质产生活性组分加任何另外的想要的组分的粉末。液体介质在必要时应当适当缓冲且在注射前首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂变成等张。组合物在制造和贮存条件下必须是稳定的,而且针对微生物,诸如细菌和真菌的污染作用防腐。会领会的是,内毒素污染应当最低限度保持在安全水平,例如小于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受赋形剂包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如edta；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,诸如聚乙二醇(peg)。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的粘度的化合物,诸如羧甲基纤维素钠,山梨醇,右旋糖酐,等等。任选地,悬浮液还可含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以容许制备高度浓缩溶液的药剂。另外,活性化合物的悬浮液可制备为适宜的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油诸如芝麻油,或合成脂肪酸酯,诸如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。可以将活性组分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶体药物投递系统(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术在remington'spharmaceuticalsciences(18thed.mackprintingcompany,1990)中公开。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,所述基质处于成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,诸如例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可带来延长的可注射组合物的吸收。本文中的例示性药学可接受赋形剂进一步包括间质药物分散剂,诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp),例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白,诸如rhuph20(baxterinternational,inc.)。某些例示性shasegp和使用方法(包括rhuph20)在美国专利公开文本no.2005/0260186和2006/0104968中描述。在一个方面,将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。例示性冻干抗体配制剂在美国专利no.6,267,958中描述。水性抗体配制剂包括美国专利no.6,171,586和wo2006/044908中描述的那些,后者的配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。在先前描述的组合物以外,融合蛋白还可配制成贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。如此,例如,融合蛋白可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂,或作为微溶衍生物,例如作为微溶盐配制。包含本发明的融合蛋白的药用组合物可依靠常规混合,溶解,乳化,封装,包埋或冻干工艺来制造。可以使用推动将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学可接受载剂,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药用组合物。适当的配制剂取决于所选择的施用路径。可以以游离酸或碱,中性或盐形式将含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子配制成组合物。药学可接受盐是实质性保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐,例如那些与蛋白质性质组合物的游离氨基形成的或那些与无机酸诸如例如盐酸或磷酸,或有机酸诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如例如氢氧化钠,钾,铵,钙或铁；或有机碱,诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比,药用盐趋于在水性和其它质子溶剂中溶解度更高。在所治疗的特定适应症需要时,本文中的组合物还可含有超过一种活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。此类活性组分以对于预定目的有效的量适当地组合存在。在一个方面,该药学组合物可包含任何本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和至少一种另外的治疗剂。在一个方面,该药学组合物可包含任何本文中提供的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和t细胞活化性抗cd3双特异性抗体,特别是抗her2/抗cd3抗体。在一个方面,该抗her2/抗cd3抗体包含结合cd3的第一抗原结合域和结合her2的第二抗原结合域。在一个特定方面,该结合her2的第二结合域结合her2上与该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子不同的表位。在一个方面,如本文中使用的抗her2/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:91的cdr-h1序列,seqidno:92的cdr-h2序列,和seqidno:93的cdr-h3序列的重链可变区(vhcd3)；和/或包含seqidno:94的cdr-l1序列,seqidno:95的cdr-l2序列,和seqidno:96的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcd3)。更加特别地,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含包含与seqidno:97的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhcd3)和/或与seqidno:98的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlcd3)的第一抗原结合域。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含包含seqidno:97的氨基酸序列的重链可变区(vhcd3)和/或包含seqidno:98的氨基酸序列的轻链可变区(vlcd3)。在一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含结合与抗体4d5(其人源化型式称作曲妥珠单抗)相同的表位的第二抗原结合域。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含结合与抗体2c4(其人源化型式称作帕妥珠单抗)相同的表位的第二抗原结合域。在还有另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含结合与抗体7c2(美国专利no.9,518,118)相同的表位的第二抗原结合域。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含第二抗原结合域,其包含(a)包含seqidno:21的cdr-h1序列,seqidno:22的cdr-h2序列,和seqidno:23的cdr-h3序列的重链可变区(vhher2),和/或包含seqidno:24的cdr-l1序列,seqidno:25的cdr-l2序列,和seqidno:26的cdr-l3序列的轻链可变区(vlher2),或(b)包含seqidno:13的cdr-h1序列,seqidno:14的cdr-h2序列,和seqidno:15的cdr-h3序列的重链可变区(vhher2),和/或包含seqidno:16的cdr-l1序列,seqidno:17的cdr-l2序列,和seqidno:18的cdr-l3序列的轻链可变区(vlher2),或(c)包含seqidno:99的cdr-h1序列,seqidno:100的cdr-h2序列,和seqidno:101的cdr-h3序列的重链可变区(vhher2),和/或包含seqidno:102的cdr-l1序列,seqidno:103的cdr-l2序列,和seqidno:104的cdr-l3序列的轻链可变区(vlher2)。在一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhher2)和/或与seqidno:28的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlher2)。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:27的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:28的氨基酸序列的轻链可变区(vlher2)。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhher2)和/或与seqidno:20的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlher2)。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:19的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:20的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:105的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhher2)和/或与seqidno:106的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlher2)。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:105的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:106的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含包含包含seqidno:97的氨基酸序列的重链可变区(vhcd3)和/或包含seqidno:98的氨基酸序列的轻链可变区(vlcd3)的第一抗原结合域和包含包含seqidno:27的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:28的氨基酸序列的轻链可变区(vlher2)的第二抗原结合域。要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。治疗方法和组合物本文中提供的任何含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子均可在治疗方法中使用。为了在治疗方法中使用,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子可以以符合优秀医学实践的方式配制,定剂量和施用。在这种背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂的投递部位,施用方法,施用进度表,和医学从业人员知道的其它因素。在一个方面,提供供作为药物使用的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在别的方面,提供供在治疗疾病中使用,特别是供在治疗癌症中使用的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在某些方面,提供供在治疗方法中使用的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在一个方面,本发明提供供在有所需要的个体中治疗疾病中使用的如本文中描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在某些方面,本发明提供供在治疗具有疾病的个体的方法中使用的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,该方法包含对该个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面,要治疗的疾病是her2阳性癌症。her2阳性癌症的例子包括乳腺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,唾液腺癌,子宫内膜癌,胰腺癌和非小细胞肺癌(nsclc)。在一个方面,该her2阳性癌症是her2+阳性乳腺癌,例如早期或局部晚期her2+阳性乳腺癌。如此,提供供在治疗这些癌症中使用的如本文中描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。需要治疗的受试者,患者,或“个体”典型地是哺乳动物,更具体地是人。在另一个方面,提供的是供在治疗感染性疾病,特别是供治疗病毒感染中使用的如本文中描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在又一个方面,提供供治疗自身免疫疾病,诸如例如狼疮疾病中使用的如本文中描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在又一个方面,本发明涉及含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于在有所需要的个体中治疗疾病的药物中的用途。在一个方面,该药物供在治疗疾病的方法中使用,该方法包含对具有该疾病的个体施用治疗有效量的该药物。在某些实施方案中,要治疗的疾病是增殖性病症,特别是癌症。如此,在一个方面,本发明涉及本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症,特别是her2阳性癌症的药物中的用途。her2阳性癌症的例子包括乳腺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,唾液腺癌,子宫内膜癌,胰腺癌和非小细胞肺癌(nsclc)。在某个方面,要治疗的癌症是her2阳性乳腺癌,特别是her2阳性转移性乳腺癌。技术人员可认识到在一些情况中含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子可能不提供治愈但可能仅提供部分益处。在一些方面,具有一些益处的生理变化也认为是治疗上有益的。如此,在一些方面,提供生理变化的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的量认为是“有效量”或“治疗有效量”。在又一个方面,本发明提供一种用于在个体中治疗疾病的方法,该方法包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。在一个方面,对所述个体施用包含处于药学可接受形式的本发明的融合蛋白的组合物。在某些方面,要治疗的疾病是增殖性病症。在一个特定方面,该疾病是癌症。在某些方面,该方法进一步包含对该个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂,如果要治疗的疾病是癌症的话。依照任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选人。为了预防或治疗疾病,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的适宜剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)会取决于要治疗的疾病的类型,施用路径,患者的体重,抗原结合分子的类型,疾病的严重程度和过程,施用融合蛋白是出于预防还是治疗目的,先前或并行的治疗性干预,患者的临床史和对融合蛋白的响应,和主治医师的斟酌。在任何情况下,负责施用的从业人员会决定组合物中活性组分的浓度和对于受试者个体适宜的剂量。本文中涵盖各种剂量给药进度表,包括但不限于在多个时间点上的多次或单次施用,推注施用,和脉冲输注。以一次或以一系列治疗适当地将含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子可以是用于对患者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开的施用,还是通过连续输注。取决于上面提到的因素,一种典型的日剂量可能范围为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长的反复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至发生想要的疾病症状的遏制。融合蛋白的一种例示性剂量会在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围中。在其它例子中,剂量还可以包含每次施用自约1μg/kg体重,约5μg/kg体重,约10μg/kg体重,约50μg/kg体重,约100μg/kg体重,约200μg/kg体重,约350μg/kg体重,约500μg/kg体重,约1mg/kg体重,约5mg/kg体重,约10mg/kg体重,约50mg/kg体重,约100mg/kg体重,约200mg/kg体重,约350mg/kg体重,约500mg/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,和其中可派生的任何范围。在自本文中列出的数字可派生的范围的例子中,基于上文描述的数字,可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重,约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等范围。如此,可以将约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一或多剂施用于患者。此类剂量可以间歇施用,例如每周或每三周(例如,使得患者接受约2剂至约20剂,或例如约6剂融合蛋白)。可以施用一个初始的较高加载剂量,接着是一个或多个较低剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定法来监测。本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子一般会以有效实现预定目的的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途,以治疗有效量施用或应用本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子或其药用组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内,尤其是根据本文中提供的详细公开内容。对于系统施用,可以首先自体外测定法,诸如细胞培养物测定法估算治疗有效剂量。然后可以在动物模型中确定实现包括如在细胞培养物中确定的ic50的循环浓度范围的剂量。此类信息可以用于更精确地确定在人中有用的剂量。也可以使用本领域公知的技术自体内数据(例如动物模型)估算初始剂量。本领域普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。可以个别地调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量范围为约0.1至50mg/kg/天,典型地是约0.5至1mg/kg/天。治疗有效血浆水平可以通过每天施用多剂来实现。血浆中的水平可以例如通过hplc来测量。在局部施用或选择性摄取的情况中,含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够优化治疗有效局部剂量而无需过度实验。本文中描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的治疗有效剂量一般会提供治疗益处而不引起实质性毒性。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来确定。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定ld50(对群体的50％致死的剂量)和ed50(在群体的50％中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数,它可以表述为比率ld50/ed50。展现较大治疗指数的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中,依照本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子展现高治疗指数。自细胞培养物测定法和动物研究获得的数据可以在配制适合于在人中使用的剂量范围中使用。剂量优选在具有很小或没有毒性的包括ed50的循环浓度范围内。剂量可以在这个范围内取决于多种因素而变化,例如所采用的剂型,所利用的施用路径,受试者的状况,等等。考虑到患者的状况,确切的配制剂,施用路径和剂量可以由医师个体选择(参见例如fingletal.,1975,in:thepharmacologicalbasisoftherapeutics,ch.1,p.1,通过援引完整收入本文)。用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治医师会知道如何和何时由于毒性,器官功能障碍,等等而终止,中断,或调整施用。相反,如果临床反应不足(排除毒性),主治医师也会知道将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中施用的剂量的大小会随着要治疗的状况的严重程度,施用路径,等等而变化。状况的严重程度可以例如部分地通过标准预后评估方法来评估。而且,剂量和可能剂量频率也会依照患者个体的年龄,体重,和响应而变化。其它药剂和治疗本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子可以在疗法中与一种或多种其它药剂组合施用。例如,本发明的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖可以为了在需要此类治疗的个体中治疗症状或疾病而施用的任何药剂。此类另外的治疗剂可包含任何适合于所治疗的特定适应症的活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。在某些实施方案中,另外的治疗剂是另一种抗癌剂。此类其它药剂以对于预定目的有效的量适当地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于所使用的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子一般以与本文中所述相同的剂量和施用路径,或本文中描述的剂量的约1至99％,或以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。上述提到的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一组合物或分开的组合物中)和分开施用,在该情况中,本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子的施用可以在另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前,同时,和/或之后发生。如此,在一个方面,提供了如本文中描述的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子,供在治疗癌症,特别是her2阳性癌症中使用,其中该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子与t细胞活化性抗cd3双特异性抗体,特别是抗her2/抗cd3双特异性抗体组合使用。在一个方面,该抗her2/抗cd3抗体包含结合cd3的第一抗原结合域和结合her2的第二抗原结合域。在一个特定方面,该结合her2的第二结合域结合her2上与该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子不同的表位。在一个方面,如本文中使用的抗her2/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:91的cdr-h1序列,seqidno:92的cdr-h2序列,和seqidno:93的cdr-h3序列的重链可变区(vhcd3)；和/或包含seqidno:94的cdr-l1序列,seqidno:95的cdr-l2序列,和seqidno:96的cdr-l3序列的轻链可变区(vlcd3)。更加特别地,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含与seqidno:97的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhcd3)和/或与seqidno:98的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlcd3)。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含包含seqidno:97的氨基酸序列的重链可变区(vhcd3)和/或包含seqidno:98的氨基酸序列的轻链可变区(vlcd3)。在一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含结合与抗体4d5(其人源化型式称作曲妥珠单抗)相同的表位的第二抗原结合域。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含结合与抗体2c4(其人源化型式称作帕妥珠单抗)相同的表位的第二抗原结合域。在还有另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含结合与抗体7c2(美国专利no.9,518,118)相同的表位的第二抗原结合域。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含第二抗原结合域,其包含(a)包含seqidno:21的cdr-h1序列,seqidno:22的cdr-h2序列,和seqidno:23的cdr-h3序列的重链可变区(vhher2),和/或包含seqidno:24的cdr-l1序列,seqidno:25的cdr-l2序列,和seqidno:26的cdr-l3序列的轻链可变区(vlher2),或(b)包含seqidno:13的cdr-h1序列,seqidno:14的cdr-h2序列,和seqidno:15的cdr-h3序列的重链可变区(vhher2),和/或包含seqidno:16的cdr-l1序列,seqidno:17的cdr-l2序列,和seqidno:18的cdr-l3序列的轻链可变区(vlher2),或(c)包含seqidno:99的cdr-h1序列,seqidno:100的cdr-h2序列,和seqidno:101的cdr-h3序列的重链可变区(vhher2),和/或包含seqidno:102的cdr-l1序列,seqidno:103的cdr-l2序列,和seqidno:104的cdr-l3序列的轻链可变区(vlher2)。在一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:27的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhher2)和/或与seqidno:28的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlher2)。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:27的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:28的氨基酸序列的轻链可变区(vlher2)。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:19的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhher2)和/或与seqidno:20的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlher2)。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:19的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:20的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在另一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含与seqidno:105的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的重链可变区(vhher2)和/或与seqidno:106的氨基酸序列至少90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的轻链可变区(vlher2)。在又一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性包含第二抗原结合域,其包含包含seqidno:105的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:106的氨基酸序列的轻链可变区(vlcea)。在一个方面,该抗her2/抗cd3双特异性抗体包含第一抗原结合域,其包含包含seqidno:97的氨基酸序列的重链可变区(vhcd3)和/或包含seqidno:98的氨基酸序列的轻链可变区(vlcd3),和第二抗原结合域,其包含包含seqidno:27的氨基酸序列的重链可变区(vhher2)和/或包含seqidno:28的氨基酸序列的轻链可变区(vlher2)。在又一个方面,该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子与t细胞活化性抗cd3双特异性抗体组合使用且该t细胞活化性抗cd3双特异性抗体与该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子并行,在该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子之前,或在该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子之后施用。在又一个方面,提供的是该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子用于制造用于治疗癌症的药物的用途,其中该含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子与t细胞活化性抗cd3双特异性抗体,特别是抗her2/抗cd3双特异性抗体组合使用。在某些方面,要治疗的疾病是her2阳性癌症。her2阳性癌症的例子包括乳腺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,唾液腺癌,子宫内膜癌,胰腺癌和非小细胞肺癌(nsclc)。在某些方面,要治疗的癌症是her2阳性乳腺癌,特别是her2阳性转移性乳腺癌。在又一个方面,本发明提供一种用于在个体中治疗癌症的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子和有效量的t细胞活化性抗cd3双特异性抗体,特别是如上文限定的抗her2/抗cd3双特异性抗体。在某些方面,该方法用于her2阳性癌症。her2阳性癌症的例子包括乳腺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,唾液腺癌,子宫内膜癌,胰腺癌和非小细胞肺癌(nsclc)。在一个方面,该方法用于治疗her2阳性转移性乳腺癌。制品在本发明的另一个方面,提供一种制品,其含有对于治疗,预防和/或诊断上文描述的病症有用的材料。制品包含容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,iv溶液袋,等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有本身或与另一种组合物组合有效治疗,预防和/或诊断状况的组合物且可具有无菌存取口(例如,容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子。标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的状况。此外,制品可包含(a)其中装有组合物的第一容器,其中该组合物包含本发明的含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子；和(b)其中装有组合物的第二容器,其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面的治疗剂。本发明的这个实施方案中的制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定状况的包装插页。或者/另外,制品可进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲剂,诸如抑菌性注射用水(bwfi),磷酸盐缓冲盐水,林格(ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针,和注射器。表b(序列)关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在kabat,e.a.,etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中给出。抗体链的氨基酸依照如上文定义的依照kabat的eu编号系统(kabat,e.a.,etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))进行编号和提及。实施例下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践多种其它实施方案。重组dna技术使用标准方法来操作dna,如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在kabat,e.a.etal.,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthed.,nihpublicationno91-3242中给出。dna测序通过双链测序测定dna序列。基因合成想要的基因区段或是使用适宜的模板通过pcr来生成或是由geneartag(regensburg,germany)自合成的寡核苷酸和pcr产物通过自动化基因合成来合成。在确切的基因序列不可得的情况中,基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物,并通过rt-pcr自源自适宜组织的rna分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准克隆/测序载体。自转化细菌纯化质粒dna并通过uv光谱术测定浓度。通过dna测序确认亚克隆基因片段的dna序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应的表达载体。所有构建物均设计成具有编码在真核细胞中将蛋白质靶向分泌的前导肽的5’端dna序列。细胞培养技术使用标准细胞培养技术,如currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.andyamada,k.m.(eds.),johnwiley&sons,inc.中描述的。蛋白质纯化参考标准方案,自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之,将抗体应用于蛋白asepharose柱(gehealthcare)并用pbs清洗。于ph2.8实现抗体的洗脱,之后立即中和样品。在pbs中或在20mm组氨酸,150mmnacl(ph6.0)中通过大小排阻层析术(superdex200,gehealthcare)将聚集的蛋白质从单体抗体分开。合并单体抗体级分,使用例如milliporeamiconultra(30mwco)离心浓缩机浓缩(在需要时),冷冻并贮存于-20℃或-80℃。提供部分样品用于后续蛋白质分析和分析性表征,例如通过sds-page,大小排阻层析术(sec)或质谱术。sds-page依照制造商的说明书使用预制凝胶系统(invitrogen)。特别地,使用10％或4-12％bis-tris预制凝胶(ph6.4)和mes(还原凝胶,具有抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或mops(非还原凝胶)运行缓冲液。分析性大小排阻层析术通过hplc层析术实施大小排阻层析术(sec),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将经过蛋白a纯化的抗体应用于agilenthplc1100系统上的300mmnacl,50mmkh2po4/k2hpo4,ph7.5中的tosohtskgelg3000sw柱或dionexhplc系统上的2xpbs中的superdex200柱(gehealthcare)。通过uv吸光度和峰面积积分量化洗脱的蛋白质。biorad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品。实施例1her2靶向性4-1bb激动性抗原结合分子的生成和生产1.1her2靶向性含有4-1bb配体三聚体的fc融合抗原结合分子的生成和生产用于靶向三聚体4-1bb配体的her2结合物是帕妥珠单抗(在下文中称作per),曲妥珠单抗(tras)和亲和力成熟的帕妥珠单抗(aff-per),如描述于wo2015/091738。编码对her2特异性的结合物的重和轻链可变区dna序列与穴的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一同框亚克隆。依照uniprot数据库的p41273序列合成编码人4-1bb配体的部分外域(氨基酸71-248)的dna序列。克隆含有通过(g4s)2接头分开的4-1bb配体的两个外域且与人igg1-cl域融合的多肽,如图1a中描绘的:人4-1bb配体,(g4s)2连接头,人4-1bb配体,(g4s)2连接头,人cl。克隆含有4-1bb配体的一个外域且与人igg1-ch域融合的多肽,如图1b中描述的:人4-1bb配体,(g4s)2连接头,人ch。为了改善正确配对,在交叉的ch-cl中引入下述突变。在与人cl融合的二聚体4-1bb配体中引入突变e123r和q124k。在与人ch1融合的单体4-1bb配体中,将突变k147e和k213e克隆入人ch1域,如国际专利申请公开号wo2015/150447中描述的。将编码对her2特异性的结合物(per,tras和aff-per)的重和轻链dna序列的可变区与穴的恒定重链或人igg1的恒定轻链任一同框亚克隆。在fc域中,依照国际专利申请公开号wo2012/130831中描述的方法,在节和穴重链的恒定区中引入p329g,l234a和l235a突变以消除对fc伽马受体的结合。二聚体配体-含有s354c/t366w突变的fc节链,单体ch1融合物,靶向性抗her2-含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的fc穴链和抗her2轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1bb配体和her2结合性fab的异二聚体(图2a)。表1显示含有ch1-cl交换和带电荷残基的单价抗her2(per)分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)融合抗原结合分子的氨基酸序列。该分子称作her2(per)-4-1bbl。表2显示含有ch1-cl交换和带电荷残基的单价抗her2(tras)分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)融合抗原结合分子的氨基酸序列。该分子称作her2(tras)-4-1bbl。表3显示含有ch1-cl交换和带电荷残基的单价her2(aff-per)分拆三聚体4-1bb配体fc(kih)融合抗原结合分子的氨基酸序列。该分子称作her2(aff-per)-4-1bbl表1:含有ch1-cl交换和带电荷残基的her2(per)-4-1bbl的氨基酸序列(*表示带电荷残基)表2:含有ch1-cl交换和带电荷残基的her2(tras)-4-1bbl的氨基酸序列(*表示带电荷残基)表3:含有ch1-cl交换和带电荷残基的her2(aff-per)-4-1bbl的氨基酸序列(*表示带电荷残基)通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性构建物。以1:1:1:1比率(“载体4-1bblfc节链”:“载体4-1bbl轻链”:“载体fc穴链”:“载体轻链”)用相应的表达载体转染细胞。使用hek293ebna细胞在摇瓶中实施生成。对于转染,将细胞离心并用预温热的cdcho培养基替换培养基。在cdcho培养基中混合表达载体,添加pei,将溶液漩涡震荡并于室温温育10分钟。之后,将细胞与dna/pei溶液混合,转移至摇瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育之后,添加有补充物的excell培养基。转染之后一天,添加12％补料。培养7天之后,通过离心来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤,补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v),并保持于4℃。通过使用蛋白a的亲和层析,继以大小排阻层析,自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析,将上清液加载到用20mm磷酸钠,20mm柠檬酸钠,ph7.5平衡的蛋白amabselectsure柱(gehealthcare)上。通过用平衡缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用用20mm柠檬酸钠,100mm氯化钠,100mm甘氨酸,ph3.0创建的分步洗脱来洗脱结合的蛋白质。通过添加1/10(v/v)的0.5m磷酸钠,ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质,之后加载到用20mm组氨酸,140mm氯化钠,ph6.0平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测量280nm处的od来确定经过纯化的构建物的蛋白质浓度。使用labchipgxii(caliper)通过在还原剂存在和缺失下的ce-sds(invitrogenusa)来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4,125mmnacl,200mml-精氨酸一氢氯化物,0.02％(w/v)nan3,ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析双特异性构建物的聚集物含量。表4汇总her2靶向性和非靶向性含有4-1bb配体三聚体的fc(kih)融合抗原结合分子和对照分子的产率和最终单体含量。表4:her2靶向性含有4-1bb配体三聚体的fc(kih)融合抗原结合分子的生化分析分子单体[％](sec)产率[mg/l]ce-sds(非还原)her2(per)4-1-bbl983.589her2(tras)4-1bbl1002.897her2(aff-per)4-1bbl9816.4931.2作为小鼠替代物的her2-靶向性4-1bb激动性抗原结合分子(mu4-1bb-her2)的生成和生产由于mu4-1bbl天然形成二聚体(a.britaetal.,2018)而非如人中的三聚体,因此如图2b中图示的制备具有对小鼠4-1bb的二价结合和对her2的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体,也称作2+1。在这个实施例中,构建物的hc1由下面的构件构成,抗小鼠4-1bb(克隆mu137-1)的vhch1,继以ch2和ch3。hc2由抗her2(克隆2c4,adamscwetal.,cancerimmunolimmunother,55(6),2006,pp.717-727)的vlch1(交叉fab),继以抗小鼠4-1bb(克隆mu137-1)的vhch1和ch2和ch3构成。分别在hc1和hc2中引入促进由gunasekaranetal.,j.biol.chem.2010,19637-19646描述的异二聚化的突变,即e356k和d399k(称作kk)和k392d和k409d(称作dd)。而且,依照例如baudinoetal.,j.immunol.(2008)181,6664-6669或wo2016/030350a1中描述的方法在重链的恒定区中引入dapg突变以消除对小鼠fc伽马受体的结合。简言之,在fc-dd和fc-kk重链的恒定区中引入d265a和p329g突变以消除对fc伽马受体的结合(编号方式依照kabateu索引；即d265a,p329g)。fc-dd与fc-kk链的组合容许生成异二聚体,其包括一个her2结合性fab和两个4-1bb结合性fab。为了改善正确配对,在抗4-1bbfab的ch-cl中引入下面的突变:cl中的e123r和q124k和ch1中的k147e和k213e。2+1抗4-1bb(mu137-1),抗her2(2c4)抗体的氨基酸序列可见于表4a。表4a:2+1抗mu4-1bb抗her2(2c4)抗体dapgddkk(mu4-1bb-her2)的氨基酸序列表4b:2+1抗mu4-1bb抗her2(2c4)抗体的生化分析实施例2her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子的功能表征,通过表面等离振子共振4-1bbfc(kih)融合分子的制备将编码人4-1bb的外域(人4-1bb的氨基酸24至186,依照q07011,seqidno:51)的dna序列与节上的人igg1重链ch2和ch3域同框亚克隆。在抗原外域和人igg1的fc之间引入actev蛋白酶切割位点。在抗原-fc节的c端引入用于定向生物素化的avi标签。含有s354c/t366w突变的抗原-fc节链与含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的fc穴链的组合容许生成异二聚体,其包括含有单拷贝的4-1bb外域的链,从而创建单体形式的fc连接的抗原。表5显示抗原fc融合构建物的氨基酸序列。表5:单体人4-1bbfc(kih)融合分子的氨基酸序列将所有4-1bb-fc融合分子编码序列克隆入质粒载体,其自mpsv启动子驱动插入物表达且含有位于cds3’端的合成polya信号序列。另外,该载体含有用于质粒的附加体维持的ebvorip序列。对于生物素化的单体抗原/fc融合分子的制备,用编码融合蛋白的两种构件(节和穴链)以及生物素化反应所必需的酶bira的三种载体共转染指数式生长的悬浮hek293ebna细胞。以2:1:0.05比率(“抗原ecd-actev-fc节”:“fc穴”:“bira”)使用相应的载体。对于500ml摇瓶中的蛋白质生成,在转染前24小时接种400x106个hek293ebna细胞。对于转染,将细胞以210g离心5分钟,并用预温热的cdcho培养基替换上清液。在含有200μg载体dna的20mlcdcho培养基中重悬浮表达载体。添加540μl聚乙烯亚胺(pei)之后,将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后,将细胞与dna/pei溶液混合,转移至500ml摇瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育之后,添加160mlf17培养基并将细胞培养24小时。转染之后一天,将1mm丙戊酸和7％含有补充物的补料1添加至培养物。培养7天之后,通过以210xg悬降细胞15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v),并保持于4℃。通过使用蛋白a的亲和层析,继以大小排阻层析,自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析,将上清液加载到用40ml20mm磷酸钠,20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml,gehealthcare)上。通过用至少10个柱体积的含有20mm磷酸钠,20mm柠檬酸钠,0.5m氯化钠的缓冲液(ph7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mm柠檬酸钠,0.01％(v/v)吐温20,ph3.0上创建的氯化钠的线性ph梯度(0至500mm)洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mm柠檬酸钠,500mm氯化钠,0.01％(v/v)吐温20,ph3.0清洗。通过添加1/40(v/v)的2mtris,ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质,之后加载到用ph7.4的2mmmops,150mm氯化钠,0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。重组人her2(erbb2蛋白的ecd,seqidno:54的氨基酸23至652,uniprot登录号p04626-1)可商购(例如abcam,目录号ab168896)并用于测定对her2的结合。her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子的同时结合的测定通过表面等离振子共振(spr)评估同时结合人4-1bbfc(kih)和人her2的能力。于25℃在biacoret200上实施所有spr实验,用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4,0.15mnacl,3mmedta,0.005％表面活性剂p20,biacore,freiburg/germany)。将生物素化人4-1bbfc(kih)直接偶联至链霉亲合素(sa)传感器芯片的流动室。使用高至450个共振单位(ru)的固定化水平。使her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合构建物以200nm的浓度范围以30μl/min的流流过流动室达90秒并将解离设置成零秒。以500nm的浓度以30μl/min的流作为第二分析物注射人her2通过流动室达90秒(图3a)。对解离监测120秒。通过减去在参照流动室中获得的响应来修正本体(bulk)折射率差异,那里不固定化蛋白质。正如在图3b和3c的图中能看到的,双特异性构建物能同时结合人4-1bb和人her2。实施例3her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子的功能表征对于功能测定法,我们针对两种先前描述的激动性抗人4-1bb抗体,即抗人4-1bb克隆20h4.9人igg4(描述于专利ep1670828b1和us7659384(b2),具有seqidno:55的重链和seqidno:56的轻链的抗体)和抗人4-1bb克隆mor7480人igg2(描述于专利申请wo2012/032433,具有seqidno:57的重链和seqidno:58的轻链的抗体),和先前描述的融合多肽her2(tras)-抗运载蛋白-4-1bb人igg4(seqidno:59和60的融合多肽,如描述于专利申请wo2016/177802)测试上文描述的单价her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子,即her2(per)-4-1bbl,her2(aff-per)-4-1bbl和her2(tras)-4-1bbl。而且,使用不同对照分子,像非靶向性dp47-4-1bbl(使用一种种系对照,称作dp47,不结合抗原的包含seqidno:37,28,61和62的氨基酸序列且在wo2016/075278a1中描述为对照d的分子来替换抗原结合域),dp47-抗运载蛋白-4-1bb人igg4(与wo2016/17780中描述的分子类似制备的seqidno:63和64的融合多肽),her2(tras)人igg1p329glala(具有seqidno:65的重链和seqidno:48的轻链的抗体),her2(per)人igg1p329glala(具有seqidno:66的重链和seqidno:46的轻链的抗体)和非靶向性dp47人igg1p329glala(具有seqidno:67的重链和seqidno:62的轻链的抗体)。这些igg1抗体包含pro329gly,leu234ala和leu235ala突变以消除对fc伽马受体的结合。3.1对her2表达性肿瘤细胞的结合为了测试对细胞表面表达的her2的结合,使用不同人her2表达性肿瘤细胞:人乳腺癌细胞系sk-br3(atcchtb-30),人乳腺癌细胞系kpl-4(kawasakimedicalschool)和人胃癌细胞系nci-n87(atcccrl-5822)。将0.2x106个在dpbs(gibcobylifetechnologies,目录号14190-326)中重悬浮的肿瘤细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔。将细胞用200μldpbs清洗一次并将团粒重悬浮。添加100μl/孔4℃冷的含有1:5000稀释的可固定存活力染料efluor450(ebioscience,目录号65-0863-18)的dpbs缓冲液并将板于4℃温育30分钟。将细胞用200μl4℃冷的dpbs缓冲液清洗一次并在50μl/孔4℃冷的含有滴定浓度的称作her2(per)-4-1bbl或her2(aff-per)-4-1bbl或her2(tras)-4-1bbl的人分拆4-1bb配体分子以及对照分子,即非靶向性dp47-4-1bbl,或称作抗人4-1bb克隆20h4.9huigg4或抗人4-1bb克隆mor-7480huigg2的抗人4-1bb抗体或融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4或它的非靶向性对照dp47-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4或her2(tras)huigg1p329glala或her2(per)huigg1p329glala或dp47huigg1p329glala的facs缓冲液(供应有2％fbs,5mmedtaph8(amresco,目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrichs2002)的dpbs)中重悬浮。将细胞于4℃温育1小时,之后用冷的facs缓冲液清洗数次以去除未结合的抗体。将细胞用50μl/孔4℃冷的含有5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggf(ab`)2片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch,目录号109116097)的facs缓冲液于4℃进一步染色30分钟。将细胞用200μl4℃facs缓冲液清洗两次并将细胞在50μl/孔含有1％甲醛(sigma,ht501320-9.5l)的dpbs中固定至少10分钟。之后,将细胞在100μl4℃facs缓冲液中重悬浮并使用偶联cytomat(thermofisher)的macsquant分析仪10流式细胞仪(miltenyibiotech)采集。使用flowjoversion10(flowjollc),microsoftexcel和graphpadprismversion6(graphpadsoftwareinc.)分析数据。如图4a至4d中显示的,her2(per)-4-1bbl和her2(aff-per)-4-1bbl显示相似的对由人肿瘤细胞sk-br3或nci-n87表达的人her2的结合,而her2(aff-per)-4-1bbl分子显示略微更高的ec50值,如表6中列出的。与her2(per)-4-1bbl不同,抗体her2(per)huiggp329glala二价而非单价结合。这反映为如图4中显示的略微更低的mfi(更少的抗体/细胞表面,因为该抗体能占据两个而非一个her2分子)和反映如表6中列出的亲合效应的略微更低的ec50值。二价曲妥珠单抗结合融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4反映比二价结合her2(per)huiggp329glala更低的mfi和更高的ec50值(在图4和表6中显示)。这反映与帕妥珠单抗(per)结合物相比曲妥珠单抗(tras)结合物更低的亲和力和亲合力。表6:图4中显示的对her2+肿瘤细胞系的结合曲线的ec50值如图5a和5b中显示的,her2(per)-4-1bbl和her2(aff-per)-4-1bbl显示相似的对由人乳腺癌细胞系kpl-4表达的人her2的结合。her2(tras)-4-1bbl具有比her2(per)-4-1bbl和her2(aff-per)-4-1bbl更低的mfi(图5a)和略微更高的ec50值(表7),反映与帕妥珠单抗(per)相比曲妥珠单抗(tras)更低的亲和力。这仅仅显示单价her2结合性构建物的,因为二价her2结合性her2(tras)huigg1pglala和her2(per)huigg1pglala分子(展示亲合力)结合相似(图5b和表7)。二价her2结合性分子her2(tras)-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4显示比her2(tras)-4-1bbl更低的mfi(图5a)但更低的ec50(表6),这反映两种her2(tras)靶向性分子的亲和力(单价结合)和亲合力(二价结合)之间的差异。表7:图5中显示的对her2+肿瘤细胞系kpl-4的结合曲线的ec50值kpl-4细胞上的ec50[nm]her2(per)-4-1bbl0.23her2(aff-per)-4-1bbl0.35her2(tras)-4-1bbl0.54her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg40.34her2(per)huigg1pglala0.12her2(tras)huigg1pglala0.163.2生物学活性测定法3.2.1表达人4-1bb和nfκb-luc报告盒的jurkat细胞中的nfκb活化自promega(cs196004)定购和接收jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2报告细胞系并在供应有10％fcs(gibcobylifetechnologies,目录号16000-044),2mmglutamax-i(gibcobylifetechnologies,目录号35050-038),1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich,目录号s8636),0.1mmmem非必需氨基酸溶液(sigma-aldrich,目录号m7145),25mmhepes(sigmalifescience,目录号h0887),600μg/mlg-418(roche,目录号04727894001)和400μg/ml潮霉素b(roche,目录号10843555001)的rpmi1640(gibcobylifetechnologies,目录号42401-042)中培养。为了设立活化测定法,将jurkat-hu4-1bb-nfkb-luc2在供应有10％fcs和2mmglutamax-i的rpmi1640(进一步称作测定培养基)中重悬浮并在组织培养处理的平底白色96孔板(huberlab,greinerbio-one,目录号655083)的每个孔中接种100μl中的20`000个细胞或在组织培养处理的平底白色384孔板(corning,目录号3826)的每个孔中接种10μl中的2`000个细胞。之后,添加50μl(96孔板)或10μl(384孔板)测定培养基或her2表达性肿瘤细胞(sk-br3,klp-4或nci-n87,96孔板中的100`000个细胞/孔或384孔板中的10`000个细胞/孔)。最后,添加50μl(96孔板)或10μl(384孔板)含有不同滴定浓度的称作her2(per)-4-1bbl,her2(aff-per)-4-1bbl或her2(tras)-4-1bbl的单价her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子或非靶向性对照dp47-4-1bbl或抗人4-1bb抗体20h4.9huigg4或mor-7480huigg2或融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4或它的非靶向性对照dp47-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4或对照抗体her2(tras)huigg1p329glala或her2(per)huigg1p329glala或dp47huigg1p329glala的测定培养基。将板在细胞培养温箱中于37℃和5％co2温育6小时。为了使用96孔板检测萤光素酶活性,将板用200μl/孔dpbs清洗两次。将40μl新鲜制备的报告裂解缓冲液(promega,目录号:e3971)添加至每个孔并将板于-20℃保存过夜。次日,使冷冻的板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统,promega,目录号e4550)融化至室温。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用tecan微量板读数仪(tecan)测量板,用500ms积分时间,无滤光片,收集所有波长和顶部读数。为了使用384孔板检测萤光素酶活性,对每个孔添加新鲜融化至室温的6μlone-glo萤光素酶(promega,目录号e6110)并尽可能快地使用tecan微量板读数仪(tecan)测量板,用500ms积分时间,无滤光片,收集所有波长和顶部读数。作为光释放单位(url)检测萤光素酶介导的萤光素氧化所致发光。使用microsoftexcel和graphpadprismversion6(graphpadsoftwareinc.)分析数据。在图6中,图示jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2活化测定法的设置。如图7a至7f中显示的,her2(per)-4-1bbl和her2(aff-per)-4-1bbl在her2表达性肿瘤细胞存在下展示相似的活性(图7b和7c),而融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg1显示更低的活性潜力—展示为表8中列出的更小的曲线下面积以及更高的ec50值。所有三种her2靶向性4-1bb激动性分子在her2表达性细胞缺失下并不诱导任何报告细胞系jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2活化(图7a)。只有激动性抗人4-1bb克隆20h4.9huigg4能够诱导jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2活化—不依赖于her2表达性肿瘤细胞的存在或缺失(图7d,7e和7f)。表8:图7中显示的nfκb活化诱导的萤光素酶活性曲线的ec50值在图8a至8d中,比较her2(per)-4-1bbl与her2(tras)-4-1bbl。由于更低的亲和力结合物曲妥珠单抗(tras),her2(tras)-4-1bbl展示比her2(per)-4-1bbl更低的活性(图8b,8c和8d)。这展示为表9中展示的更小的曲线下面积和更高的ec50值。在her2+肿瘤细胞缺失下两种分子均不活化报告细胞系jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2(图8a)。再次,融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg1显示比her2(per)-4-1bbl或her2(tras)-4-1bbl更低的活性,显示为更小的曲线下面积,更低的高台值和更高的ec50(显示于图8b-8d和表9)。与图7中相似,在这项实验中也是只有激动性抗人4-1bb克隆20h4.9huigg4能够诱导jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2活化—不依赖于her2表达性肿瘤细胞的存在或缺失(图8e-8h)。表9:图8中显示的nfκb活化诱导的萤光素酶活性曲线的ec50值3.2.2在her2表达性肿瘤细胞系nci-n87存在下人pbmc的活化测定法对于her2结合介导的交联,使用her2表达性贴壁人胃癌细胞系nci-n87。将nci-n87细胞用dpbs(gibcobylifetechnologies,目录号14190326)清洗并用无酶的,基于pbs的细胞解离缓冲液(gibcobylifetechnologies,目录号13151-014)于37℃处理15分钟。收获细胞并在由供应有10％fcs,2mmglutamax-i,1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich,目录号s8636),1％mem非必需氨基酸溶液(sigma-aldrich,目录号m7145)和50μmβ-巯基乙醇(sigma-aldrich,目录号m3148)的rpmi1640组成的t细胞培养基中重悬浮并用50gy(x射线辐照器rs2000,radsource)辐照。将50μlt细胞培养基中的2x104个nci-n87细胞接种至圆底组织培养96孔板(ttp,目录号92697)的每个孔。添加50μl含有不同滴定浓度的人单价her2靶向性分拆三聚体4-1bb配体fc融合抗原结合分子her2(per)-4-1bbl,her2(aff-per)-4-1bbl或her2(tras)-4-1bbl或非靶向性对照分子dp47-4-1bbl或激动性抗人4-1bb抗体抗人4-1bb克隆20h4.9huigg4或抗人4-1bb克隆mor-7480huigg2或融合蛋白her2(tras)-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4或它的非靶向性对照dp47-抗运载蛋白-4-1bbhuigg4或对照抗体her2(tras)huigg1p329glala,her2(per)huigg1p329glala或dp47huigg1p329glala的t细胞培养基。将自健康供体的血沉棕黄层分离的人pbmc在37℃温热的含有40nmcfda-se(sigma-aldrich,目录号21888-25mg-f)的dpbs中于37℃标记15分钟。通过添加胎牛血清(fbs)来停止cfse标记,将pbmc清洗两次并在t细胞培养基中重悬浮至1.5x106个细胞/ml的终浓度。将50μl此pbmc细胞溶液接种每个孔以添加7.5x104个cfse标记的pbmc每个孔。最后,制备含有8nm激动性抗人cd3人igg1克隆v9的t细胞培养基的储备溶液并将50μl/孔添加至每个孔,给出2nm抗人cd3人igg1克隆v9的终浓度。将板在细胞温箱中于37℃和5％co2温育4天。将细胞用dpbs清洗并用100μl/孔含有1:1000稀释的活/死可固定aqua死细胞染料试剂盒(molecularprobesbylifetechnology,目录号l34957)的dpbs于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗一次并用50μl含有0.1μg/mlpercp-cy5.5缀合的抗人cd137小鼠igg1κ(克隆4b4-1,biolegend,目录号309814),0.1μg/mlpe/cy7缀合的抗人pd-1小鼠igg1κ(克隆eh12.2h7,biolegend,目录号329918),0.03μg/mlapc缀合的抗人cd25小鼠igg1κ(克隆bc96,biolegend,目录号302610),0.06μg/mlapc/cy7缀合的抗人cd8小鼠igg1κ(克隆rpa-t8,biolegend,目录号3301016),bv421缀合的抗人cd4小鼠igg1κ(克隆rpa-t4,biolegend,目录号300532)的facs缓冲液(供应有2％fbs,5mmedtaph8(amresco,目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrichs2002)的dpbs)于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗两次并与50μl/孔新鲜制备的foxp3透化/固定缓冲液(ebioscience,目录号00-5123)一起于4℃温育30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗两次,在50μl/孔新鲜制备的供应有pe缀合的1:250稀释的抗人粒酶b小鼠igg1κ(克隆gb11,批号4269803,bdpharmingen,目录号561142)的透化缓冲液(ebioscience,目录号00-8333)中重悬浮并于4℃温育1小时。将板用200μl/孔dpbs清洗两次并将细胞用含有1％甲醛(sigma,ht501320-9.5l)的dpbs固定15分钟。将细胞在100μl/孔facs缓冲液中重悬浮并使用macsquant分析仪x(miltenyibiotech)采集。使用flowjov10(flowjo,llc),microsoftexcel和graphpadprism6(graphpadsoftware,inc)分析数据。在图9中,图示pbmc活化测定法的设置。如图10a至10f和图11a至11f中显示的,her2(per)-4-1bbl诱导最强的cd8和cd4t细胞活化,通过il-2rα(cd25)的上调(图10a和11a),粒酶b的细胞内升高(图10b和11b)和升高的增殖(图10c和11c)指示。her2(tras)-4-1bbl同样诱导cd8(图10a-10c)和cd4t细胞(图11a-11c)的强活化,然而ec50值更高。融合多肽her2(tras)-抗运载蛋白4-1bbhuigg4介导更少的t细胞活化,主要展示为频率低得多的cd25+,粒酶b高和增殖性cd8(图10a-10c)和cd4t细胞(图11a-11c)。激动性抗人4-1bb克隆20h4.9huigg4抗体再次展示一些活化潜力,然而不如her2靶向性4-1bb激动剂多肽有力(图10d-10f和图11d-11f)。ec50值和超出背景的曲线下面积值在表10和表11中列出。表10:图10和11中显示的cd8和cd4t细胞活化曲线的ec50值表11:图10和11中显示的cd8和cd4t细胞活化曲线的超出背景值的曲线下面积3.2.3在her2表达性肿瘤细胞系kpl-4存在下小鼠脾细胞的活化测定法对于her2结合介导的交联,使用her2表达性贴壁人乳腺癌细胞系kpl-4。将kpl-4细胞用dpbs(gibcobylifetechnologies,目录号14190326)清洗并用无酶的,基于pbs的细胞解离缓冲液(gibcobylifetechnologies,目录号13151-014)于37℃处理15分钟。收获细胞并在由供应有10％fcs,2mmglutamax-i,1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich,目录号s8636),1％mem非必需氨基酸溶液(sigma-aldrich,目录号m7145)和50μmβ-羟基乙醇(sigma-aldrich,目录号m3148)的rpmi1640组成的t细胞培养基中重悬浮并用50gy(x射线辐照器rs2000,radsource)辐照。将50μlt细胞培养基中的2x104个经过辐照的kpl-4细胞接种至圆底组织培养96孔板(ttp,目录号92697)的每个孔。添加50μl含有不同滴定浓度的小鼠替代物mu4-1bb-her2或非靶向性对照mu4-1bbmuigg1dapg的t细胞培养基。自新鲜收集的c57bl/6小鼠的脾分离小鼠脾细胞(octo解离器,miltenyibiotech,遵循制造商的方案)。之后,通过在ack裂解缓冲液(含0.15mnh4cl,10mmkhco3,0.1mmedta的ddh2o,ph7.2)中于室温温育10分钟来裂解红细胞。通过添加t细胞培养基来停止裂解并用dpbs清洗细胞。通过在37℃温热的含有0.5μm细胞踪迹紫色增殖染料(molecularprobesbylifetechnologies,目录号c34557)的dpbs中于37℃温育15分钟来标记小鼠脾细胞。通过添加胎牛血清(fbs)来停止标记,将小鼠脾细胞清洗两次并在t细胞培养基中重悬浮至3x106个细胞/ml的终浓度。将50μl此小鼠脾细胞细胞溶液接种至每个孔以添加15x104个紫色增殖染料标记的小鼠脾细胞每个孔。最后,制备含有2μg/ml激动性抗小鼠cd3ε亚美尼亚仓鼠igg1克隆1452c11(biolegend,目录号100331)的t细胞培养基的储备溶液并将50μl/孔添加至每个孔,给出0.5μg/ml激动性抗小鼠cd3ε亚美尼亚仓鼠igg1克隆1452c11的终浓度。将板在细胞温箱中于37℃和5％co2温育3天。将细胞用dpbs清洗并用100μl/孔含有1:1000稀释的活/死可固定aqua死细胞染料试剂盒(molecularprobesbylifetechnology,目录号l34957)的dpbs于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗一次并用50μl含有0.67μg/ml抗小鼠cd8a-apc-cy7(biolegend,目录号100714,克隆53-6.7,大鼠igg2aκ),0.67μg/ml抗小鼠cd4-apc(biolegend,目录号100412克隆gk1.5,大鼠igg2b,κ),0.67μg/ml抗小鼠cd137-pe(biolegend,目录号106106,克隆17b5,叙利亚仓鼠igg),0.67μg/ml抗小鼠cd25-percp-cy5.5(biolegend,目录号101912,克隆3c7,大鼠igg2b,κ)的facs缓冲液(供应有2％fbs,5mmedta,ph8(amresco,目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrich,s2002)的dpbs)于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗两次并与50μl/孔新鲜制备的foxp3透化/固定缓冲液(ebioscience目录号00-5123)一起于4℃温育30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗两次,在50μl/孔新鲜制备的供应有10μg/ml抗小鼠eomes-alexafluor488(ebioscience,目录号53-4875-82,克隆dan11mag,大鼠igg2a)的透化缓冲液(ebioscience,目录号00-8333)中重悬浮并于4℃温育1小时。将板用200μl/孔dpbs清洗两次并将细胞用含有1％甲醛(sigma,ht501320-9.5l)的dpbs固定15分钟。将细胞在100μl/孔facs缓冲液中重悬浮并使用macsquant分析仪x(miltenyibiotech)采集。使用flowjov10(flowjo,llc),microsoftexcel和graphpadprism6(graphpadsoftware,inc)分析数据。在图12中,图示小鼠脾细胞活化测定法的设置。如图13a至13d中显示的,小鼠替代物mu4-1bb-her2诱导cd8和cd4t细胞活化,通过il-2rα(cd25)的上调(图13a和13c)和升高的增殖(图13b和13d)指示。与之对比,非靶向性激动性mu4-1bbmuigg1dapg并不诱导此类活化。因此,这种协同共刺激效应强烈依赖于her2交联。ec50值和超出背景的曲线下面积值在表12和表13中列出。表12:图13中显示的小鼠cd8和cd4t细胞活化曲线的ec50值表13:图14中显示的小鼠cd8和cd4t细胞活化曲线的曲线下面积实施例4her2(per)-4-1bbl和her2/cd3双特异性抗体的组合的体外测试为了测试her2(per)-4-1bbl和her2/cd3双特异性抗体(her2tdb,junttilaetal.,2014)的组合,我们使用帕妥珠单抗(2c4)衍生的fab生成结合her2的4-1bbl双特异性分子(图2a)。基于曲妥珠单抗的her2/cd3双特异性抗体(her2-tdb)结合her2的域iv(choetal.,2003),而her2(per)-4-1bbl非竞争性结合her2的域ii(franklinetal.,2004)。如wo2015/095392a1所述生成her2tdb。小鼠替代物是具有“节”臂鼠抗her2(hu4d5)和“穴”臂嵌合抗鼠cd3(2c11)的muigg2aher2tdb(leoetal.,procnatlacadsciusa.84:1374-1378,1987)。人外周血单个核细胞(pbmc)和cd8+t细胞分离:使用lymphoprep介质(stemcelltechnologies)自健康志愿者的血液分离人pbmc。使用来自miltenyibiotec的人cd8+分离试剂盒(#130-094-156)通过负选择自pbmc提取cd8+细胞。体外t细胞活化:用于流式细胞术细胞染色的所有抗体来自bdbiosciences(sanjose,ca)。将人cd8+细胞和人乳腺癌细胞系skbr3细胞(以3:1比)在测试项存在下在平底96孔板(bd)中温育24小时。温育后,将细胞转移至新的v底96孔板。将细胞用抗cd8-fitc,抗cd69-pe,和抗cd25-apc染色。通过流式细胞术检测cd8+t细胞上的cd69和cd25表面表达。作为t细胞活化报告cd8+cd69+cd25+的百分比。体外靶细胞杀伤:将效应细胞(人cd8+细胞)和靶细胞(skbr3,以20,000个细胞每孔的密度)以3:1比在测试项存在下在黑色,透明底96孔板中温育48小时。在温育结束时,丢弃细胞上清液并将板用pbs清洗2次。添加100μlcelltiter-glow发光细胞存活力试剂(promega,目录号g7570)并如说明书所述在照度计上对板读数。体外t细胞增殖和存活:通过测量羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(cfse)荧光强度稀释来检测cd8+t细胞增殖应答。简言之,用cfse标记人cd8+t细胞并与skbr3靶细胞和测试项共培养。以100ng/ml使用her2tdb并以1000ng/ml使用4-1bb激动剂。通过流式细胞术对来自第0天(新鲜分离和标记的cd8+),第3天和第7天的细胞的等分试样分析cfse荧光强度。通过第0天,第3天和第7天活cd8+t细胞的数目来测量cd8+t细胞的存活。正如预期的,单一药剂her2(per)-4-1bbl并不在体外诱导t细胞活化或靶细胞杀伤(分别是图14a和14b)。抗her2/cd3-tdb诱导强健的t细胞活化和肿瘤细胞杀伤,但是这没有通过用her2(per)-4-1bbl共治疗得到实质性增强。与之对比,在体外添加her2(per)-4-1bbl实质性增强抗her2/cd3-tdb诱导的t细胞增殖/存活(图15a和15b)。实施例5小鼠替代物her2(2c4)-4-1bb和her2/cd3双特异性抗体的组合的体内抗肿瘤功效在植入有人her2表达性fo5肿瘤同种移植物的免疫胜任的小鼠中测试鼠4-1bb激动剂的抗肿瘤活性(lewisphillipsetal.,2008)。单一药剂her2tdb治疗典型地在这种模型的治疗中导致瞬时响应,完全响应是罕见的,即使以高剂量水平(lietal.,2018)。tdb与mu4-1bbher2共治疗并不导致显著的响应改善,但是用her2tdb和mu4-1bb-her2的组合治疗的7只小鼠中的4只(57％)在研究结束时展现完全响应而没有可检测的肿瘤(图16d)。抗肿瘤功效-fo5肿瘤同种移植物模型:在雌性fvbwt小鼠上刚好挨着第三乳房脂肪垫的皮肤中做一个1cm切口。在2/3号乳房脂肪垫中做一个用于肿瘤的袋并将2x2mmmmtv-her2转基因建立者#5(fo5)肿瘤切片(lewisphillipsetal.,2008)放置入袋。使用伤口夹闭合皮肤。在手术后7-10天取下伤口夹并对小鼠监测可触知肿瘤的出现。当肿瘤体积生长至平均～190mm3时,将它们放置入具有等同肿瘤体积平均大小的治疗队列。将荷瘤小鼠分成每组7只动物的组(n＝7)。一组在第0,7和14天用静脉内0.5mg/kg剂量her2tdb一周两次(qwx2)治疗。另一组用10mg/kg剂量mu4-1-bb-her(2c4)(小鼠替代物)一周两次(qwx2)治疗,第0天静脉内和第7天腹膜内注射；而又一组在第0,7和14天用静脉内0.5mg/kg剂量her2tdb一周两次(qwx2)治疗并用10mg/kg剂量mu4-1-bbher2(2c4)(小鼠替代物)一周两次(qwx2)治疗,第0天静脉内和第7天腹膜内注射。对照组仅用媒介治疗。引用:ascierto,p.a.,e.simeone,m.sznol,y.x.fu,andi.melero(2010),clinicalexperienceswithanti-cd137andanti-pd1therapeuticantibodies.seminoncol37:508-516.aggarwalb.b.(2003),signallingpathwaysofthetnfsuperfamily:adouble-edgedsword.nat.rev.immunol.3(9),745-56.bannerd.etal(1993),crystalstructureofthesolublehuman55kdtnfreceptor-humantnfbetacomplex:implicationsfortnfreceptoractivation.cell73,431-445.bodmerj.,schneiderp.andtschopp,j.(2002),themoleculararchitectureofthetnfsuperfamily.trendsinbiochemicalsciences27(1),19-26.broll,k.,richter,g.,pauly,s.,hofstaedter,f.,andschwarz,h.(2001).cd137expressionintumorvesselwalls.highcorrelationwithmalignanttumors.amjclinpathol115,543-549.buechele,c.,baessler,t.,schmiedel,b.j.,schumacher,c.e.,grosse-hovest,l.,rittig,k.,andsalih,h.r.(2012).4-1bbligandmodulatesdirectandrituximab-inducednk-cellreactivityinchroniclymphocyticleukemia.eurjimmunol42,737-748.chens.,leel.,fishert.,jessenb.,elliottm.,everingw.,logroniok.,tuk.h.,tsaparikosk.,lix.,wangh.,yingc.,xiongm..,vanarsdalet.,and.linj.c.(2015),combinationof4-1bbagonistandpd-1antagonistpromotesantitumoreffector/memorycd8tcellsinapoorlyimmunogenictumormodel.cancerimmunologyresearch3(2),149-160.publishedonline11november2014.cho,h.s.,mason,k.,ramyar,k.x.,stanley,a.m.,gabelli,s.b.,denney,d.w.,jr.,andleahy,d.j.(2003).structureoftheextracellularregionofher2aloneandincomplexwiththeherceptinfab.nature421,756-760choi,b.k.,kim,y.h.,kwon,p.m.,lee,s.c.,kang,s.w.,kim,m.s.,lee,m.j.,andkwon,b.s.(2009).4-1bbfunctionsasasurvivalfactorindendriticcells.jimmunol182,4107-4115.cuadros,c.,dominguez,a.l.,lollini,p.l.,croft,m.,mittler,r.s.,borgstrom,p.,andlustgarten,j.(2005).vaccinationwithdendriticcellspulsedwithapoptotictumorsincombinationwithanti-ox40andanti-4-1bbmonoclonalantibodiesinducestcell-mediatedprotectiveimmunityinher-2/neutransgenicmice.intjcancer116,934-943.curran,m.a.,kim,m.,montalvo,w.,al-shamkhani,a.,andallison,j.p.(2011).combinationctla-4blockadeand4-1bbactivationenhancestumorrejectionbyincreasingt-cellinfiltration,proliferation,andcytokineproduction.plosone6,e19499.diehl,l.,vanmierlo,g.j.,denboer,a.t.,vandervoort,e.,fransen,m.,vanbostelen,l.,krimpenfort,p.,melief,c.j.,mittler,r.,toes,r.e.,andoffringa,r.(2002).invivotriggeringthrough4-1bbenablesth-independentprimingofctlinthepresenceofanintactcd28costimulatorypathway.jimmunol168,3755-3762.dubrot,j.,milheiro,f.,alfaro,c.,palazon,a.,martinez-forero,i.,perez-gracia,j.l.,morales-kastresana,a.,romero-trevejo,j.l.,ochoa,m.c.,hervas-stubbs,s.,etal.(2010).treatmentwithanti-cd137mabscausesintenseaccumulationsoflivertcellswithoutselectiveantitumorimmunotherapeuticeffectsinthisorgan.cancerimmunolimmunother59,1223-1233.franklin,m.c.,carey,k.d.,vajdos,f.f.,leahy,d.j.,devos,a.m.,andsliwkowski,m.x.(2004).insightsintoerbbsignalingfromthestructureoftheerbb2-pertuzumabcomplex.cancercell5,317-328.futagawa,t.,akiba,h.,kodama,t.,takeda,k.,hosoda,y.,yagita,h.,andokumura,k.(2002).expressionandfunctionof4-1bband4-1bbligandonmurinedendriticcells.intimmunol14,275-286.guo,z.,cheng,d.,xia,z.,luan,m.,wu,l.,wang,g.,andzhang,s.(2013).combinedtim-3blockadeandcd137activationaffordsthelong-termprotectioninamurinemodelofovariancancer.jtranslmed11,215.heinisch,i.v.,daigle,i.,knopfli,b.,andsimon,h.u.(2000).cd137activationabrogatesgranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor-mediatedanti-apoptosisinneutrophils.eurjimmunol30,3441-3446.hornig,n.,kermer,v.,frey,k.,diebolder,p.,kontermann,r.e.,mueller,d.(2012),combinationofabispecificantibodyandcostimulatoryantibody-ligandfusionproteinsfortargetedcancerimmunotherapy.j.immunother.35,418-429.ju,s.a.,cheon,s.h.,park,s.m.,tam,n.q.,kim,y.m.,an,w.g.,andkim,b.s.(2008).eradicationofestablishedrenalcellcarcinomabyacombinationof5-fluorouracilandanti-4-1bbmonoclonalantibodyinmice.intjcancer122,2784-2790.junttila,t.t.,li,j.,johnston,j.,hristopoulos,m.,clark,r.,ellerman,d.,wang,b.e.,li,y.,mathieu,m.,li,g.,etal.(2014).antitumorefficacyofabispecificantibodythattargetsher2andactivatestcells.cancerres74,5561-5571.kienzle,g.,andvonkempis,j.(2000).cd137(ila/4-1bb),expressedbyprimaryhumanmonocytes,inducesmonocyteactivationandapoptosisofblymphocytes.intimmunol12,73-82.kim,d.h.,chang,w.s.,lee,y.s.,lee,k.a.,kim,y.k.,kwon,b.s.,andkang,c.y.(2008).4-1bbengagementcostimulatesnktcellactivationandexacerbatesnktcellligand-inducedairwayhyperresponsivenessandinflammation.jimmunol180,2062-2068.kim,y.h.,choi,b.k.,oh,h.s.,kang,w.j.,mittler,r.s.,andkwon,b.s.(2009).mechanismsinvolvedinsynergisticanticancereffectsofanti-4-1bbandcyclophosphamidetherapy.molcancerther8,469-478.kwon,b.s.,andweissman,s.m.(1989).cdnasequencesoftwoinduciblet-cellgenes.procnatlacadsciusa86,1963-1967.lee,h.,park,h.j.,sohn,h.j.,kim,j.m.,andkim,s.j.(2011).combinatorialtherapyforlivermetastaticcoloncancer:dendriticcellvaccineandlow-doseagonisticanti-4-1bbantibodyco-stimulatorysignal.jsurgres169,e43-50.levitsky,v.,decampos-lima,p.o.,frisan,t.,andmasucci,m.g.(1998).theclonalcompositionof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