抗体的制作方法

发明领域本发明涉及结合5t4的抗体，包括结合5t4和cd3的双特异性抗体。本发明进一步提供了包含抗体的药物组合物，以及该抗体在治疗和诊断程序中，特别地在癌症疗法中的用途。发明背景5t4(也称为滋养层糖蛋白[tpbg]或wnt激活的抑制因子1[waif1])是一种72kda单程跨膜蛋白，其含有8个富亮氨酸重复序列(lrr)和7个潜在的n-糖基化位点(zhaoetal.,2014structure22,612-620)。除胎盘外，5t4表达在正常成人组织中受到限制(southalletal.,1990brjcancer61,89-95)。5t4在许多人类癌症中得到表达，包括肾癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌(sternandharrop,2017cancerimmunolimmunother66,415-426；southalletal.,1990brjcancer61,89-95)。肿瘤细胞中5t4的表达通过1)促进上皮向间质转化(damelinetal.,2011cancerres71,4236-4246；carsbergetal.,1996intjcancer68,84-92)，和2)抑制经典wnt/beta-连环蛋白信号传导途径和激活非经典wnt途径(kagermeier-schenketal.,2011devcell21,1129-1143)来驱动肿瘤发展。5t4靶向抗体和5t4靶向疗法在几种已知表达5t4的癌症(包括结肠直肠癌、肺癌和肾癌)中具有临床活性。例如，naptumomabestafenatox是一种重组融合蛋白，其由与工程化超抗原变体sea/e-120遗传融合的5t4-fab部分组成。目前，它正在作为非小细胞肺癌(nsclc)、肾细胞(rcc)和胰腺癌的免疫疗法的临床试验中(参见例如eisen,etal.,2014curroncolrep16,370)。此外，是表达5t4构建体(mva-5t4)的修饰痘苗ankara，其在结肠直肠癌、前列腺癌和肾癌中显示临床益处(参见例如sternandharrop,2017cancerimmunolimmunother66,415-426；scurretal.,2017jamaoncol12,10)。wo2007106744、wo03038098、wo2011048369、wo2013041687、wo2017072207中描述了其他抗5t4抗体。尽管在根除癌症方面已取得重大进展，但仍需要进一步改善基于抗体的癌症疗法。发明概述本发明的目的是提供抗体，其包含至少一个能够结合5t4(滋养层糖蛋白)的抗原结合区，其中所述抗体能够阻断包含重链可变(vh)区和轻链可变(vl)区的抗体[059]与5t4的结合，所述重链可变(vh)区包含以seqidno:5所示的序列，所述轻链可变(vl)区包含以seqidno:9所示的序列。抗体可以特别地是双特异性抗体，并且可以进一步包括结合cd3，如人cd3ε(epsilon)，如seqidno:4中规定的人cd3ε(epsilon)的抗体的抗原结合区。在另一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含a)核酸序列，其编码包含能够如本文定义的结合5t4的抗原结合区的抗体的重链序列，和/或b)核酸序列，其编码包含能够如本文定义的结合5t4的抗原结合区的抗体的轻链序列。在另一方面，本发明涉及表达载体，其包含a)核酸序列，其编码包含能够如本文定义的结合5t4的抗原结合区的抗体的重链序列，和/或b)核酸序列，其编码包含能够如本文定义的结合5t4的抗原结合区的抗体的轻链序列。在另一方面，本发明涉及包含如本文定义的核酸构建体或表达载体的细胞。在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的抗体的组合物。在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含如本文定义的抗体和药学上可接受的载体。在另一方面，本发明涉及如本文所定义的抗体，其用作药物，如用于治疗疾病。在另一方面，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用如本文定义的抗体、组合物或药物组合物。在另一方面，本发明涉及用于产生如本文定义的抗体的方法。在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含如本文所定义的抗体；以及该试剂盒的使用说明。在另一方面，本发明涉及抗独特型抗体，其结合如本文定义的抗体的能够结合5t4的抗原结合区。附图简述图1：与igg1-5t4-a3-f405l组合使用的igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-207-fearandigg1-5t4-226-fear的抗体置换。通过在octethtx仪器(fortebio)上的生物层干扰测量法(biolayerinterferometry)测定抗体置换(displacement)。将igg1-5t4-a3-f405l固定化在生物传感器上，并装载人5t4ecdhis(seqidno.99的成熟蛋白)。随后，将加载的生物传感器暴露于igg1-5t4-a3-f405l,igg1-5t4-h8-fear,igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-207-fear或igg1-5t4-226-fear。该图显示了暴露于第二抗体后的缔合响应(500s)。a-c。igg1-5t4-a3-f405l显示没有与固定化的igg1-5t4-a3-f405l-5t4ecdhis复合物的结合，指示与igg1-5t4-a3-f405l交叉阻断(自我阻断)。igg1-5t4-h8-fear抗体显示质量增加(指示与固定化的igg1-5t4-a3-f405l-5t4ecdhis复合物的结合)，因此没有与igg1-5t4-a3-f405l交叉阻断。a.igg1-5t4-059-fear,b.igg1-5t4-207-fear和c.igg1-5t4-226-fear都显示质量的初始增加(指示抗体与固定化的igg1-5t4-a3-f405l-5t4ecdhis复合物的结合)，随后质量迅速下降。抗体的这种行为指示抗体置换(abdicheyn,etal.(2017)antibodiestargetingcloselyadjacentorminimallyoverlappingepitopescandisplaceoneanother.plosone12(1):e0169535.doi:10.1371/journal.pone.0169535)。图2：用流式细胞仪测量的5t4抗体与膜结合的5t4的同时结合。将5t4抗体igg1-5t4-h8-fear、igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear缀合至异硫氰酸荧光素(fitc)，并在10μg/ml未缀合的igg1-5t4-h8-fear,igg1-5t4-a1-f405l,igg1-5t4-a3-f405l,igg1-b12,igg1-5t4-207-fear或igg1-5t4-226-fear存在下以2μg/ml的浓度添加至表达5t4的sk-ov-3细胞。计算fitc标记的抗体的结合百分比，并描绘为平均百分比结合±标准差(sd)。图3：5t4抗体与用全长人和鸡5t4转染的hek-293细胞的结合。将用全长人5t4(seqidno:1)(a)或鸡5t4(seqidno:3)(b)瞬时转染的hek-293细胞与各种浓度的igg1-5t4-a3-f405l，igg1-5t4-059-fear，igg1-5t4-207-fear或igg1-5t4-226-fear抗体一起温育。与缀合有r-藻红蛋白(pe)的山羊抗人iggf(ab')2温育后，通过流式细胞仪测定平均荧光强度(mfi)。作为阴性对照，包括igg1-b12-k409r(10μg/ml)。图4：单价5t4抗体的内在化能力。通过未缀合的5t4抗体与每个抗体已与一个duostatin-3分子缀合的(hiv-1gp120特异性)igg1-b12抗体的受控的fab臂交换来生成缀合有毒素的双特异性抗体，该抗体用一个fab臂识别5t4，而用第二fab臂识别无关的抗原(hiv-1gp120，其在肿瘤细胞上不表达)。如指示，将mda-mb-468(a)和hcc1954(b)细胞与浓度递增的抗体一起温育。5天后测量细胞存活力。数据表示为三个重复实验的平均活细胞百分比。作为阴性对照，包括与duostatin-3缀合的单特异性二价igg1-b12(igg1-b12-vcduo3)。图5(i)：cd3x5t4双特异性抗体与转染入hek-293细胞中的全长人和食蟹猴(cynomolgusmonkey)5t4的结合。使用用全长人(左图)或食蟹猴5t4(右图)瞬时转染的hek-293细胞分析单价和二价5t4抗体的结合。如指示，将细胞与浓度递增的抗体一起温育。在用缀合有fitc的山羊抗人iggf(ab’)2进行二次标记后，通过流式细胞术分析结合。作为阴性对照抗体，包括igg1-b12-k409r(3μg/ml)。数据表示为两次技术重复的平均荧光强度(mfi)值±sd。a.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的结合。b.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的结合。c.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的结合。d.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-h8-fear和igg1-5t4-h8-fear的结合。图5(ii)：双特异性cd3x5t4抗体与转染入hek-293细胞中的食蟹猴和人5t4的结合。使用用人5t4(左图)或食蟹猴5t4(右图)瞬时转染的hek-293细胞分析5t4抗体的单价和二价结合。如指示，将细胞与浓度递增的抗体一起温育。用缀合有藻红蛋白(pe)的山羊抗人iggf(ab')2进行二次标记后，通过流式细胞术分析结合。a.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的结合；b.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的结合；c.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的结合；d.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear和igg1-5t4-106-fear的结合；e.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-076-fear和igg1-5t4-076-fear的结合；f.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-085-fear和igg1-5t4-085-fear的结合；g.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-127-fear和igg1-5t4-127-fear的结合；h.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和igg1-5t4-a1-fear的结合；i.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear和igg1-5t4-a3-fear的结合。图6(i)：cd3x5t4双特异性和5t4单特异性抗体与5t4阳性人类肿瘤细胞的结合。通过流式细胞术测定5t4抗体与hela细胞(左图)或mda-mb-231细胞(右图)的单价和二价结合。将细胞与浓度递增的抗体一起温育。在用缀合有fitc的山羊抗人iggf(ab')2进行二级标记后，通过流式细胞术测定mfi。a.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear抗体与hela细胞(左图)或mda-mb-231细胞(右图)的结合。b.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear抗体与hela细胞(左图)或mda-mb-231细胞(右图)的结合。c.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear抗体与hela细胞(左图)或mda-mb-231细胞(右图)的结合。包括igg1-b12-k409r(3μg/ml)作为阴性对照(空心圆圈)。图6(ii)：cd3x5t4双特异性和5t4单特异性抗体与hela细胞的结合。通过流式细胞术测定5t4抗体与hela细胞的单价和二价结合。将细胞与浓度递增的抗体一起温育。用缀合有藻红蛋白(pe)的山羊抗人iggf(ab')2进行二次标记后，通过流式细胞仪测定平均荧光强度(mfi)。a.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的结合；b.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的结合；c.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的结合；d.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear和igg1-5t4-106-fear的结合；e.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-085-fear和igg1-5t4-085-fear的结合；f.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-127-fear和igg1-5t4-127-fear的结合；g.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和igg1-5t4-a1-fear的结合；h.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear和igg1-5t4-a3-fear的结合图6(iii)：cd3x5t4双特异性和5t4单特异性抗体与mda-mb-231细胞的结合。通过流式细胞术测定5t4抗体与mda-mb-231细胞的单价和二价结合。将细胞与浓度递增的抗体一起温育。用缀合有pe的山羊抗人iggf(ab′)2进行二次标记后，通过流式细胞术测定平均荧光强度(mfi)。a.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的结合；b.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的结合；c.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的结合；d.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear和igg1-5t4-106-fear的结合；e.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-085-fear和igg1-5t4-085-fear的结合；f.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-127-fear和igg1-5t4-127-fear的结合；g.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和igg1-5t4-a1-fear的结合；h.bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear和igg1-5t4-a3-fear的结合。图7(i)：使用纯化的t细胞作为效应细胞，cd3x5t4双特异性抗体在mda-mb-231细胞中体外诱导细胞毒性。将mda-mb-231细胞与浓度递增的cd3x5t4双特异性抗体或单特异性二价5t4抗体和作为效应细胞的分离的t细胞以效应细胞:靶细胞(e:t)比例8:1一起温育。从两个不同的供体获得的纯化的t细胞用于该实验，供体a(左图)和供体b(右图)。通过在温育72小时后测量活的mda-mb-231细胞的百分比来测定细胞毒性(％活细胞＝[样品吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]/[未处理的靶细胞的吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]x100)。a.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的存在下诱导的细胞毒性；b.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的存在下诱导的细胞毒性；c.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的存在下诱导的细胞毒性。图7(ii)：使用纯化的t细胞作为效应细胞，cd3x5t4双特异性抗体在mda-mb-231细胞中体外诱导的细胞毒性的ic50值。使用graphpadprismv7.02软件分析mda-mb-231细胞中bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear诱导的t细胞介导的细胞毒性的ic50值。数据表示为两个不同供体的平均ic50值±sd。图8(i)：在体外使用t细胞作为效应细胞，cd3x5t4双特异性抗体在mda-mb-231细胞中诱导细胞毒性。以e:t比例8:1将mda-mb-231细胞与浓度递增的cd3x5t4双特异性抗体或5t4同二聚体和作为效应细胞的分离的t细胞一起温育。三种不同供体用于此实验。显示的数据是测试的三个供体的平均存活％±平均值的标准误差(sem)。a.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的存在下诱导的t细胞介导的细胞毒性(存活降低)；b.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的存在下诱导的t细胞介导的细胞毒性；c.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的存在下诱导的t细胞介导的细胞毒性；d.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear和igg1-5t4-106-fear的存在下诱导的t细胞介导的细胞毒性；e.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和igg1-5t4-a1-fear的存在下诱导的t细胞介导的细胞毒性；f.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear和igg1-5t4-a3-fear的存在下诱导的t细胞介导的细胞毒性。图8(ii)：在体外使用t细胞作为效应细胞，由cd3x5t4双特异性抗体在mda-mb-231细胞中诱导的细胞毒性的ic50值。使用graphpadprismv7.02软件分析mda-mb-231细胞中cd3x5t4双特异性抗体诱导的t细胞介导的细胞毒性的ic50值。数据表示为三个不同供体的平均ic50值±sd。a.bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear诱导的t细胞介导的细胞毒性的ic50值；b.由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear诱导的t细胞介导的细胞毒性的ic50值。图9(i)：在mda-mb-231细胞存在下通过cd3x5t4双特异性抗体的体外t细胞活化。将mda-mb-231细胞与浓度递增的cd3x5t4双特异性抗体和单特异性二价5t4抗体(如指示)和作为效应细胞的分离的t细胞以8:1的e:t比例一起温育。通过流式细胞术分析三种t细胞活化标志物(pd1[上图]，cd25[中图]和cd69[下图])的表达。两种不同供体用于此实验，即供体a(实心符号)和供体b(空心符号)。a.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的存在下诱导的t细胞活化；b.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的存在下诱导的t细胞活化；c.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的存在下诱导的t细胞活化。图9(ii)：在mda-mb-231细胞存在下由cd3x5t4双特异性抗体的体外t细胞活化的ec50值。使用graphpadprismv7.02软件分析在mda-mb-231细胞存在下bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear诱导的体外t细胞活化标志物(pd1，cd25和cd69)的ec50值。数据呈现为两个不同供体的平均值±sd。图10(i)：在mda-mb-231细胞存在下由cd3x5t4双特异性抗体的体外t细胞活化。将mda-mb-231细胞与浓度递增的cd3x5t4双特异性抗体和5t4同二聚体和作为效应细胞的分离的t细胞以8:1的e:t比例一起温育。通过cd4+(左图)和cd8+(右图)t细胞群内％cd69+细胞的增加来测量t细胞活化。三个不同供体用于此实验；显示的数据是测试的三个供体的平均％cd69上调±sem。a.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear的存在下诱导的t细胞活化；b.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear的存在下诱导的t细胞活化；c.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear的存在下诱导的t细胞活化；d.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear和igg1-5t4-106-fear的存在下诱导的t细胞活化；e.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和igg1-5t4-a1-fear的存在下诱导的t细胞活化；f.在bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear和igg1-5t4-a3-fear的存在下诱导的t细胞活化。图10(ii)：在mda-mb-231细胞存在下由cd3x5t4双特异性抗体的体外t细胞活化的ec50值。使用graphpadprismv7.02软件分析mda-mb-231细胞的存在下cd3x5t4双特异性抗体在体外诱导的t细胞活化标志物(cd4+和cd8+t细胞群体内的cd69+[a-b],cd25+[c-d]和pd1+[e-f],cd25和cd69细胞％的增加)的ec50值。数据呈现为三个不同供体的平均值±sd。a.由bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear诱导的cd69上调的ec50值；b.由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear诱导的cd69上调的ec50值；c.由bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear诱导的cd25上调的ec50值；d.由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear诱导的cd25上调的ec50值；e.由bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear诱导的pd1上调的ec50值；f.由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear诱导的pd1上调的ec50值。图11：在5t4阳性肿瘤细胞存在下由cd3x5t4双特异性抗体诱导的t细胞细胞因子释放。将mda-mb-231细胞与0.2μg/mlcd3x5t4双特异性抗体(bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear)和5t4单特异性抗体(igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear或igg1-5t4-059-fear)和分离的t细胞作为效应细胞以e:t比例8:1一起温育。通过u-plex测定法分析细胞因子的释放。a.与cd3x5t4双特异性抗体或5t4单特异性抗体温育72小时后，t细胞(源自供体a)肿瘤细胞共培养物的上清液中il-10、il-13和tnf的浓度。b.与cd3x5t4双特异性抗体或5t4单特异性抗体温育72小时后，t细胞(源自供体b)肿瘤细胞共培养物的上清液中il-10、il-13和tnf的浓度。图12：以不同的e:t比例使用pbmc作为效应细胞，由cd3x5t4双特异性抗体在sk-ov-3细胞中体外诱导细胞毒性。将sk-ov-3细胞与浓度递增的bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear(左图)或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(右图)和pbmc作为效应细胞以1:2、1:1、2:1、4:1、8:1和12:1的e:t比例一起温育。通过测量温育72小时后的活sk-ov-3细胞的百分比来测定细胞毒性(％活细胞＝[样品吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]/[未处理的靶细胞的吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]]x100)。来自两个不同供体的pbmc用于此实验：a.供体c和b.供体d。图13：以不同的e:t比例使用t细胞作为效应细胞由cd3x5t4双特异性抗体在sk-ov-3细胞中在体外诱导细胞毒性。将sk-ov-3细胞与浓度递增的bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear(左图)或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(右图)和分离的t细胞作为效应细胞以1:2、1:1、2:1、4:1和8:1的e:t比例一起温育。通过测量温育72小时后的活sk-ov-3细胞的百分比来测定细胞毒性(％活细胞＝[样品吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]/[未处理的靶细胞的吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]]x100)。来自两个不同供体的pbmc用于此实验：a.供体e和b.供体f。图14.在nsg-his小鼠中的mda-mb-231异种移植物模型中，cd3x5t4双特异性抗体的抗肿瘤活性。a.用pbs(媒介物对照)、0.5mg/kgbsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear或0.5mg/kgbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear处理后，nsg-his小鼠中的mda-mb-231异种移植物模型中的平均肿瘤大小。通过测径器测量评估肿瘤大小。误差棒指示sem。b.用pbs、bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear处理后，具有肿瘤大小<500mm3的用mda-mb-231细胞注射的nsg-his小鼠的百分比。图15：直接fitc标记的5t4特异性抗体与在人5t4ecd的32至355位处具有单一丙氨酸突变的人5t4变体的结合，如通过流式细胞术测定的。与用于标准化的非交叉阻断5t4特异性对照抗体(bsigg1-5t4-a1-f405lxb12-fear-fitc)相比，结合表示为z得分(倍数变化)，作为结合变化的量度。x轴上的数字是指人5t4(seqid：1)中的氨基酸位置。结合的z得分低于-1.5(以虚线指示)的残基被视为“结合丧失变体”。在结合中具有正z得分的残基是非交叉阻断5t4特异性对照抗体(bsigg1-5t4-a1-67f-f405lxb12-fear-fitc)的结合丧失残基。不评估在aa位置38,45,49,51,54,62,64,66,68,71,72,77,91,104,108,110,112,118,121,122,135,137,155,161,167,171,201,202,205,208,218,231,269,279,298,300,303,323,324,340和344上的残基，因为这些位置含有内源性丙氨酸或半胱氨酸。显示的数据是(a)bsigg1-b12-fealx5t4-059-fear-fitc,(b)bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear-fitc,(c)bsigg1-b12-fealx5t4-226-fear-fitc和(d)bsigg1-5t4-a3-f405lxb12-fear-fitc结合的z得分。z得分正好低于-1.5且预测与大多数表面暴露的结合丧失残基在空间上分离的掩埋残基被排除在外(对于bigg1-b12-fealx5t4-207-fear-fitc：l281[z得分：-1.57]和p326[z得分：1.54]；对于bsigg1-b12-fealx5t4-226-fear-fitc：l273[z得分：-1.58]，l281[z得分：-1.65]，n294[z得分：-1.57]，l309[z得分：-1.63]和p326[z得分：-1.67])。图16(i)：使用t细胞作为效应细胞，在不同适应症的肿瘤细胞中由cd3x5t4双特异性抗体在体外诱导细胞毒性。将肿瘤细胞与浓度递增的bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear或对照抗体(bsigg1-hucd3-h101g-fealxb12-fear,bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear)和分离的t细胞作为效应细胞以e:t比例4:1一起温育。通过测量温育72小时后活的肿瘤细胞的百分比来测定细胞毒性(存活降低)。显示的数据是来自至少三个测试供体中的一个代表性供体的一式两份孔的平均％存活±sem。a.在胰腺癌细胞系中诱导的细胞毒性(存活降低)；b.在宫颈癌细胞系中诱导的细胞毒性(存活降低)。图16(ii)：使用t细胞作为效应细胞，在不同适应症的肿瘤细胞系中由cd3x5t4双特异性抗体体外诱导的细胞毒性的ic50值。使用graphpadprismv7.02软件分析bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear在指示的适应症的肿瘤细胞中诱导的t细胞介导的细胞毒性的ic50值。数据呈现为至少三个不同供体的平均ic50值(见表10)±sd。图17(i)：在不同适应症的肿瘤细胞的存在下通过cd3x5t4双特异性抗体的体外t细胞活化。将肿瘤细胞与浓度递增的bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear或对照抗体(bsigg1-hucd3-h101g-fealxb12-fear,bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear)和分离的t细胞作为效应细胞以e:t比例4:1一起温育72小时。通过cd4+(左图)和cd8+(右图)t细胞群内cd69(cd69+细胞％)的上调来测量t细胞活化。显示的数据是来自至少三个测试供体中的一个代表性供体的一式两份孔的平均％cd69+细胞±sd。a.在胰腺癌细胞系bxpc-3存在下由cd3x5t4双特异性抗体诱导的t细胞活化；b.在胰腺癌细胞系panc-1存在下由cd3x5t4双特异性抗体诱导的t细胞活化；c.在宫颈癌细胞系siha存在下由cd3x5t4双特异性抗体诱导的t细胞活化；d.在宫颈癌细胞系caski存在下由cd3x5t4双特异性抗体诱导的t细胞活化。图17(ii)：在不同适应症的肿瘤细胞系的存在下由cd3x5t4双特异性抗体的体外t细胞活化的ec50值。使用graphpadprismv7.02软件分析与不同适应症的肿瘤细胞系共培养的bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear诱导的t细胞活化ec50值(cd4+和cd8+t细胞群内cd69+细胞％)。数据呈现为至少三个不同供体的平均ec50值(见表10)±sd。a.在指定的肿瘤细胞系存在下，由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear诱导的cd4+t细胞活化的ec50值；b.在指示肿瘤细胞系存在下由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear诱导的cd8+t细胞活化的ec50值。发明详述定义如本文所用，术语“抗体”(ab)意图指具有在典型的生理条件和/或肿瘤特异性条件下以相当长的时间段的半衰期，例如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更多，约48小时或更多，约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关的功能定义的时段(例如足以诱发，促进，增强和/或调节与抗体与抗原的结合相关的生理应答的时间和/或足以使抗体被内在化的时间)与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物。与抗原相互作用的结合区(或在本文中可以使用的具有相同含义的结合域)包括免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区。抗体(ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的成分(例如c1q)，即补体激活的经典途径中的第一成分。在本发明的上下文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(mab)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任何已知技术如酶促裂解，肽合成和重组技术提供的“抗体片段”或“其片段”，其保留与抗原特异性结合的能力(抗原结合片段)，并保留了与毒素缀合的能力。除非本文的公开内容另外受到限制，否则根据本发明定义的抗体可以具有任何同种型。如上指示，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则如本文中所用的术语抗体包括保留与抗原特异性相互作用，诸如结合的能力的抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。术语“抗体”中涵盖的抗原结合片段的实例包括(i)fab’或fab片段，由轻链可变域(vl)、重链可变域(vh)、轻链恒定区(cl)和重链恒定区域1(ch1)域组成的单价片段或如wo2007/059782中所述的单价抗体；(ii)f(ab’)2片段，包含在铰链区处通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)基本上由vh和ch1域组成的fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的vl和vh域组成的fv片段，(v)基本上由vh域组成，也称为域抗体holtetal；trendsbiotechnol.2003nov；21(11):484-90的dab片段wardetal.,nature341,544-546(1989)；(vi)骆驼科抗体(camelid)或纳米抗体(nanobodies)revetsetal；expertopinbiolther.2005jan；5(1):111-24和(vii)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个域vl和vh由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，所述合成接头使它们能够制备成单一蛋白链，其中vl区和vh区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链fv(scfv)，参见例如revetsetal；expertopinbiolther.2005jan；5(1):111-24和birdetal.,science242,423-426(1988)。除非另有说明或上下文明确指出，否则此类单链抗体涵盖在术语抗体内。尽管此类片段通常包括在抗体的含义内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明的上下文中，这些和其他有用的抗体片段在本文中进一步讨论。可以在不同的体外或离体表达或生产系统中生产抗体并从中收集抗体，例如从重组修饰的宿主细胞，杂交瘤或使用支持体外转录和/或翻译编码该抗体的核酸序列的细胞提取物的系统中。应当理解，多种不同的抗体(所述抗体如在本发明的上下文中定义)是可以通过在如上所述的生成系统中分开生成每种抗体，然后混合抗体，或者通过在相同生产系统中生成几种抗体提供的。如本文所用，术语“免疫球蛋白重链”或“免疫球蛋白的重链”是指免疫球蛋白的重链之一。重链通常由限定免疫球蛋白同种型的重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区(在本文中缩写为ch)组成。重链恒定区通常由三个域ch1、ch2和ch3组成。如本文所用，术语“免疫球蛋白”意指由两对多肽链，一对轻(l)低分子量链和一对重(h)链组成的一类结构相关的糖蛋白，所有四者潜在通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已经得到充分表征(参见例如fundamentalimmunologych.7(paul,w.,ed.,2nded.ravenpress,n.y.(1989))。在免疫球蛋白的结构内，两条重链在所谓的“铰链区”中经由二硫键相互连接。与重链相同，每个轻链通常由几个区域组成：轻链可变区(在本文中简称为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区通常由一个域cl组成。此外，vh和vl区可进一步细分为高变性区(或高变区，其在结构限定的环的序列和/或结构上可以是高变的)，也称为互补决定区(cdr)，散布有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl通常由从氨基端到羧基端以以下次序排列的三个cdr和四个fr组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。cdr序列根据imgt定义(参见lefrancmp.etal.,nucleicacidsresearch,27,209-212,1999]和brochetx.nucl.acidsres.36,w503-508(2008))。当在本文中使用时，术语“半分子”、“fab臂”和“臂”是指一个重链-轻链对。当双特异性抗体被描述为包含“源自”第一抗体的半分子抗体和“源自”第二抗体的半分子抗体时，术语“源自”表示双特异性抗体是通过任何已知方法将来自所述第一抗体和第二抗体中每种的所述半分子重组为所得的双特异性抗体产生的。在此上下文下，“重组”并不意图受到任何特定的重组方法的限制，并且因此包括例如下文所述的产生双特异性抗体的所有方法，包括例如通过半分子交换进行重组以及在核酸水平上的重组和/或通过在同一细胞中两个半分子的共表达的重组。如本文所用，术语“抗原结合区”或“结合区”是指能够结合抗原的抗体区域。抗原可以是任何分子，如多肽，例如存在于细胞、细菌或病毒体上。除非上下文矛盾，否则术语“抗原”和“靶物”可以在本发明的上下文中互换使用。除非上下文矛盾，否则术语“抗原结合区”和“抗原结合位点”在本发明的上下文中可互换使用。术语“阻断结合”或“阻断抗体的结合”或“交叉阻断结合”是指一种抗体与特定抗原的结合阻止第二抗体与相同抗原结合的情况，反之亦然。在没有另一种抗体的情况下，每种抗体具有结合抗原的能力，如通过显著的结合响应测定，而当存在另一种抗体时，抗体之一缺乏结合响应。一种抗体阻断另一种抗体结合的能力可以通过生物层干扰测量法以经典的夹心表位框并测定形式来测定，例如，如本申请中的实施例3和abdiche等人(abdicheyn,malashockds,pinkertona,ponsj.exploringblockingassaysusingoctet,proteon,andbiacorebiosensors.analbiochem.2009；386(2):172-180)所述。简而言之，在夹心表位框并测定法中，对溶液中的抗体测试与其特异性抗原的结合，该特异性抗原首先通过固定化的抗体捕获。在本发明的上下文中，根据下文“置换”的定义，若一种抗体能够“置换”另一种抗体，则它不阻断另一种抗体的结合。除非上下文矛盾，否则术语“阻断结合”和“阻断抗体的结合”以及“交叉阻断结合”在本发明的上下文中可以互换使用。优选地，使用全长抗体测定一种抗体阻断另一种抗体结合的能力。术语“置换”或“置换能力”是指下述的情况，其中两种抗体通过经由形成瞬时三分子复合物动力学改变彼此与其特异性抗原的结合而干扰彼此与抗原的结合，所述瞬时三分子复合物通过保留一种针对抗原的抗体并置换另一种而迅速分解。在abdicheetal.,2017(abdicheyn,yeungay,nii,stoned,milesa,morishigew,etal.(2017)antibodiestargetingcloselyadjacentorminimallyoverlappingepitopescandisplaceoneanother.plosone12(1):e0169535.doi:10.1371/journal.pone.0169535)中定义了抗体置换。如abdiche等人2017和本申请的实施例4中所述，可以通过使用实时无标记物的生物传感器以经典的夹心测定形式通过生物层干扰测量法测定抗体的置换。优选地，使用igg形式的抗体测定抗体置换。如本文所用，术语“结合”是指抗体与预先确定的抗原或靶物的结合，通常在通过使用抗体作为配体和抗原作为分析物的生物层干扰测量法测定时以对应于1e-6m或更小，例如5e-7m或更小，1e-7m或更小，如5e-8m或更小，如1e-8m或更小，如5e-9m或更小，或如1e-9m或更小的kd的结合亲和力结合，并且以对应于如下的kd的亲和力结合预先确定的抗原，所述kd比其结合除预先确定的抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如bsa，酪蛋白)的亲和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。如本文所用，术语“kd”(m)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，并且通过将kd除以ka获得。如本文所用，术语“kd”(sec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值或解离速率。如本文所用，术语“ka”(m-1xsec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。所述值也称为kon值或缔合速率。如本文所用，术语“5t4”是指名为5t4的蛋白质，其也称为滋养层糖蛋白、5t4癌胚抗原、5t4癌胚滋养层糖蛋白、tpbg、waif1和m6p1。它是72-80kda跨膜蛋白，具有广泛的n-连接的糖基化核心。在人(智人(homosapiens))中，5t4蛋白具有以seqidno:1所示的氨基酸序列(人滋养层糖蛋白：uniprot登录号q13641)。在以seqidno:1所示的氨基酸序列中，氨基酸残基1-31是信号肽，并且氨基酸残基32-420是成熟多肽。在食蟹猴(成束猴(macacafascicularis))中，5t4蛋白具有以seqidno:2所示的氨基酸序列(uniprot登录号q4r8y9)。在以seqidno:2所示的氨基酸序列中，氨基酸残基1-34是信号肽，并且氨基酸残基35-420是成熟多肽。在鸡(原鸡(gallusgallus))中，5t4蛋白具有以seqidno:3所示的氨基酸序列(uniprot登录号r4gm46)。在以seqidno:3所示的序列中，氨基酸残基1-27是信号肽，并且氨基酸残基28-379是成熟多肽。如本文所用，术语“cd3”是指人分化簇3蛋白，其是t细胞共受体蛋白复合物的一部分并且由四个不同的链组成。cd3也存在于其他物种中，因此，除非上下文矛盾，术语“cd3”不限于人cd3。在哺乳动物中，复合物含有cd3γ(gamma)链(人cd3γ链uniprotkb/swiss-protnop09693或食蟹猴cd3γuniprotkb/swiss-protnoq95li7)，cd3δ(delta)链(人cd3δuniprotkb/swiss-protnop04234或食蟹猴cd3δuniprotkb/swiss-protnoq95li8)，两条cd3ε(epsilon)链(人cd3εuniprotkb/swiss-protnop07766；氨基酸残基1-22是信号肽，并且氨基酸残基23-207是成熟的cd3ε多肽，其在本文中鉴定为seqidno:4；食蟹猴cd3εuniprotkb/swiss-protnoq95li5；或猕猴(rhesusmonkey)cd3εuniprotkb/swiss-protnog7ncb9)和cd3ζ链(zeta)链(人cd3ζuniprotkb/swiss-protnop20963，食蟹猴cd3ζuniprotkb/swiss-protnoq09tk0)。这些链与称为t细胞受体(tcr)的分子缔合，并在t淋巴细胞中产生活化信号。tcr和cd3分子一起构成tcr复合物。术语“抗体结合区”是指抗原中包含抗体结合的表位的区域。可以通过使用生物层干涉测量法的表位框并，通过丙氨酸扫描或通过改组测定法(使用将抗原区域与另一种抗原区域交换的抗原构建体，并且测定抗体仍结合抗原与否)来测定抗体结合区域。可以通过氢/氘交换质谱法和通过与其抗原结合的抗体的晶体学测定参与与抗体的相互作用的抗体结合区内的氨基酸。术语“表位”是指被抗体特异性结合的抗原决定簇。表位通常由诸如氨基酸、糖侧链或其组合的分子的表面分组组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，失去与前者的结合而非与后者的结合。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基，以及不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如当抗体与抗原结合时被抗体有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基在特定抗体的足迹内或与该足迹紧密相邻)。如本文所用，术语“单克隆抗体”、“单克隆ab”、“单克隆抗体组合物”、“mab”等是指单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的抗体，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从转基因或转染色体非人类动物如转基因小鼠获得的b细胞，所述b细胞具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。也可以从重组修饰的宿主细胞或使用支持体外转录和/或翻译编码抗体的核酸序列的细胞提取物的系统产生单克隆抗体。如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm)或其任何同种异型，例如igg1m(za)和igg1m(f))。此外，每个重链同种型均可与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。当在本文中使用时，术语“全长抗体”是指包含一对或两对重链和轻链的抗体(例如，亲本或变体抗体)，每个重链和轻链含有通常存在于该同种型的野生型抗体的重链-轻链对中的所有重链和轻链恒定和可变域。在全长变体抗体中，与全长亲本或野生型抗体相比，重链和轻链恒定和可变域可以特别含有改善抗体的功能特性的氨基酸取代。根据本发明的全长抗体可以通过包括以下步骤的方法来产生：(i)将cdr序列克隆到包含完整的重链序列和完整的轻链序列的合适的载体中，和(ii)在合适的表达系统中表达完整的重链和轻链序列系统。当从cdr序列或完整可变区序列开始时产生全长抗体在本领域技术人员的知识范围内。因此，本领域技术人员将知道如何产生根据本发明的全长抗体。如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和框架区和人免疫球蛋白恒定域的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变、插入或缺失)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不意图包括其中源自另一非人物种如小鼠的种系的cdr序列已被移植到人框架序列上的抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指遗传工程化的非人抗体，其含有人抗体恒定域和经修饰以与人可变域具有高水平序列同源性的非人可变域。这可以通过将六个一起形成抗原结合位点的非人类抗体互补决定区(cdr)移植到同源人类受体框架区(fr)上来实现(参见wo92/22653和ep0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可以需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的构架残基替换为人构架区(反向突变)。结构同源性建模可以帮助鉴定构架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人cdr序列，主要地人框架区以及完全人恒定区，所述人框架区任选地包含一个或多个向非人氨基酸序列的氨基酸反向突变。任选地，可以应用不一定是反向突变的其他氨基酸修饰，以获得具有优选特性如亲和力和生化特性的人源化抗体。如本文所用，术语“fc区”是指在从抗体的n端至c端末端的方向上至少包含铰链区、ch2区和ch3区的区域。抗体的fc区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的组分。如本文所用，术语“铰链区”是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如人igg1抗体的铰链区对应于根据如kabatkabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.5thedition-usdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242,pp662,680,689(1991)中阐述的eu编号的氨基酸216-230。然而，铰链区也可以是如本文所述的任何其他亚型。如本文所用，术语“ch1区”或“ch1域”是指免疫球蛋白重链的ch1区。因此，例如，人igg1抗体的ch1区对应于根据如kabat(同上)中所阐述的eu编号的氨基酸118-215。然而，ch1区域也可以是如本文所述的任何其他亚型。如本文所用，术语“ch2区”或“ch2域”是指免疫球蛋白重链的ch2区。因此，例如，人igg1抗体的ch2区对应于根据如kabat(同上)中所阐述的eu编号的氨基酸231-340。然而，ch2区域也可以是如本文所述的任何其他亚型。如本文所用，术语“ch3区”或“ch3域”是指免疫球蛋白重链的ch3区。因此，例如，人igg1抗体的ch3区对应于根据如kabat(同上)中所阐述的eu编号的氨基酸341-447。然而，ch3区域也可以是如本文所述的任何其他亚型。如本文所用，术语“fc介导的效应器功能”意图指作为多肽或抗体与其在细胞膜上的靶物或抗原结合结果的功能，其中fc介导的效应器功能可归因于多肽或抗体的fc区。fc介导的效应器功能的实例包括(i)c1q结合，(ii)补体激活，(iii)补体依赖性细胞毒性(cdc)，(iv)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，(v)fc-gamma受体(fcgr)结合，(vi)抗体依赖性fcγr介导的抗原交联，(vii)抗体依赖性细胞吞噬(adcp)，(viii)补体依赖性细胞性细胞毒性(cdcc)，(ix)补体增强的细胞毒性，(x)由抗体介导的调理抗体与补体受体的结合，(xi)调理和(xii)(i)至(xi)中任一项的组合。如本文所用，术语“惰性”、“惰性的”或“非活化的”指至少不能结合任何fcγr，诱导fc介导的fcγr交联或诱导经由个别抗体的两个fc区的fcγr介导的靶抗原交联，或无法结合c1q的fc区。可以使用单特异性或双特异性形式的抗体来测试抗体的fc区的惰性。当在抗体的上下文中使用时，术语“全长”表示该抗体不是片段，但是含有通常在自然界对于该同种型发现的该特定同种型的所有域，例如igg1抗体的vh、ch1、ch2、ch3、铰链、vl和cl域。在本发明的上下文中，术语“单价抗体”是指可以凭借仅一个抗原结合域(例如一个fab臂)与抗原上的特定表位相互作用的抗体分子。在双特异性抗体的上下文中，“单价抗体结合”是指双特异性抗体凭借仅一个抗原结合域(例如一个fab臂)结合抗原上的一个特定表位。在本发明的上下文中，术语“单特异性抗体”是指仅对一个表位具有结合特异性的抗体。该抗体可以是单特异性单价抗体(即仅携带一个抗原结合区)或单特异性二价抗体(即具有两个相同抗原结合区的抗体)。术语“双特异性抗体”是指具有两个不同的抗原结合域的抗体，例如两个不同的fab臂或两个具有不同cdr区的fab臂。在本发明的上下文中，双特异性抗体对至少两个不同的表位具有特异性。此类表位可以在相同或不同的抗原或靶物上。若表位在不同的抗原上，则此类抗原可以在同一细胞或不同细胞、细胞类型或结构上，例如细胞外基质或囊泡和可溶性蛋白上。因此，双特异性抗体可能能够交联多种抗原，例如，两个不同细胞。术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合区的抗体，所述两个抗原结合区结合一个或两个靶物或抗原上的表位或结合相同抗原上的一个或两个表位。因此，二价抗体可以是单特异性二价抗体或双特异性二价抗体。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可以互换使用，并且不应理解为限制性的。氨基酸是含有胺(-nh2)和羧基(-cooh)官能团以及每个氨基酸特有的侧链(r基团)的有机化合物。在本发明的上下文中，可以基于结构和化学特性对氨基酸进行分类。因此，氨基酸类别可反映在以下一个或两个表中：基于r基团的结构和一般化学表征的主要分类类别氨基酸酸性残基d和e碱性残基k,r和h亲水性的不带电荷的残基s,t,n和q脂肪族的不带电荷的残基g,a,v,l和i非极性的不带电荷的残基c,m和p芳香族残基f,y和w氨基酸残基的备选物理和功能分类用一个氨基酸取代另一个氨基酸可分类为保守或非保守取代。在本发明的上下文中，“保守取代”是一个氨基酸被具有相似结构和/或化学特征的另一个氨基酸取代，如用一个氨基酸残基取代如上文两个表的任一个中定义的相同类别的另一个氨基酸残基：例如，亮氨酸可以被异亮氨酸取代，因为它们都是脂肪族的、支链的疏水物。类似地，天冬氨酸可以被谷氨酸取代，因为它们都是小的带负电荷的残基。在本发明的上下文中，抗体中的取代表示为：原始氨基酸-位置-取代氨基酸；参照公认的氨基酸命名法，使用三个字母代码或一个字母代码，包括代码“xaa”或“x”表示任何氨基酸残基。因此，xaa或x通常可以代表20种天然存在的氨基酸中的任一种。如本文所用，术语“天然存在的”是指以下氨基酸残基中的任何一个；甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸。因此，符号“k409r”或“lys409arg”是指该抗体在氨基酸位置409处包含赖氨酸被精氨酸的取代。将给定位置处的氨基酸取代为任何其他氨基酸被称为：原始氨基酸-位置；或例如“k409”对于其中一个或多个原始氨基酸和/或一个或多个取代氨基酸可以包含超过一个但并非所有氨基酸的修饰，超过一个氨基酸可以用“，”或“/”分开。例如，位置409处的赖氨酸被精氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸的取代是：“lys409arg，ala，phe”或“lys409arg/ala/phe”或“k409r，a，f”或“k409r/a/f”或“k409至r，a或f”。此类名称在本发明的上下文中可以互换使用，但是具有相同的含义和目的。此外，术语“取代”包括取代成任何一个或其他19种天然氨基酸，或取代成其他氨基酸，例如非天然氨基酸。例如，位置409中的氨基酸k的取代包括以下每个取代：409a,409c,409d,409e,409f,409g,409h,409i,409l,409m,409n,409q,409r,409s,409t,409v,409w,409p和409y。顺便说一下，这等同于名称409x，其中x表示除原始氨基酸以外的任何氨基酸。这些取代也可以称为k409a、k409c等或k409a，c等或k409a/c/etc。类似地，这适用于本文提及的每个位置，以在本文中具体包括此类取代的任一个。根据本发明的抗体还可以包含氨基酸残基的缺失。此类缺失可以表示为“del”，并且包括例如写为k409del。因此，在此类实施方案中，位置409中的赖氨酸已经从氨基酸序列中缺失。如本文所用，术语“宿主细胞”意图指已经接受表达载体导入的细胞。应当理解，此类术语不仅意图指特定的对象细胞，而且还指此类细胞的后代。因为某些修饰可以由于突变或环境影响而在后代中发生，所以此类后代实际上可以与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如转染瘤，例如cho细胞、hek293细胞、expi293f细胞、per.c6细胞、ns0细胞和淋巴细胞，以及原核细胞，例如大肠杆菌和其他真核宿主，例如植物细胞和真菌。如本文所用，术语“转染瘤”包括表达抗体或靶抗原的重组真核宿主细胞，例如cho细胞、per.c6细胞、ns0细胞、hek293细胞、expi293f细胞，植物细胞或真菌，包括酵母细胞。为了本发明的目的，使用needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)，如在emboss包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,riceetal.,2000,trendsgenet.16:276-277)的needle程序，优选5.0.0版本以上中实施，测定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。标有“最长身份”的needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并且如下计算：(相同残基x100)/(比对长度-比对中的缺口总数)。相似残基的保留也可以或备选地可以通过相似性得分测量，如通过使用blast程序(例如，经由ncbi获得的blast2.2.8，使用标准设置blosum62，开放缺口＝11和延伸缺口＝1)测定。合适的变体通常与亲本序列表现出至少约45％，例如至少约55％，至少约65％，至少约75％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或更多(例如，约99％)相似性。如本文所用，术语“内在化”或“内在化”是指分子如根据本发明的抗体被细胞膜吞噬并被吸入细胞内部中的生物学过程。内在化也可以称为“胞吞”。抗体在第一方面，本发明提供了一种抗体，其包含至少一个能够结合5t4(滋养层糖蛋白)的抗原结合区，其中该抗体能够阻断选自下组的抗体与5t4的结合：a)抗体，其含有包含以seqidno:5所示的序列的vh区和包含以seqidno:9所示的序列的vl区[059]，b)抗体，其含有包含以seqidno:12所示的序列的vh区和包含以seqidno:16所示的序列的vl区[076]，c)抗体，其含有包含以seqidno:19所示的序列的vh区和包含以seqidno:23所示的序列的vl区[085]，d)抗体，其含有包含以seqidno:26所示的序列的vh区和包含以seqidno:30所示的序列的vl区[106]，e)抗体，其含有包含以seqidno:33所示的序列的vh区和包含以seqidno:37所示的序列的vl区[127]，f)抗体，其含有包含以seqidno:40所示的序列的vh区和包含以seqidno:44所示的序列的vl区[207]；和g)抗体，其含有包含以seqidno:47所示的序列的vh区和包含以seqidno:51所示的序列的vl区[226]。特别地，本发明提供了一种抗体，其包含至少一个能够结合5t4(滋养层糖蛋白)的抗原结合区，其中所述抗体能够阻断包含重链可变(vh)区和轻链可变(vl)区的抗体[059]与5t4的结合，所述重链可变(vh)区包含以seqidno:5所示的序列，所述轻链可变(vl)区包含以seqidno:9所示的序列。特别地，所述抗体可以能够阻断选自下组的抗体与5t4的结合：a)抗体，其含有包含以seqidno:40所示的序列的重链可变(vh)区和包含以seqidno:44所示的序列的轻链可变(vl)区[207]，b)抗体，其含有包含以seqidno:47所示的序列的重链可变(vh)区和包含以seqidno:51所示的序列的轻链可变(vl)区[226]；和抗体，其含有包含以seqidno:5所示的序列的重链可变(vh)区和包含以seqidno:9所示的序列的轻链可变(vl)区[059]。在本发明的特定实施方案中，抗体能够阻断选自下组抗体与5t4结合：a)抗体，其含有包含以seqidno:40所示的序列的重链可变(vh)区和包含以seqidno:44所示的序列的轻链可变(vl)区[207]；和b)抗体，其含有包含以seqidno:47所示的序列的重链可变(vh)区和包含以seqidno:51所示的序列的轻链可变(vl)区[226]。根据本发明的抗体的特征在于对人(智人)5t4具有特异性或具有结合人(智人)5t4的能力。因此，如本文提及的5t4可以特别是人5t4，如seqidno:1的成熟多肽。在进一步的实施方案中，本发明的抗体的特征在于对食蟹猴(成束猴)5t4具有特异性或具有结合食蟹猴(成束猴)5t4的能力，例如对人和食蟹猴5t4两者具有特异性或结合人和食蟹猴5t4两者的能力。食蟹猴5t4特别可以是seqidno:2的成熟多肽。在进一步的实施方案中，本发明的抗体对鸡(原鸡)5t4具有特异性或具有结合鸡(原鸡)5t4的能力，例如对人5t4和鸡5t4的特异性或结合人5t4和鸡5t4的能力，或对人、食蟹猴和鸡5t4的特异性或结合人、食蟹猴和鸡5t4的能力，其中特别地，鸡5t4可以具有seqidno:3的成熟多肽的氨基酸序列。因此，本发明的抗体对于人5t4如seqidno:1的成熟多肽和食蟹猴5t4如seqidno:2的成熟多肽可以具有特异性或可以能够结合人5t4如seqidno:1的成熟多肽和食蟹猴5t4如seqidno:2的成熟多肽。此外，根据本发明的抗体可以对人5t4，如seqidno:1的成熟多肽，食蟹猴5t4，如seqidno:2的成熟多肽和鸡5t4，如seqidno:3的成熟多肽具有特异性或可以能够结合人5t4，如seqidno:1的成熟多肽，食蟹猴5t4，如seqidno:2的成熟多肽和鸡5t4，如seqidno:3的成熟多肽。根据本发明的抗体可以能够以对应于1e-7m或更小的kd值，如约1e-7m或更小的kd值，5e-8m或更小，约5e-8m或更小，1e-8m或更小，约1e-8m或更小，5e-9m或更小，约5e-9m或更小，如1e-9m或更小或如约1e-9m或更小的结合亲和力，如以1e-7至5e-10m的范围内，如约1e-7至约5e-10m，如1e-7to1e-9m，如约1e-7至约1e-9m，如5e-8至5e-10m，如约5e-8至约5e-10m，如5e-8至1e-9m，如约5e-8至约1e-9m，如1e-8至5e-10m，如约1e-8至约5e-10m，如1e-8至1e-9m，如约1e-8至约1e-9m，如1e-8至5e-9m或如约1e-8至约5e-9m的范围内的kd值的结合亲和力结合人5t4、食蟹猴和/或鸡5t4。尽管测定抗体结合其靶物的亲和力在技术人员的能力内，但是根据本发明的抗体对5t4的结合亲和力特别可以通过生物层干扰测量法测定，任选地如本文实施例2中阐述。更具体地，可以使用程序诸如生物层干涉测量法程序来测定根据本发明的抗体的结合亲和力，该程序包括以下步骤：i)将1μg/ml量的抗体在抗人iggfc捕捉生物传感器上固定化600秒；ii)使用范围为100nm至1.56nm的2倍稀释系列，测定5t4ecdhis(seqidno:99的成熟蛋白)或食蟹猴5t4(seqidno:2的成熟蛋白)或重组食蟹猴5t4蛋白(cusabio；目录号csb-mp024093mov)的200秒的时间段内的缔合和1000秒的时间段内的解离，iii)相对于缓冲液对照(0nm)参考数据。特别地，可以使用前述权利要求中任一项所定义的抗体来测定根据本发明的抗体的结合亲和力，该抗体是单特异性二价抗体，如全长igg1的抗体。在本发明的进一步实施方案中，抗体识别或结合5t4上的表位或抗体结合区或结合位点，所述结合位点或表位或抗体结合区被选自下组的任一种抗体识别：a)抗体，其含有包含以seqidno:5所示的序列的vh区和包含以seqidno:9所示的序列的vl区[059]，b)抗体，其含有包含以seqidno:12所示的序列的vh区和包含以seqidno:16所示的序列的vl区[076]，c)抗体，其含有包含以seqidno:19所示的序列的vh区和包含以seqidno:23所示的序列的vl区[085]，d)抗体，其含有包含以seqidno:26所示的序列的vh区和包含以seqidno:30所示的序列的vl区[106]，e)抗体，其含有包含以seqidno:33所示的序列的vh区和包含以seqidno:37所示的序列的vl区[127]，f)抗体，其含有包含以seqidno:40所示的序列的vh区和包含以seqidno:44所示的序列的vl区[207]；和g)抗体，其含有包含以seqidno:47所示的序列的vh区和包含以seqidno:51所示的序列的vl区[226]。在进一步的实施方案中，根据本发明的抗体识别或结合5t4上的抗体结合区，结合位点或表位，其不是被选自下组的抗体结合的抗体结合区或结合位点或表位或不同于被选自下组的抗体结合的抗体结合区、结合位点或表位：a)抗体，其含有包含以seqidno:87所示的序列的vh区和包含以seqidno:88所示的序列的vl区[h8]，b)抗体，其含有包含以seqidno:83所示的序列的vh区和包含以seqidno:84所示的序列的vl区[a1]；和c)抗体，其含有包含以seqidno:85所示的序列的vh区和具有seqidno:86所示的序列的vl区[a3]。在其他实施方案中，根据本发明的抗体与5t4的结合被包含重链可变(vh)区和轻链可变(vl)区的抗体[a3]与5t4的结合阻断，所述重链可变(vh)区包含以seqidno:85所示的序列，所述轻链可变(vl)区包含以seqidno:86所示的序列。包含分别以seqidno85和86所示的vh和vl序列的抗体是抗体a3，wo2007106744中公开的三种鼠5t4抗体之一。改写：具有单氨基酸取代的抗体a3。在cdr序列中？在其他实施方案中，根据本发明的抗体显示与5t4或与5t4的加his标签的胞外域(例如5t4ecdhis/seqidno:99的成熟蛋白)结合的抗体的置换，所述与5t4结合的抗体含有包含以seqidno:85所示的序列的重链可变(vh)区和包含以seqidno:86所示的序列的轻链可变(vl)区[a3]。此种置换行为指示本发明的抗体结合表位，该表位不同于被抗体a3结合的表位，但是可以与被a3结合的表位相邻或甚至重叠。可以在生物层干涉测定法中测定“置换”或置换结合的抗体的能力，例如在如本申请的实施例4中所述进行的测定法中。“交叉阻断”或根据本发明定义的抗体阻断另一种抗体结合5t4的能力可以通过使用荧光激活细胞分选(facs)测定法来测定，例如在如实施例5中所述的那样进行的测定法中。特别地，“交叉阻断”或根据本发明的抗体阻断另一种抗体结合5t4的能力以未缀合的抗体阻断缀合的抗体的能力测定，并任选地在包括以下步骤的程序中测定：i)提供一组样品，每个样品包含人卵巢腺癌sk-ov-3细胞、结合5t4并与异硫氰酸荧光素(fitc)缀合的抗体和过量的靶向5t4的未缀合抗体的混合物，ii)将所述样品在4℃下温育30分钟，然后对所述样品离心，iii)从每个样品去除上清液，并将所述细胞重悬于缓冲液中，并使用流式细胞仪测定fitc的平均荧光强度(mfi)；并且iv)如下计算结合百分比：用与缀合有fitc的抗体和未缀合的抗体的混合物温育的细胞和未与缀合有fitc的抗体或未缀合的抗体温育的细胞之间的mfi的差乘以100，然后除以与缀合有fitc的抗体和igg-b12抗体的混合物温育的细胞和未与缀合有fitc的抗体或未缀合的抗体温育的细胞之间的mfi的差。虽然技术人员将熟悉用于确定抗体阻断另一种抗体与其靶物结合或置换另一种与其靶物结合的抗体的能力的合适技术，但是本申请公开了适合于测定阻断结合和置换的程序。因此，在一些实施方案中，可以使用生物层干涉测量法来测定根据本发明的抗体阻断另一种抗体与5t4的结合或置换与5t4结合的另一种抗体的能力，例如在如实施例3中所述的那样进行的生物层干涉测量法中。特别地，可以使用生物层干涉测量法来测定根据本发明的抗体阻断另一种抗体与5t4的结合或置换另一种与5t4结合的抗体的能力，可以在包括以下步骤的程序中测定：i)将根据本发明的抗体以10mm乙酸钠缓冲液中的20μg/ml量固定化到活化的胺反应性第二代生物传感器，ii)在ph8.5的乙醇胺中淬灭具有固定化的抗体的所述生物传感器，iii)将具有固定化抗体的所述生物传感器浸入包含3.6μg/ml(100nm)人5t4ecdhis(seqidno:99的成熟蛋白)的组合物中达500秒的时间段，然后iv)将具有固定化抗体和5t4ecdhis的所述生物传感器浸入包含10μg/ml靶向5t4的其他抗体的组合物中，并在500秒的时间段内测定缔合响应；其中在30℃的温度并以1000rpm摇动的情况下进行步骤i)-iv)。本文提供的抗体可以结合人5t4上包含氨基酸残基r73、y92和r94的表位或抗体结合区；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。本文还提供了抗体，其结合人5t4上包含氨基酸残基s69、r73、y92和r94的表位或抗体结合区；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。本文还提供了抗体，其结合人5t4上包含氨基酸残基r73、t74、y92、r94和n95的表位或抗体结合区结合；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。基于本文实施例16中提供的结果，假设但不希望受到理论的束缚，这些氨基酸残基(即s69、r73、t74、y92、r94和n95)中的任何一个或多个直接参与抗体结合，例如通过非共价相互作用；例如在抗体的cdr序列内具有氨基酸残基。该假说得到以下事实的支持，这些残基被鉴定为5t4的结构(4cnm；由rcsbpdb蛋白质数据库提供；doi:10.2210/pdb4cnm/pdb)上表面暴露的；如发表在zhao,y.,malinauskas,t.,harlos,k.,&jones,e.y.(2014).structuralinsightsintotheinhibitionofwntsignalingbycancerantigen5t4/wnt-activatedinhibitoryfactor1.structure,22(4),612–620中。以下一个或多个另外的氨基酸残基可涉及抗体的结合，例如间接参与结合，例如通过影响蛋白质折叠和/或直接参与抗体结合的一个或多个氨基酸残基的定位：l89、f111、l117、f138、l144、d148、n152；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。特别地，如zhaoetal.,structure,22(4),612–620中所述，l89、f111、l117、f138、l144已经鉴定为5t4内疏水核心的一部分。此外，本文公开的抗体可以针对人5t4上的表位或抗体结合区，所述表位或抗体结合区内氨基酸残基r73、y92和r94直接参与结合抗体，并且其中氨基酸残基f111、f138，l144和d148的一个或多个间接参与所述结合；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。本文提供的抗体可以结合人5t4上的表位或抗体结合区，所述表位或抗体结合区内氨基酸残基s69、r73、y92和r94直接参与结合抗体，并且其中氨基酸残基f111、f138和d148的一个或多个间接参与所述结合；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。此外，本公开内容提供了结合人5t4上的表位或抗体结合区的抗体，所述表位或抗体结合区内氨基酸残基r73、t74、y92、r94和n95直接参与结合抗体，并且其中氨基酸残基f138间接参与所述结合；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。可以通过对具有以seqidno:1所示的氨基酸序列的人5t4或seqidno:1的成熟多肽序列进行丙氨酸扫描，或通过对包含seqidno:1的氨基酸残基32-355的多肽进行丙氨酸扫描来鉴定所述表位或抗体结合区所包含的氨基酸残基以及任选地间接参与结合的一个或多个另外的氨基酸残基。丙氨酸扫描可特别地如本文实施例16所述或基本上如本文实施例16所述进行。此外，可以通过包括以下步骤的程序来进行丙氨酸扫描：i)在人胚胎肾细胞，例如hek293细胞中个别地表达突变体人5t4多肽和野生型5t4多肽(seqidno:1的氨基酸残基32-355)，以便为每个突变体或野生型5t4提供包含70-90.000个细胞，如80.000个细胞的样品，在所述突变体人5t4多肽中除半胱氨酸和丙氨酸外人5t4胞外域中的所有氨基酸残基(对应于seqidno:1的氨基酸残基32-355)个别地用丙氨酸取代，ii)在室温将每个样品中的所述细胞与20μl的所述抗体温育40分钟，所述抗体与缀合有异硫氰酸荧光素(fitc)的抗体(3μg/ml；在facs缓冲液中)缀合，然后在150-180μlfacs缓冲液(磷酸盐缓冲液[pbs；lonza,目录号be17-517]+0.1％[w/v]bsa[roche,目录号10735086001]+0.02％[w/v]叠氮化钠[nan3；emelcabioscience,目录号41920044-3])中洗涤每个样品两次，并且将每个样品中的所述细胞重悬于30μlfacs缓冲液中，iii)对于每个样品，以所述样品中活的单细胞群体的荧光强度的几何平均值(gmfi)测定每个细胞结合的抗体的平均量，并且使用以下等式，相对于非交叉阻断5t4特异性对照抗体的结合强度标准化每种测试抗体的数据：其中“aa位置”是指突变为丙氨酸的位置，其中根据以下计算，计算z得分以表达所述抗体结合的丧失或获得：其中μ和σ分别是从所有突变体计算的标准化gmfi的平均值和标准差，其中若特定5t4突变体的所述对照抗体的gmfi低于平均gmfi对照抗体-2.5x平均gmfi对照抗体的sd(来自所有突变体)，则从分析中排除数据；以及任选地其中若残基以正好低于-1.5(例如-1.5至-1.8之间，如-1.5至-1.7之间或如-1.5至-1.6之间)的z得分结合，并且该残基预测为被掩埋并且与大多数残基在空间上分离，则从分析中排除数据，所述大多数残基预测为表面暴露的并且针对所述大多数残基确定结合的丧失或降低的结合。要在步骤iii)中使用的合适的非交叉阻断5t4特异性对照抗体是双特异性抗体，其包含-抗原结合区，其包含以seqidno:83所示的vh序列和以seqidno:84所示的vl序列[a1]；和-抗原结合区，其包含以seqidno:97所示的vh序列和以seqidno:98所示的vl序列[b12]。本发明提供了抗体，该抗体结合5t4，使得若氨基酸残基r73、y92和r94中的任何一个或多个被丙氨酸取代，则存在有结合丧失或结合是减少的；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。特别地，若氨基酸残基s69、r73、y92和r94中的任何一个或多个被丙氨酸取代，则存在有结合丧失或结合是减少的；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。此外，若氨基酸残基r73、t74、y92、r94和n95中的任何一个或多个被丙氨酸取代，则存在有结合丧失或结合是减少的；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。同样，本文公开的抗体可以结合5t4，使得若氨基酸残基l89、f111、l117、f138、l144、d148、n152中的任何一个或多个被丙氨酸取代，则存在有结合丧失或结合是减少的；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。此外，抗体可以结合5t4，使得若氨基酸残基r73、y92、r94、f111、f138、l144和d148中的任何一个或多个被丙氨酸取代，则存在有结合丧失或结合是减少的；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。抗体可以结合5t4，使得若氨基酸残基s69、r73、y92、r94、f111、f138和d148中的任何一个或多个被丙氨酸取代，则存在有结合丧失或结合是减少的；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。在其他实施方案中，本发明的抗体可以结合5t4，使得若氨基酸残基r73、t74、y92、r94、n95和f138中的任何一个或多个被丙氨酸取代，则存在有结合丧失或结合是减少的；每个氨基酸残基的编号指其在seqidno:1中的位置。可以通过丙氨酸扫描包含seqidno:1的氨基酸残基32-355的多肽测定以上提供的任何丙氨酸取代的效果。特别地，可以通过本文实施例16中所述的或基本上如本文实施例16所述的程序测定丙氨酸取代的效果。结合丧失可以定义为结合的z得分低于1.5；z得分任选地如本文实施例16所述或基本上如本文实施例16所述计算。可以通过包括以下步骤的程序测定丙氨酸取代的效果：i)在人胚胎肾细胞，例如hek293细胞中个别地表达突变体人5t4多肽和野生型5t4多肽，以便为每个突变体或野生型5t4提供包含70-90.000个细胞，如80.000个细胞的样品，在所述突变体人5t4多肽中除半胱氨酸和丙氨酸外人5t4胞外域中的所有氨基酸残基(对应于seqidno:1的氨基酸残基32-355)个别地用丙氨酸取代，ii)在室温将每个样品中的所述细胞与20μl的所述抗体温育40分钟，所述抗体与缀合有异硫氰酸荧光素(fitc)的抗体(3μg/ml；在facs缓冲液中)缀合，然后在150-180μlfacs缓冲液(磷酸盐缓冲液[pbs；lonza,目录号be17-517]+0.1％[w/v]bsa[roche,目录号10735086001]+0.02％[w/v]叠氮化钠[nan3；emelcabioscience,目录号41920044-3])中洗涤每个样品两次，并且将每个样品中的所述细胞重悬于30μlfacs缓冲液中，iii)对于每个样品，以所述样品中活的单细胞群体的荧光强度的几何平均值(gmfi)测定每个细胞结合的抗体的平均量，并且使用以下等式，相对于非交叉阻断5t4特异性对照抗体的结合强度标准化每种测试抗体的数据：其中“aa位置”是指突变为丙氨酸的位置，其中根据以下计算，计算z得分以表达所述抗体结合的丧失或获得：其中μ和σ分别是从所有突变体计算的标准化gmfi的平均值和标准差，其中若特定5t4突变体的所述对照抗体的gmfi低于平均gmfi对照抗体-2.5x平均gmfi对照抗体的sd(来自所有突变体)，则从分析中排除数据；以及任选地其中若残基以正好低于-1.5(例如-1.5至-1.8之间，如-1.5至-1.7之间或如-1.5至-1.6之间)的z得分结合，并且该残基预测为被掩埋并且与大多数残基在空间上分离，则从分析中排除数据，所述大多数残基预测为表面暴露的并且针对所述大多数残基确定结合的丧失或降低的结合。前述程序的步骤iii)中合适的非交叉阻断5t4特异性对照抗体是双特异性抗体，其包含-抗原结合区，其包含以seqidno:83所示的vh序列和以seqidno:84所示的vl序列[a1]；和-抗原结合区，其包含以seqidno:97所示的vh序列和以seqidno:98所示的vl序列[b12]。根据本发明的抗体的特征可以在于具有降低的内在化能力，如通过与含有包含以seq.id.no.:87所示的序列的重链可变(vh)区和包含以seqidno:88所示的序列的轻链可变(vl)区的同样缀合的抗体[h8]相比当与细胞毒性部分缀合时降低的细胞毒性显示。包含分别以seqidno:87和88所示的vh和vl序列的抗体可以是鼠5t4抗体mab5t4，也称为h8抗体(shawetal.(2002),biochem.j.363:137-45,wo98/55607)。在wo06/031653中公开了抗体h8的各种嵌合或人源化形式。可以使用本申请中的实施例7中所述的程序测定单价结合5t4的5t4抗体的细胞毒性或内在化。特别地，可以在包括以下步骤的测定法中测定细胞毒性：i)提供缀合有毒素的单价结合5t4的双特异性抗体，其包含如前述权利要求中任一项所定义的抗体的第一fab臂和能够结合hiv病毒蛋白gp120(hiv-1gp120)的第二fab臂，其中hiv-1gp120特异性fab臂与duostatin-3缀合，ii)将5t4阳性乳腺癌细胞mda-mb-468(atcc克隆htb-132)或hcc1954(atcc克隆crl-1338)与所述单价结合5t4的双特异性抗体在37℃下温育5天；和iii)测定细胞的存活力。igg-b12是hiv-1gp120特异性抗体(barbas,cf.jmolbiol.1993apr5；230(3):812-23)。重链(vh)和轻链可变(vl)区的序列分别在seqidno:97和98中列出。在某些实施方案中，本发明的抗体是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变(vh)区：a)重链可变(vh)区，包含seqidno.:6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3序列[059]，b)重链可变(vh)区，包含seqidno:13、14和15的cdr1、cdr2和cdr3序列[076]，c)重链可变(vh)区，其包含seqidno.:20、21和22的cdr1、cdr2和cdr3序列[085]，d)重链可变(vh)区，包含seqidno.:27、28和29的cdr1、cdr2和cdr3序列[106]，e)重链可变(vh)区，包含seqidno:34、35和36的cdr1、cdr2和cdr3序列[127]，f)重链可变(vh)区，包含seqidno.:41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列[207]，g)重链可变(vh)区，其包含seqidno.:48、49和50的cdr1、cdr2和cdr3序列[226]，和h)包含cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变(vh)区，当与a)至g)中任一项所定义的cdr1、cdr2和cdr3序列相比时，所述cdr1、cdr2和cdr3序列总共包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或最多10个氨基酸取代。在其他实施方案中，根据本发明的抗体是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变(vh)区：a)重链可变(vh)区，包含seqidno.:6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3序列[059]，b)重链可变(vh)区，包含seqidno.:41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列[207]，c)重链可变(vh)区，其包含seqidno.:48、49和50的cdr1、cdr2和cdr3序列[226]；和d)包含cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变(vh)区，当与a)至c)中任一项所定义的cdr1、cdr2和cdr3序列相比时，所述cdr1、cdr2和cdr3序列总共包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或最多10个氨基酸取代。特别地，根据本发明的抗体可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变(vh)区，其包含seqidno:6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3序列[059]。或者，根据本发明的抗体可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变(vh)区：包含seqidno.:41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变(vh)区[207]。根据本发明的抗体还可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变(vh)区：包含seqidno.:48、49和50的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变(vh)区[226]。在其他实施方案中，根据本发明的抗体是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变(vh)区和轻链可变(vl)区：a)分别包含seqidno.:6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区(vh)和分别包含seqidno:10、aas和seqidno:11的cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区(vl)[059]，b)分别包含seqidno:13、14和15的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区(vh)和分别包含seqidno:17、das和seqidno:18的cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区(vl)[076]，c)分别包含seqidno:20、21和22的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区(vh)和分别包含seqidno:24、das和seqidno:25的cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区(vl)[085]，d)分别包含seqidno.:27、28和29的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区(vh)和分别包含seqidno:31、dvs和seqidno:32的cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区(vl)[106]，e)分别包含seqidno.:34、35和36的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区(vh)和分别包含seqidno:38、das和seqidno:39的cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区(vl)[127]，f)分别包含seqidno.:41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区(vh)和分别包含seqidno:45、das和seqidno:46的cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区(vl)[207]，g)分别包含seqidno.:48、49和50的cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区(vh)和分别包含seqidno:52、das和seqidno:53的cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区(vl)[226]；和h)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，每个区包含cdr1、cdr2和cdr3序列，当与a)至g)中任一项所定义的cdr1、cdr2和cdr3序列相比时，所述cdr1、cdr2和cdr3序列总共包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或最多10个氨基酸取代。根据本发明的抗体可以是抗体，其中当与以下项相比时，所述能够结合5t4的抗原结合区的六个互补决定区(cdr)总共包含最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或最多10个氨基酸取代；iv)seqidno:6、7、8、10、aas和seqidno:11的cdr序列[059]，v)seqidno.:41、42、43、45、das和seqidno:46的cdr序列[207]；或vi)seqidno.:48、49、50、52、das和seqidno:53的cdr序列[226]。优选地，所述氨基酸取代中的1个，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个是保守氨基酸取代。抗体可特别包含一个或两个重链可变区，其中互补决定区3(cdr3)包含以seqidno:102(yygmdv)所示的序列的六个连续氨基酸残基[059，207，226]。这六个连续的氨基酸残基可以是cdr3内最c端的氨基酸残基。根据本发明的抗体可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含一个或两个重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含seqidno:41(ggsfsgyy)的cdr1序列、seqidno:103(idhsx1st)的cdr2序列和seqidno:104(ax2wfgelx3x4yyygmdv)的cdr3序列，所述轻链可变区包含seqidno:105(qsvssx5)的cdr1序列、cdr2序列das和seqidno:46(qqrsnwplt)的cdr3序列，其中x1是g或e，x2是a或g，x3是w或y，x4是d或h，并且x5是y或f[207，226]。根据本发明的抗体可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)[059]，所述重链可变区包含分别为seqidno:6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区包含分别为seqidno:10、aas和seqidno:11的cdr1、cdr2和cdr3序列。或者，根据本发明的抗体可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变(vh)区和轻链可变(vl)区[207]，所述重链可变区包含分别为seqidno.:41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区包含分别为seqidno:45、das和seqidno:46的cdr1、cdr2和cdr3序列。另外，根据本发明的抗体可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)[226]，所述重链可变区包含分别为seqidno.:48、49和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区包含分别为seqidno:52、das和seqidno:53的cdr1、cdr2和cdr3序列。在一些实施方案中，根据本发明的抗体是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变区(vh)：a)重链可变区(vh)，其包含seqidno:5的序列或与seqidno:5的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[059]，b)重链可变区(vh)，其包含seqidno:12的序列或与seqidno:12的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[076]，c)重链可变区(vh)，其包含seqidno:19的序列或与seqidno:19的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[085]，d)重链可变区(vh)，其包含seqidno:26的序列或与seqidno:26的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[106]，e)重链可变区(vh)，其包含seqidno:33的序列或与seqidno:33的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的序列[127]，f)重链可变区(vh)，其包含seqidno:40的序列或与seqidno:40的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[207]；和g)重链可变区(vh)，其包含seqidno:47的序列或与seqidno:47的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[226]。根据本发明的抗体可以特别地是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)，其包含seqidno:5的序列或与seqidno:5的序列具有至少90％、至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的序列[059]。同样，根据本发明的抗体可以是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)，其包含seqidno:40的序列或与seqidno:40的序列具有至少90％、至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的序列[207]。另外，根据本发明的抗体可以是抗体，其中能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)，其包含seqidno:47的序列或与seqidno:47的序列具有至少90％、至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的序列[226]。在其他实施方案中，根据本发明的抗体是抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)：a)包含seqidno:5的序列或与seqidno:5的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的重链可变区(vh)和包含seqidno:9的序列或与seqidno:9的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的轻链可变区(vl)[059]，b)包含seqidno:12的序列或与seqidno:12的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的重链可变区(vh)和包含seqidno:16的序列或与seqidno:16的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的轻链可变(区vl)[076]，c)包含seqidno:19的序列或与seqidno:19的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的重链可变区(vh)和包含seqidno:23的序列或与seqidno:23的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的轻链可变区(vl)[085]，d)包含seqidno:26的序列或与seqidno:26的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的重链可变区(vh)和包含seqidno:30的序列或与seqidno:30的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的轻链可变区(vl)[106]，e)包含seqidno:33的序列或与seqidno:33的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的重链可变区(vh)和包含seqidno:37的序列或与seqidno:37的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的轻链可变区(vl)[127]，f)包含seqidno:40的序列或与seqidno:40的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的重链可变区(vh)和包含seqidno:44的序列或与seqidno:44的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的轻链可变区(vl)[207]，g)包含seqidno:47的序列或与seqidno:47的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的重链可变区(vh)和包含seqidno:51的序列或与seqidno:51的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列的轻链可变区(vl)[226]。在一个实施方案中，至少一个结合区包含重链可变(vh)区和轻链可变(vl)区，它们跨选自下组的所述重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)具有最多10个突变或取代，最多5个突变或取代，如最多4个突变或取代，如最多3个突变或取代，如最多2个突变或取代，如最多1个突变或取代：a)包含seqidno:5的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:9的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[059]，b)包含seqidno:12的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:16的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[076]，c)包含seqidno:19的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:23的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[085]，d)包含seqidno:26的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:30的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[106]，e)包含seqidno:33的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:37的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[127]，f)包含seqidno:40的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:44的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[207]；和g)包含seqidno:47的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:51的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[226]。在本公开内容的一些实施方案中，跨可变重链的全长和整个可变轻链允许最多10个突变或取代，最多5个突变或取代，如最多4个突变或取代，如最多3个突变或取代，如最多2个突变或取代，如1个突变或取代。在其他实施方案中，最多10个突变或取代，最多5个突变或取代，如最多4个突变或取代，如最多3个突变或取代，如最多2个突变或取代，如最多1个突变或取代可以不在所述可变重链和可变轻链中的6个cdr序列的任一个内。多达10个突变或取代可分布在每个结合区的可变重链和可变轻链的全长上。一些或全部的突变或取代可以是保守取代，其中一个氨基酸残基被如上文定义“氨基酸”下指示的相同类别的氨基酸残基取代；例如，用一个酸性氨基酸取代另一个酸性氨基酸残基，并且可以用芳香族残基可以被另一个芳族残基取代。可以优选的是，变体中的35％或更高，50％或更高，60％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，92％或更高，93％或更高或94％或更高的取代是保守的氨基酸残基替换。特别地，某些或全部突变或取代可以用一个或多个氨基酸残基进行，每个氨基酸残基与其取代的相应氨基酸残基具有相同的物理或功能特性。在上文的定义“氨基酸”下提供了共享物理和功能特性的氨基酸残基；例如上文在定义“氨基酸”下；例如，可以用疏水残基取代另一个疏水氨基酸残基，或者可以用环烯基相关的残基取代另一个环烯基相关的残基。特别地，包含如上文所公开的取代或突变的抗体可以是上文参考序列标识符定义的vl区、vh区或一个或多个cdr的功能变体。在本发明的抗体的情况下使用的vl、vh或cdr的功能性变体仍然允许抗体保留至少相当大比例(至少约50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或更高)的亲本抗体的亲和力和/或特异性/选择性，并且在某些情况下，此类5t4抗体甚至可以比亲本抗体与更高的亲和力、选择性和/或特异性相关。在本发明的其他实施方案中，抗体是如下的抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含选自下组的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)：a)包含seqidno:5的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:9的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[059]，b)包含seqidno:12的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:16的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[076]，c)包含seqidno:19的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:23的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[085]，d)包含seqidno:26的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:30的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[106]，e)包含seqidno:33的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:37的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[127]，f)包含seqidno:40的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:44的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[207]；和g)包含seqidno:47的序列或由该序列组成的重链可变区(vh)和包含seqidno:51的序列或由该序列组成的轻链可变区(vl)[226]。本发明的抗体可以是全长抗体，例如全长igg1抗体。此外，本发明的抗体可以是单价抗体。或者，根据本发明的抗体可以是二价抗体。在其他实施方案中，根据本发明提供的抗体是单特异性抗体。或者，根据本发明的抗体可以是双特异性抗体。提供如上所定义的抗体也在本公开内容的范围内，所述抗体包含结合cd3，诸如人cd3ε(epsilon)，诸如如seqidno:4中指定的人cd3ε(epsilon)。的抗体的抗原结合区。特别地，本公开内容提供了双特异性抗体，其包含如上文公开的抗体的第一抗原结合区和结合cd3如人cd3的第二结合区，如上定义。可用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括但不限于(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单一抗体，(ii)对两个不同表位具有特异性的单链抗体，例如经由通过额外的肽接头串联连接的两个scfv；(iii)双重可变域抗体(dvd-igtm)，其中每个轻链和重链含有经由短肽连接串联的两个可变域，wuetal.,generationandcharacterizationofadualvariabledomainimmunoglobulin(dvd-igtm)molecule,于:antibodyengineering,springerberlinheidelberg(2010)；(iv)化学连接的双特异性(fab’)2片段；(v)其是两个单链双抗体(diabodies)的融合体，产生四价双特异性抗体，其对每个靶抗原具有两个结合位点；(vi)弹性体(flexibody)，其是scfv与双抗体的组合，产生多价分子；(vii)基于蛋白质激酶a中的“二聚化和对接域”的所谓“对接和锁”分子所述二聚化和对接域当应用于fab时可以产生三价双特异性结合蛋白，其由与不同fab片段连接的两个相同fab片段组成；(viii)所谓的scorpion分子，其包含例如与人fab臂的两个末端融合的两个scfv；和(ix)双抗体。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是双抗体、交叉抗体(cross-body)如crossmabs，或通过受控的fab臂交换获得的双特异性抗体(例如wo2011/131746中所述)。不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于(i)具有互补ch3域以迫使异二聚化的igg样分子；(ii)重组igg样双重靶向分子，其中分子的两侧各含有至少两种不同抗体的fab片段或fab片段的一部分；(iii)igg融合分子，其中全长igg抗体与额外的fab片段或fab片段的一部分融合；(iv)fc融合分子，其中单链fv分子或稳定化的双抗体与重链恒定域、fc区或其部分融合；(v)fab融合分子，其中不同的fab片段融合在一起，融合至重链恒定域、fc区或其部分；(vi)基于scfv的和基于双抗体的重链抗体(例如，域抗体，)，其中将不同的单链fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，域抗体，)彼此融合或者与另一种蛋白质或载体分子融合，所述另一种蛋白质或载体分子与重链恒定域，fc区或其部分融合。具有互补的ch3域分子的igg样分子的实例包括但不限于(trionpharma/freseniusbiotech,wo/2002/020039)、突出-入-空穴(knobs-into-holes)(genentech,wo9850431；)、crossmabs(roche,wo2011117329)和静电匹配的(amgen,ep1870459和wo2009089004；chugai,us201000155133；oncomed,wo2010129304)、luz-y(genentech)、dig-body和pig-body(pharmabcine)、链交换工程化域抗体(strandexchangeengineereddomainbody)(seedbody)(emdserono,wo2007110205)、biclonics(merus)、fcδadp(regeneron,wo2010/015792)、双特异性igg1和igg2(pfizer/rinat,wo11143545)、azymetric支架(zymeworks/merck,wo2012058768)、mab-fv(xencor,wo2011028952)、二价双特异性抗体(rochewo2009/080254)和分子(genmaba/s,wo2011/131746)。重组igg类双重靶向分子的实例包括但不限于双重靶向(dt)-ig(gsk/domantis)、二合一抗体(genentech)、交联mabs(karmanoscancercenter)、mab2(f-star,wo2008003116)、zybodiestm(zyngenia)、用共同轻链的方法(crucell/merus,us7,262,028)、κλbodies(novimmune)和covx-body(covx/pfizer)。igg融合分子的实例包括但不限于双重可变域(dvd)-igtm(abbott,us7,612,181)、双重域双重头抗体(unilever；sanofiaventis,wo20100226923)、igg样双特异性(imclone/elililly)、ts2ab(medimmune/az)和bsab(zymogenetics)、hercules(biogenidec,us007951918)、scfv融合物(novartis)、scfv融合物(changzhouadambiotechinc,cn102250246)和tvab(roche,wo2012025525,wo2012025530)。fc融合分子的实例包括但不限于scfv/fc融合物(academicinstitution)、scorpion(emergentbiosolutions/trubion,zymogenetics/bms)、双重再靶向技术(dualaffinityretargetingtechnology)(fc-darttm)(macrogenics,wo2008157379,wo2010/080538)和dual(scfv)2-fab(nationalresearchcenterforantibodymedicine–china)。fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于f(ab)2(medarex/amgen)、dual-action或bis-fab(genentech)、(dnl)(immunomedics)、二价双特异性(biotecnol)和fab-fv(ucb-celltech)。基于scfv的抗体、基于双抗体的抗体和域抗体的实例包括但不限于双特异性t细胞结合剂(engager)(micromet,tandemdiabody(tandabtm)(affimed)、双重再靶向技术(dart)(macrogenics)、单链双抗体(academic)、tcr样抗体(ait,receptorlogics)、人血清清蛋白scfv融合物(merrimack)和combody(epigenbiotech)、双重靶向纳米抗体(ablynx)，双重靶向的仅重链的域抗体。根据本公开内容的抗体可以特别地是抗体，其中结合cd3的抗原结合区包含重链可变区(vh)，其包含分别为seqidno.:54、55和56的cdr1、cdr2和cdr3序列；[hucd3-h1l1](wo2015001085(genmaba/s))；以及任选地轻链可变区(vl)，其包含分别为seqidno:58、gtn和59的cdr1、cdr2和cdr3序列[hucd3-h1l1]。还公开了如下的抗体，其中结合cd3的抗原结合区包含重链可变区(vh)，其包含seqidno:57的序列或与seqidno:57的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[hucd3-h1l1]；以及任选地轻链可变区(vl)，其包含seqidno:60的序列或与seqidno:60的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[hucd3-h1l1]。本公开内容进一步提供了抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别为seqidno.:6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区包含分别为seqidno:10、aas和seqidno:11的cdr1、cdr2和cdr3序列[059]，和所述能够结合cd3的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别具有以seqidno:54、55和67所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，所述轻链可变区包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[hucd3-h1l1]。另外，本公开内容提供了抗体，其中能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，该重链可变区包含以seqidno.:41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区(vl)包含分别以seqidno.:45、das和46的cdr1、cdr2和cdr3序列[207]；和能够结合cd3的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，该重链可变区包含分别具有以seqidno:54、55和56所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，所述轻链可变区(vl)包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[hucd3-h1l1]。另外，公开内容提供了抗体，其中能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变(vh)区和轻链可变区(vl)，该重链可变区包含分别为seqidno:48、49和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区(vl)包含分别为seqidno:52、das和seqidno:53的cdr1、cdr2和cdr3序列[226-vh+vlcdr1、-2和-3序列]；和能够结合cd3的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，该重链可变区包含分别具有以seqidno:54、55和56所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3，所述轻链可变区区域(vl)包含分别具有以seqidno:58所示的序列、cdrgtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[hucd3-h1l1]。结合cd3的抗原结合区可以以200–1000nm的范围内，如300–1000nm的范围内，400–1000nm的范围内，500–1000nm的范围内，300–900nm的范围内，400–900nm的范围内，400–700nm的范围内，500–900nm的范围内，500–800nm的范围内，500–700nm的范围内，600–1000nm的范围内，600–900nm的范围内，600–800nm的范围内，或如600–700nm的范围内的平衡解离常数kd结合。在进一步的实施方案中，本文公开的抗体比具有包含以seqidno:57所示的vh序列和以seqidno:60所示的vl序列[hucd3-h1l1]的抗原结合区的抗体具有更低的人cd3ε结合亲和力，优选其中所述亲和力低至少2倍，例如低至少5倍，如低至少10倍，例如低至少20倍，低至少30倍，低至少40倍，低至少45倍，低至少50倍，低至少55倍，或如低至少50倍。特别地，结合cd3的抗原结合区可以以1–100nm的范围内，如5–100nm的范围内，10–100nm的范围内，1–80nm的范围内，1–60nm的范围内，1–40nm的范围内，1–20nm的范围内，5–80nm的范围内，5–60nm的范围内，5–40nm的范围内，5–20nm的范围内，10–80nm的范围内，10–60nm的范围内，10–40nm的范围内，或如10–20nm的范围内的平衡解离常数kd结合。可以通过生物层干扰测量法测定根据本发明的抗体结合cd3的亲和力，使用上述程序的修改或如本文实施例2所述进行，其中将抗体固定化在人iggfc捕捉生物传感器上并且测定cd3e27-gska(seqidno:101的成熟蛋白)与固定化抗体的缔合和解离。此外，可以通过如在本文的实施例9中提供的生物层干扰测量法测定根据本发明的抗体结合cd3的亲和力。wo2017/009442中提供了具有降低的亲和力的结合cd3，特别是人cd3的抗体，并且应当理解，这些抗体中的任一种都可以充当产生根据本发明的抗体的基础，所述抗体除了结合5t4的能力外还具有以降低的亲和力结合cd3的能力。因此，在其他实施方案中，根据本发明的抗体是如下的抗体，其中结合cd3的抗原结合区包含重链可变(vh)区，该重链可变区包含cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列，当与包含以seqidno:57所示的序列的重链可变(vh)区相比时，所述重链可变(vh)区在所述cdr序列之一中具有氨基酸取代，该取代位于选自下组的位置处：t31、n57、h101、g105、s110和y114，所述位置根据seqidno:57的序列编号；和野生型轻链可变(vl)区包含分别以seqidno:58、gtn和seqidno:59所示的cdr1、cdr2和cdr3序列。优选的是，当与以seqidno:57所示的序列比较时，结合cd3的抗原结合区的重链可变(vh)区的cdr1、cdr2和cdr3总共包含最多1、2、3、4或5个氨基酸取代。结合cd3的抗原结合区的重链可变(vh)区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列与野生型重链可变(vh)区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列可以具有至少95％的序列同一性，如至少96％的序列同一性，至少97％的序列同一性，至少98％的序列同一性或至少99％的序列同一性，序列同一性是基于比对由结合cd3的抗原结合区的重链可变(vh)区的cdr1、cdr2和cdr3的序列组成的氨基酸序列与包含所述野生型重链可变(vh)区的cdr1、cdr2和cdr3序列的氨基酸序列计算的。特别地，结合cd3的抗原结合区可以包含选自下组的突变：t31m,t31p,n57e,h101g,h101n,g105p,s110a,s110g,y114m,y114r,y114v，位置根据seqidno:57的参考序列编号。在某些实施方案中，根据本发明的抗体是抗体，其中当所述抗体是缺乏fc介导的效应器功能或具有降低的fc介导的效应器功能的双特异性抗体(“惰性”抗体)，并且包含结合cd3的抗体的抗原结合区时，则抗体：a)当使用纯化的外周血单个核细胞(pbmc)或t细胞作为效应细胞时，能够介导sk-ov-3细胞的浓度依赖性细胞毒性，例如，当如本文实施例14所述的那样测定时，b)当使用纯化的t细胞作为效应细胞时，能够介导mda-mb-231细胞的浓度依赖性细胞毒性，例如，当如本文实施例13所述的那样测定时，c)能够在mda-mb-231肿瘤细胞存在下体外活化t细胞；例如如本文实施例13(ii)所述的那样测定时，d)能够在bxpc-3、panc-1、caski和/或siha肿瘤细胞存在下体外活化t细胞；例如如本文实施例17所述的那样测定时，e)当使用纯化的t细胞作为效应细胞时，能够诱导bxpc-3、panc-1、caski和/或siha肿瘤细胞的细胞毒性，例如当如本文实施例17所述的那样测定时；和/或f)在人源化免疫造血干细胞重建小鼠异种移植物模型，如用人mda-mb-231肿瘤细胞接种的nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj中显示抗肿瘤活性，如延迟的肿瘤长出；例如当如实施例15所述的那样测定时；和此外，根据本发明的抗体是如下的抗体，所述抗体当通过流式细胞术或elisa评估时，不结合白细胞fcγr，并且在缺乏靶物(5t4)特异性肿瘤细胞的情况下不通过结合c1q诱导cd3抗体依赖性fcγr介导的cd3交联。在下文中可以找到具有减少的fc介导的效应器功能或没有fc介导的效应器功能的抗体(“惰性”抗体)的更详细的公开内容。在体外细胞毒性测定法中测定抗体介导sk-ov-3细胞的浓度依赖性细胞毒性的能力，所述测定法包括以下步骤：i)从健康人供体血沉棕黄层中分离pbmc或t细胞，ii)提供第一组样品，其中每个样品包含pbmc和人卵巢腺癌sk-ov-3细胞，并且其中所述样品中pbmc:sk-ov-3细胞的比例为1:2,1:1,2:1,4:1,8:1和12:1；和第二组样品，其中每个样品包含t细胞和人卵巢腺癌sk-ov-3细胞，并且其中所述样品中t细胞:sk-ov-3细胞的比例为1:2,1:1,2:1,4:1和8:1iii)以范围为0.0128ng/ml至1000ng/ml的浓度向每组样品添加所述抗体，并在37℃将所述样品温育72小时；然后iv)使用刃天青(7-羟基-3h-吩恶嗪-3-酮10-氧化物)评估所述sk-ov-3细胞的存活力。可以在包括以下步骤的测定法中测定在mda-mb-231肿瘤细胞存在下在体外活化t细胞的能力：i)从健康人供体血沉棕黄层中分离t细胞，ii)提供一组样品，其中每个样品包含t细胞和人乳腺癌mda-mb-231细胞，并且其中所述样品中t细胞:mda-mb-231细胞的比例为8:1，iii)将所述抗体以范围为0.0128ng/ml至1000ng/ml的浓度添加到该组样品，并在37℃将所述样品温育72小时，iv)通过在4℃与所述抗体一起温育30分钟，用荧光标记的针对t细胞活化标志物的抗体，如cd69-apc、cd25-pe-cy7和cd279/pd1-bv604抗体对所述t细胞染色；并且v)通过流式细胞仪分析所述样品。apc抗人cd69(cd69-apc)抗体可购自例如biolegend(目录号310909和310910)。cd25单克隆抗体pe-cyanine7(cd25-pe-cy7)也可以购自例如thermofisherscientific(目录号25-0259-42)和bdbiosciences(目录号557741)。最后，cd279/pd1-bv604抗体可以购自genscript(目录号a01828)。可以通过包括以下步骤的程序测定在bxpc-3、panc-1、caski和/或siha肿瘤细胞的存在下体外活化t细胞：i)提供从健康人类供体血沉棕黄层分离的t细胞，ii)提供一组样品，其中每个样品包含所述t细胞和bxpc-3、panc-1、caski或siha肿瘤细胞，并且其中所述样品中t细胞:肿瘤细胞的比例为4:1，iii)将所述抗体以范围为0.0128ng/ml至5000ng/ml的浓度(例如5倍稀释)添加到该组样品，并在37℃将所述样品温育72小时，iv)从每个样品中收集110μl含t细胞的上清液，并用针对t细胞标志物的荧光标记的抗体，如cd3-efluor450、cd4-apc-efluor780、dc8-af700，和用针对t细胞标志物的抗体，如69-apc、cd25-pe-cy7和cd279/pd1-bv604抗体对t细胞进行染色，通过在4℃与所述抗体温育30分钟进行；并且v)通过流式细胞仪分析所述样品。可以通过包括以下步骤的程序测定诱导bxpc-3、panc-1、caski和/或siha肿瘤细胞的细胞毒性的能力：i)提供从健康人类供体血沉棕黄层分离的t细胞，ii)提供一组测试样品和对照样品，其中每个样品包含已经允许粘附至96孔组织培养板底部的bxpc-3、panc-1、caski或siha肿瘤细胞和所述t细胞，并且其中所述样品中的t细胞:肿瘤细胞的比例为4:1，iii)将所述抗体以范围为0.0128ng/ml到5000ng/ml的浓度(例如5倍稀释)添加到该组测试样品，而所述对照样品保持未处理或与5μm星形孢菌素一起温育，然后在37℃将所有样品温育72小时，iv)在补充有10％(w/w)含铁的供体牛血清和青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基中的10％(w/w)7-羟基-3h-吩恶嗪-3-酮10-氧化物(刃天青)中在37℃温育粘附细胞4小时，v)测量所述细胞的吸光度；将与星形孢菌素温育的细胞的吸光度设置为0％存活力，并且将未处理的细胞的吸光度设置为100％存活力，并且如下计算活细胞百分比：本发明的抗体可以特别地是抗体，其中能够结合cd3的抗原结合区包括：a)包含分别具有以seqidno:61、55和56所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[vhcdr1-t31p+野生型vhcdr2，3]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或b)包含分别具有以seqidno:63、55和56所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[vhcdr1-t31m+野生型vhcdr2，3]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或c)包含分别具有以seqidno:54、65和56所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[vhcdr-n57e+野生型vhcdr1，3]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或d)包含分别具有以seqidno:54、55和67所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-h101g]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或e)包含分别具有以seqidno:54、55和69所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-h101n]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或f)包含分别具有以seqidno:54、55和71所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-g105p]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或g)包含分别具有以seqidno:54、55和73所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-s110a]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或h)包含分别具有以seqidno:54、55和75所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-s110g]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或i)包含分别具有以seqidno:54、55和77所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-y114v]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或j)包含分别具有以seqidno:54、55和79所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-y114m]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)，或k)包含分别具有以seqidno:54、55和81所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-y114r]的重链可变区(vh)和包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]的轻链可变区(vl)。在某些实施方案中，能够结合cd3的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别具有以seqidno:54、55和67所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-h101g]，所述轻链可变区包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]。此外，本发明提供了如上所定义的抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别为seqidno.:6、7和8的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区包含分别为seqidno:10、aas和seqidno:11的cdr1、cdr2和cdr3序列[059]，和所述能够结合cd3的抗原结合区包含重链可变(vh)区和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别具有以seqidno:54、55和67所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-h101g]，所述轻链可变区包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]。本发明还提供了如上定义的抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别为seqidno.:41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区包含分别为seqidno:45、das和seqidno:46的cdr1、cdr2和cdr3序列[207]，和所述能够结合cd3的抗原结合区包含重链可变(vh)区和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别具有以seqidno:54、55和67所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-h101g]，所述轻链可变区包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]。此外，本发明提供了如上所定义的抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别为seqidno.:48、49和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，所述轻链可变区包含分别为seqidno:52、das和seqidno:53的cdr1、cdr2和cdr3序列[226]，和所述能够结合cd3的抗原结合区包含重链可变(vh)区和轻链可变区(vl)，所述重链可变区包含分别具有以seqidno:54、55和67所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vhcdr1，2+vhcdr3-h101g]，所述轻链可变区包含分别具有以seqidno:58所示的序列、序列gtn和以seqidno:59所示的序列的cdr1、cdr2和cdr3[野生型vlcdr1、2、3]。在本发明的抗体中，能够结合人cd3的抗原结合区可以包含选自下组的vh序列和vl序列：a)以seqidno:62所示的vh序列[vht31p]和以seqidno:60所示的vl序列，b)以seqidno:64所示的vh序列[vht31m]和以seqidno:60所示的vl序列，c)以seqidno:66所示的vh序列[vhn57e]和以seqidno:60所示的vl序列，d)以seqidno:68所示的vh序列[vhh101g]和以seqidno:60所示的vl序列，e)以seqidno:70所示的vh序列[vhh101n]和以seqidno:60所示的vl序列，f)以seqidno:72所示的vh序列[vhg105p]和以seqidno:60所示的vl序列，g)以seqidno:74所示的vh序列[vhs110a]和以seqidno:60所示的vl序列，h)以seqidno:76所示的vh序列[vhs110g]和以seqidno:60所示的vl序列，i)以seqidno:78所示的vh序列[vhy114v]和以seqidno:60所示的vl序列，j)以seqidno:80所示的vh序列[vhy114m]和以seqidno:60所示的vl序列；和k)以seqidno:82所示的vh序列[vhy114r]和以seqidno:60所示的vl序列。特别地，根据本发明的抗体可以是如下的抗体，其中能够结合人cd3的抗原结合区包含以seqidno:68所示的vh序列[vhh101g]和以seqidno:60所示的vl序列。在一些实施方案中，根据本发明的抗体是如下的抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)，该重链可变区包含seqidno:5的序列或与seqidno:5的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[059]；和所述能够结合人cd3的抗原结合区包含以seqidno:68所示的vh序列[vhh101g]和以seqidno:60所示的vl序列。在其他实施方案中，根据本发明的抗体是如下的抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)，该重链可变区包含seqidno:40的序列或与seqidno:40的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[207]；和所述能够结合人cd3的抗原结合区包含以seqidno:68所示的vh序列[vhh101g]和以seqidno:60所示的vl序列。在其他实施方案中，根据本发明的抗体是如下的抗体，其中所述能够结合5t4的抗原结合区包含重链可变区(vh)，该重链可变区包含seqidno:47的序列或与seqidno:47的序列具有至少90％、至少95％、至少97％或至少99％氨基酸序列同一性的序列[226]；和所述能够结合人cd3的抗原结合区包含以seqidno:68所示的vh序列[vhh101g]和以seqidno:60所示的vl序列。如技术人员公知的是，抗体的每个抗原结合区通常包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，并且其中每个可变区包含三个cdr序列，分别为cdr1、cdr2和cdr3，以及四个框架序列，分别为fr1、fr2、fr3和fr4。该结构也可以在根据本发明的抗体中发现。此外，根据本发明的抗体可以包含两个重链恒定区(ch)和两个轻链恒定区(cl)。在特定的实施方案中，根据本发明的抗体包含第一和第二重链，如第一和第二重链，其各自至少包含铰链区、ch2和ch3区。可以例如通过如wo2008/119353和wo2011/131746中提供的所谓fab臂交换，基于两个同源二聚体起始蛋白以高产量获得稳定的异源二聚体抗体，所述同源二聚体起始蛋白仅在ch3区中含有几个不对称突变。因此，在本发明的一些实施方案中，抗体，第一重链，其中与选自人igg1重链中t366、l368、k370、d399、f405、y407和k409的位置相对应的位置处的至少一个氨基酸已经被取代，和第二重链，其中与选自人igg1重链中t366、l368、k370、d399、f405、y407和k409的位置相对应的位置中的至少一个氨基酸已经被取代，其中所述第一和所述第二重链的所述取代不在同一位置中，并且其中所述氨基酸位置根据eu编号编号。在特定的实施方案中，本发明提供了抗体，其中与人igg1重链中的k409相对应的位置中的氨基酸在所述第一重链中为r，而与人igg1重链中的f405相对应的位置中的氨基酸在所述第二条重链中为l，反之亦然。在一些实施方案中，根据本发明的抗体除抗原结合区之外还包含由两条重链的fc序列组成的fc区。第一和第二fc序列可以各自具有任何同种型，包括任何人同种型，例如igg1、igg2、igg3、igg4、ige、igd、igm或iga同种型或混合同种型。优选地，fc区是人igg1、igg2、igg3、igg4同种型或混合同种型，例如人igg1同种型。根据本发明的抗体可在fc区中包含修饰以使抗体成为惰性或非活化性抗体。因此，在本文公开的抗体中，可以修饰一条或两条重链，使得相对于除了包含未修饰的第一和第二重链之外相同的抗体，抗体在更小程度上诱导fc介导的效应器功能。可以通过测定t细胞上的fc介导的cd69表达(即，由于cd3抗体介导的、fcγ受体依赖性的cd3交联而产生的cd69表达)，通过与fcγ受体结合，通过与c1q结合，或通过诱导fc介导的fcγr交联来测量fc介导的效应器功能。特别地，可以修饰重链恒定序列，使得在与野生型(未修饰的)抗体相比时，将fc介导的cd69表达降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或100％，其中在基于pbmc的功能测定法中测定所述fc介导的cd69表达，如wo2015001085的实施例3中所述。重链和轻链恒定序列的修饰也可导致c1q与所述抗体的结合减少。与未修饰的抗体相比，可以减少至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，并且可以通过elisa测定c1q结合。此外，可以修饰fc区，使得与未修饰的抗体相比，所述抗体介导降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或100％的fc介导的t细胞增殖，其中在基于pbmc的功能测定中测量所述t细胞增殖。可以被修饰的氨基酸位置(例如igg1同种型抗体中)的实例包括位置l234和l235。因此，根据本发明的抗体可以包含第一和第二重链，并且其中在所述第一和第二重链两者中，与根据eu编号的人igg1重链中的位置l234和l235相对应的位置处的氨基酸残基分别为f和e。另外，d265a氨基酸取代可减少与所有fcγ受体的结合并防止adcc(shieldsetal.,2001,j.biol.chem.(276):6591-604)。因此，根据本发明的抗体可以包含第一和第二重链，其中在第一和第二重链两者中，与根据eu编号的人igg1重链中的位置d265对应的位置处的氨基酸残基是a。本发明的进一步的实施方案提供了抗体，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，例如在两者中，在与人igg1重链中的位置l234、l235和d265相对应的位置中的氨基酸分别是f、e和a。在本申请中，具有三个氨基酸取代l234f、l235e和d265a的组合和另外上文公开的k409r或f405l突变的抗体分别以后缀“fear”或“feal”称谓。野生型igg1重链恒定区的氨基酸序列在本文中被鉴定为seqidno:89。与以上公开的实施方案一致，本发明的抗体可以包含携带f405l取代并具有以seqidno:90所示的氨基酸序列的igg1重链恒定区和/或携带k409r取代并具有以seqidno:94所示的氨基酸序列的igg1重链恒定区。携带l234f、l235e和d265a取代的igg1重链恒定区的氨基酸序列在本文中被鉴定为seqidno:91。携带l234f、l235e、d265a和f405l取代的igg1重链恒定区的氨基酸序列在本文中鉴定为seqidno:92。携带l234f、l235e、d265a和k409r取代的igg1重链恒定区的氨基酸序列在本文中鉴定为seqidno:93。本发明进一步提供了抗体，其中a)所述能够结合5t4的抗原结合区是人源化的，和/或b)若存在的话，所述能够结合cd3的抗原结合区是人源化的。另外，本发明提供了抗体，其中a)所述能够结合5t4的抗原结合区是人的，和/或b)若存在的话，所述能够结合cd3的抗原结合区是人的。此外，本发明提供了抗体，其中a)所述能够结合5t4的抗原结合区是嵌合的，和/或b)若存在的话，所述能够结合cd3的抗原结合区是嵌合的。在本发明的一些实施方案中，抗体包含kappa(κ)轻链。在本发明特定实施方案中关于双特异性抗体的序列，kappa轻链包含如上文公开的5t4抗体轻链的cdr1、-2和-3序列。在本发明的进一步实施方案中，根据前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体包含lambda(λ)轻链。在关于双特异性抗体的本发明的特定实施方案中，lambda轻链包含如上文公开的cd3抗体轻链的cdr1，-2和-3序列，特别是如上文公开的对cd3具有降低的亲和力的cd3抗体的cdr1，-2和-3序列。在本文中以seqidno:95包括kappa轻链恒定区的氨基酸序列，并且在本文中以seqidno:96包括lambda轻链恒定区。在特定的实施方案中，抗体包含lambda(λ)轻链和kappa(κ)轻链；例如抗体，其具有包含能够结合cd3的结合区的重链和lambda轻链；以及包含能够结合5t4的结合区的重链和kappa轻链。免疫缀合物在另一方面，本发明提供了免疫缀合物或抗体-药物缀合物(adc)，其包含上文定义的抗体，以及治疗部分，例如细胞毒剂、化学治疗药物、细胞因子、免疫抑制剂、抗生素或放射性同位素。一般而言，技术人员将根据免疫缀合物的期望的应用来处置许多细胞毒剂、化学治疗药物、细胞因子、免疫抑制剂、抗生素和放射性同位素，治疗部分的最佳选择。对于某些应用，优选的细胞毒剂可以是微管破坏剂，例如duostatin，例如duostatin-3。核酸构建体本发明的另一方面提供了核酸构建体，其包含a)编码包含如前文定义的能够结合5t4的抗原结合区的抗体重链序列的核酸序列，和/或b)编码包含如前文定义的能够结合5t4的抗原结合区的抗体轻链序列的核酸序列。核酸构建体可以进一步包含a)编码包含如前文定义的能够结合cd3的抗原结合区的抗体重链序列的核酸序列，和/或b)编码包含如前文定义的能够结合cd3的抗原结合区的抗体轻链序列的核酸序列。表达载体本发明的另一方面提供了表达载体，其包含编码根据本发明的抗体的重链和/或轻链序列的核酸序列。特别地，表达载体可以包含：a)编码包含如前文定义的能够结合5t4的抗原结合区的抗体重链序列的核酸序列，和/或b)编码包含如前文定义的能够结合5t4的抗原结合区的抗体轻链序列的核酸序列。表达载体可以进一步包括：a)编码包含如前文定义的能够结合cd3的抗原结合区的抗体重链序列的核酸序列，和/或b)编码包含如前文定义的能够结合cd3的抗原结合区的抗体轻链序列的核酸序列。在另一个实施方案中，表达载体还包含编码抗体如人igg1，κ单克隆抗体的轻链、重链或轻链和重链两者的恒定区的恒定区的核酸序列。在本发明的上下文中，表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体、非染色体和合成核酸载体(包含合适的表达控制元件组的核酸序列)。此类载体的实例包括sv40的衍生物、细菌质粒、噬菌体dna、杆状病毒、酵母质粒，源自质粒和噬菌体dna的组合的载体，以及病毒核酸(rna或dna)载体。在一个实施方案中，编码抗5t4抗体的核酸包含在裸dna或rna载体中，所述裸dna或rna载体包括例如线性表达元件(例如如记载于sykesandjohnston,natbiotech17,355-59(1997))，紧实的核酸载体(例如如记载于us6,077,835和/或wo00/70087)，质粒载体，例如pbr322，puc19/18或puc118/119，“蚊(midge)”最小程度尺寸的核酸载体(如记载于schakowskietal.,molther3,793-800(2001))，或作为沉淀的核酸载体构建体，如cap04沉淀的构建体(如记载于例如wo00/46147,benvenistyandreshef,pnasusa83,9551-55(1986),wigleretal.,cell14,725(1978)和coraroandpearson,somaticcellgenetics7,603(1981))。此类核酸载体及其用途是本领域公知的(参见例如us5,589,466和us5,973,972)。在一个实施方案中，该载体适合在细菌细胞中表达抗5t4抗体。此类载体的实例包括表达载体，例如bluescript(stratagene)，pin载体vanheeke&schuster,jbiolchem264,55035509(1989),pet载体(novagen,madisonwi)等)。此外/或者，表达载体可以是适合在酵母系统中表达的载体。可以采用适合在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子，例如alpha因子，醇氧化酶和pgh的载体(综述于：f.ausubeletal.,ed.currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingandwileyintersciencenewyork(1987)和grantetal.,methodsinenzymol153,516544(1987))。核酸构建体和/或载体也可以包含编码分泌/定位序列的核酸序列，所述分泌/定位序列可以将诸如新生多肽链的多肽靶向到周质空间或进入细胞培养基中。此类序列是本领域已知的，并且包括分泌前导物或信号肽、细胞器靶向序列(例如，核定位序列、er保留信号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚序列(例如，终止转运序列、gpi锚定序列)等。在本发明的表达载体中，编码抗5t4抗体的核酸可以包含任何合适的启动子、增强子和其他表达促进元件或与之相关。此类元件的实例包括强表达启动子(例如人cmvie启动子/增强子以及rsv、sv40、sl3-3、mmtv和hivltr启动子)、有效的poly(a)终止序列、大肠杆菌中质粒产品的复制起点、作为选择标志物的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，多接头)。与诸如cmvie的组成型启动子相反，核酸还可以包含诱导型启动子(技术人员将认识到，这些术语实际上是在某些条件下基因表达程度的描述符)。在一个实施方案中，可以将编码抗5t4抗体的表达载体通过病毒载体定位在宿主细胞或宿主动物中和/或递送至宿主细胞或宿主动物。细胞和宿主细胞在进一步的方面，本发明提供了细胞，其包含如上文定义的核酸构建体或如上文定义的表达载体。应当理解，细胞可以通过用所述核酸构建体或表达载体转染宿主细胞而获得，如重组宿主细胞。宿主细胞可以是人类来源的，例如人类胚胎肾(hek)细胞，如hek/expi细胞。或者，它可以是啮齿动物来源的，例如中国仓鼠卵巢细胞，如cho/n50细胞。此外，宿主细胞可以是细菌来源的。细胞可以包含稳定整合到细胞基因组中的编码本发明的抗体或其部分的核酸序列。或者，细胞可包含非整合核酸，例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件，其包含编码本发明抗5t4抗体或其部分表达的序列。特别地，宿主细胞可以包含非整合的核酸，例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件，其包含编码抗5t4抗体或其部分表达的序列。组合物本发明的进一步的方面提供了组合物，其包含抗体；例如如上文定义的双特异性抗体或免疫缀合物。组合物可以是包含抗体、双特异性抗体或免疫缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。可以根据常规技术，例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第19版,gennaro,ed.,mackpublishingco.,easton,pa,1995中公开的技术将药物组合物与载体、赋形剂和/或稀释剂以及适合于药物组合物的任何其他组分，包括已知的佐剂一起配制。药学上可接受的载体或稀释剂以及任何已知的佐剂和赋形剂应适合于本发明的抗体或抗体缀合物以及所选择的施用模式。基于对本发明的所选化合物或药物组合物的所需生物学特性没有明显负面影响(例如，对抗原结合的小于实质影响[10％或更小相对抑制，5％或更小相对抑制等])，确定药物组合物的载体和其他组分的适用性。本发明的药物组合物可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、去污剂(例如非离子去污剂，例如tween-20或tween-80)、稳定剂(例如糖或不含蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或其他适合包含在药物组合物中的材料。可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得对于特定患者、组合物和施用方式有效达到所需治疗响应而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物或其酰胺的活性，施用途径，施用时间，所用特定化合物的排出速率，治疗持续时间，与所用特定组合物结合使用的其他药物，化合物和/或材料，所治疗患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康和既往病史，以及医学领域中公知的类似因素。药学上可接受的载体包括与本发明的化合物在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂，等张剂，抗氧化剂和吸收延迟剂等。可以在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及它们的合适混合物、植物油(例如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射的有机酯如油酸乙酯和/或各种缓冲剂。其他载体在制药领域是众所周知的。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本发明的药物组合物中。本发明的药物组合物还可包含药学可接受的的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基茴香醚(bha)，丁基化羟基甲苯(bht)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸，乙二胺四乙酸(edta)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸。本发明的药物组合物还可在组合物中包含等张剂，例如糖，多元醇，例如甘露醇，山梨糖醇，甘油或氯化钠。本发明的药物组合物还可包含一种或多种适合于所选施用途径的佐剂，例如防腐剂，湿润剂，乳化剂，分散剂，防腐剂或缓冲剂，它们可以增强药物组合物的货架期或有效性。本发明的化合物可以与保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物，透皮贴剂和微囊化递送系统。此类载体可以包括明胶，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，可生物降解的生物相容性聚合物，例如单独或与蜡一起使用的乙烯乙酸乙烯酯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸，或本领域公知的其他材料。制备此类制剂的方法是本领域技术人员通常已知的，参见例如sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson,ed.,marceldekker,inc.,newyork,1978。在一个实施方案中，可以配制本发明的化合物以确保在体内的适当分布。用于胃肠外施用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本发明的药物组合物中。也可以将其他活性或治疗化合物掺入组合物中。注射用药物组合物通常必须在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液，微乳液，脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是含水或非水溶剂或分散介质，其包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油例如橄榄油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖，多元醇如甘油，甘露醇，山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物在根据需要具有一种成分或多种成分的组合(例如，如上文列举)的适当的溶剂中掺入，随后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和所需要的其他成分(例如，来自从上文列举的那些)的无菌媒介物中制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他期望成分的粉末。无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物在根据需要具有上文列举的一种成分或多种成分的组合的适当的溶剂中掺入，随后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和来自从上文列举的那些的所需要的其他成分的无菌媒介物中制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他期望成分的粉末。本发明的药物组合物可包含本发明的抗体、双特异性抗体或抗体-药物缀合物(adc)，根据本发明的抗体、双特异性抗体或adc与另一种治疗化合物的组合或本发明化合物的组合。药物组合物可以通过任何合适的途径和方式施用。体内和体外施用本发明化合物的合适途径是本领域众所周知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。在一个实施方案中，胃肠外施用本发明的药物组合物；即通过肠内和局部施用以外的施用方式；通常通过注射，包括表皮、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射以及输注。特别地，本发明的药物组合物可以通过静脉内或皮下注射或输注施用。用途和治疗应用本发明进一步提供了用作药物的如本文定义的抗体，例如双特异性抗体，或免疫缀合物或抗体-药物缀合物(adc)。本发明的抗5t4抗体或免疫缀合物可以用于治疗或预防涉及表达5t4的细胞的疾病或病症。特别地，根据本发明的双特异性抗体；即，包含能够结合5t4和cd3的抗原结合区的抗体可在治疗环境中有用，在治疗环境中需要表达5t4的细胞的特异性靶向和t细胞介导的杀伤，并且与常规抗5t4相比，它们可以在某些此类适应症和环境中更有效。在一个实施方案中，本文公开了用于治疗癌症的本发明的抗体，例如双特异性抗体，或免疫缀合物或抗体-药物缀合物(adc)。抗体，例如双特异性抗体，或免疫缀合物或抗体-药物缀合物(adc)可特别用于治疗癌症，其中所述癌症的特征在于在至少一些肿瘤细胞中的5t4表达。癌症尤其可以选自肾脏/肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫/子宫内膜/宫颈癌、肺癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、头和颈癌、淋巴瘤、急性髓样白血病。。另外，本发明涉及根据本发明的抗体在制备药物中的用途，所述药物例如是用于治疗癌症的药物，例如选自下组的癌症：肾脏/肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫/子宫内膜/宫颈癌、肺癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、头和颈癌、淋巴瘤、急性髓样白血病。。在另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法，该方法包括将本发明的抗体，免疫缀合物，组合物如药物组合物或抗体-药物缀合物(adc)施用于有此需要的受试者。在本发明的特定实施方案中，所述方法用于治疗癌症。本发明的方法特别包括以下步骤：a)选择患有包含表达5t4的肿瘤细胞的癌症和/或已知表达5t4的癌症的受试者；和b)向受试者施用抗体，例如本发明的双特异性抗体，药物组合物或抗体-药物缀合物(adc)。所述癌症特别可以选自肾脏/肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫/子宫内膜/宫颈癌、肺癌、胃肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、头和颈癌、淋巴瘤、急性髓样白血病。。调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度指示按比例减少或增加剂量。胃肠外组合物可以配制成剂量单位形式，以易于施用和剂量均匀。抗体的有效剂量和剂量方案取决于要治疗的疾病或状况，并且可以由本领域技术人员确定。本发明化合物的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.001-10mg/kg，诸如约0.001-5mg/kg，例如约0.001-2mg/kg，诸如约0.001-1mg/kg，例如约0.001、约0.01、约0.1、约1或约10mg/kg。本发明的抗体的治疗有效量的另一个示例性的非限制性范围是约0.1-100mg/kg，诸如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，例如约0.1-10mg/kg，例如约0.5，例如约0.3、约1、约3、约5、或约8mg/kg。具有本领域普通技术的医师可以容易地确定并开出所需要的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以比实现期望治疗效果所需要的水平更低的水平开始在药物组合物中使用的抗体剂量，并逐渐增加剂量直至实现期望的效果。通常，本发明的抗体的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用可以例如是胃肠外的，例如静脉内，肌肉内或皮下的。在一个实施方案中，可以通过以mg/m2计算的每周剂量通过输注来施用抗体。此类剂量可以例如基于上文根据以下提供的mg/kg剂量：剂量(mg/kg)x70:1.8。此类施用可以重复例如1至8次，例如3至5次。可以通过2至24小时，例如2至12小时的时段内持续输注进行施用。在一个实施方案中，可以通过长时间(例如超过24小时)内缓慢连续输注来施用抗体，以减少毒性副作用。在一个实施方案中，当一周一次给予时，抗体可以以以固定剂量计算的每周剂量施用直至8次，例如4至6次。此类方案可以根据需要重复一次或多次，例如在6个月或12个月后。此类固定剂量可以例如基于以上提供的mg/kg剂量，体重估计为70kg。可以通过例如取出生物样品并使用靶向本发明抗体的5t4抗原抗原结合区的抗独特型抗体，测量施用后血液中本发明的抗体的量确定或调节剂量。在一个实施方案中，可以将抗体作为维持疗法施用，诸如例如每周一次，持续6个月或更长时间。还可以预防性地施用抗体以降低发生癌症的风险，延迟癌症进展中事件的发生和/或降低癌症缓解时复发的风险。本发明的抗体也可以在联合疗法中施用，即与对于要治疗的疾病或病状相关的其他治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含有抗体的药物用于与一种或多种其他治疗剂组合，例如细胞毒剂，化学治疗剂或抗血管生成剂。抗体产生本文还提供了产生抗体，例如本发明的双特异性抗体的方法。特别地，提供了用于产生本发明的抗体的方法，包括以下步骤：a)培养包含如本文定义的表达载体的宿主细胞；和b)并从培养基中纯化所述抗体。在本发明的实施方案中，其中抗体包含能够结合5t4的结合区和能够结合cd3的结合区，可以使用包含以下步骤的方法产生抗体：a)提供能够结合5t4的抗体，通过在允许表达所述能够结合5t4的抗体的条件下培养包含如本文所定义的表达载体的宿主细胞，并从培养基中纯化所述能够结合5t4的抗体进行；b)提供能够结合cd3的抗体，通过在允许表达所述能够结合cd3的抗体的条件下培养包含表达载体的宿主细胞，并且从培养基中纯化所述能够结合cd3的抗体进行，所述表达载体包含i)核酸序列，其编码包含如本文所定义的能够结合cd3的抗原结合区的抗体的重链序列，和ii)核酸序列，其编码包含如本文所定义的能够结合cd3的抗原结合区的抗体的轻链序列；c)在足以允许铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下，将所述能够结合5t4的抗体与所述能够结合cd3的抗体一起温育，并且d)获得所述抗体。试剂盒本发明进一步提供了包含如上公开的抗体的试剂盒，如用作伴随诊断/用于在患者群体内鉴定那些具有响应用如本文所定义的抗体或如本文所定义的免疫缀合物或抗体-药物缀合物(adc)的治疗的倾向的患者，或用于预测所述抗体或免疫缀合物或adc在用于治疗患者时的功效的试剂盒，所述试剂盒包含如本文所定义的抗体；以及所述试剂盒的使用说明。抗独特型抗体在另一方面，本发明涉及抗独特型抗体，其结合包含至少一个能够结合5t4的抗原结合区的抗体，即本文所述的根据本发明的抗体。在特定的实施方案中，抗独特型抗体结合能够结合5t4的抗原结合区。抗独特型(id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。抗id抗体可以通过用制备抗id针对的单克隆抗体免疫与抗5t4单克隆抗体的来源相同物种和遗传类型的动物来制备。通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗id抗体)，被免疫的动物通常可以识别并响应免疫抗体的独特型决定簇。此类抗体描述于例如us4,699,880。此类抗体是本发明的进一步特征。抗id抗体也可以用作“免疫原”以在另一只动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗抗id抗体。抗抗id抗体可以在表位上与诱导抗id抗体的原始单克隆抗体相同。因此，通过使用针对单克隆抗体的独特型决定簇的抗体，可以鉴定表达相同特异性抗体的其他克隆。抗id抗体可以通过任何合适的技术来变化(从而产生抗id抗体变体)和/或衍生化，例如通过本文中其他地方针对本发明的5t4特异性抗体描述的那些技术。例如，可以将单克隆抗id抗体与诸如匙孔血蓝蛋白(klh)之类的载体缀合，并用于免疫balb/c小鼠。来自这些小鼠的血清通常会含有抗-抗-id抗体，所述抗体与原始/亲本-5t4抗体具有相似(若不同的话)的结合特性。序列通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。实施例实施例1-生成5t4抗体和筛选材料5t4的表达构建体产生以下用于各种全长5t4变体表达的密码子优化的构建体：人(智人)5t4(uniprot登录号q13641)、食蟹猴(成束猴)5t4(uniprot登录号q4r8y9)和鸡(原鸡)5t4(uniprot登录号r4gm46)。另外，产生了用于各种5t4细胞外域(ecd)变体的以下密码子优化的构建体：具有c端his标签的人5t4的ecd(来自uniprot登录号q13641的aa1-355)(5t4ecdhis)(seqidno:99)，以及与兔fc域和c端his-标签融合的人5t4的ecd(aa1-91)(5t4ecd91-fcrbhis)。在seqidno:99中，氨基酸残基1-31为信号肽；因此，成熟的5t4ecdhis蛋白对应于seqidno:99的氨基酸残基32-363。同样，seqidno:100的氨基酸残基1-31是信号肽，而成熟的5t4ecd91-fcrbhis蛋白对应于seqidno:100的氨基酸残基32-327。构建体含有适合于克隆的限制性位点和最佳的kozak(gccgccacc)序列(kozak,m.,gene1999；234(2):187-208)。将全长人5t4和食蟹猴5t4密码子优化的构建体克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.3(invitrogen)中。将全长鸡5t4密码子优化的构建体克隆到psb(哺乳动物表达载体，其含有sleepingbeauty反向末端重复序列，其在由cmv启动子和hsv-tkpolya信号组成的表达盒侧翼)中。瞬时表达全长人、食蟹猴或鸡5t4的hek-293f细胞系的生成从invitrogen(目录号r790-07)获得freestyletm293-f(适合悬浮生长和化学成分确定的freestyle培养基[hek-293f]的hek-293亚克隆)细胞，并用上述密码子优化的构建体使用293fectin(invitrogen，目录号12347-019)根据制造商的说明转染。加his标签的5t4的纯化如上所述，在hek-293f细胞中表达5t4ecdhis(seqidno:99的成熟蛋白)。使用expi293f表达平台((thermofisherscientific,waltham,ma,usa，目录号a14527)基本上如制造商所述表达5t4ecd91-fcrbhis。his标签实现用固定化的金属亲和层析的纯化。在此过程中，固定到层析树脂上的螯合剂充满co2+阳离子。含有加组氨酸标签的蛋白质的上清液与树脂以分批方式(即溶液)温育。加his标签的蛋白质强烈结合树脂珠，而与加his标签的蛋白质相比，培养上清液中存在的其他蛋白质不结合或弱结合。温育后，从上清液中回收珠，并填充到柱中。洗涤柱以去除弱结合的蛋白质。然后，用含有咪唑的缓冲液洗脱强烈结合的加his标签的蛋白质，该缓冲液竞争his与co2+的结合。通过在脱盐柱上交换缓冲液除去洗脱液。免疫为了产生抗体igg1-5t4-207和igg1-5t4-226，在间隔14天的情况下交替地在腹膜内(ip)和皮下(sc)用sigma佐剂系统(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa，目录号s6322)中20μg5t4ecdhis蛋白对hco17-balbc转基因小鼠(bristol-myerssquibb,newyork,ny,usa)进行免疫。总共进行8次免疫：4次ip和4次sc。为了产生抗体igg1-5t4-076和igg1-5t4-059，在间隔14天的情况下交替地以ip和sc用sigma佐剂系统中20μg5t4ecdhis蛋白对hco12-balbc(igg1-5t4-076)和hco20-balbc(igg1-5t4-059)的转基因小鼠(bristol-myerssquibb)进行免疫。总共进行8次免疫：4次ip和4次sc。为了产生抗体igg1-5t4-085，在间隔14天的情况下交替地以ip和sc用sigma佐剂系统中20μg5t4ecdhis蛋白和20μg5t4ecd91-fcrbhis成熟蛋白对hco17-balbc转基因小鼠进行免疫。总共进行8次免疫：4次ip和4次sc。为了产生抗体igg1-5t4-106和igg1-5t4-127，在间隔14天的情况下交替地以ip和sc用sigma佐剂系统中20μg5t4ecd91-fcrbhis成熟蛋白对hco12-balbc(igg1-5t4-106)和hco17-balbc(igg1-5t4-127)转基因小鼠进行免疫。总共进行8次免疫：4次ip和4次sc。将如下所述在抗原特异性筛选荧光测量微体积测定技术(fmat)中具有至少两个连续5t4特异性抗体滴度的小鼠用10μg5t4ecdhis或10μg5t4ecd91-fcrbhis(静脉内注射的pbs中)加强，并且在3-4天后将这些小鼠的脾细胞和淋巴结细胞融合。均质抗原特异性筛选测定使用fmat(appliedbiosystems，fostercity，ca，usa)通过均质抗原特异性筛选测定法测定免疫小鼠血清或humab(人类单克隆抗体)杂交瘤或转染瘤培养上清液中5t4抗体的存在。为此，使用4种基于细胞的测定法的组合。对来自免疫小鼠的血清或杂交瘤或转染瘤培养上清液样品分析人抗体与瞬时表达人5t4的hek-293f细胞，瞬时表达食蟹猴5t4的hek-293f细胞，用5t4ecd91-fcrbhis包被的经链霉亲合素包被的聚苯乙烯颗粒(0.5％w/v；6.7μm；spherotech,lakeforest,il,usa,目录号svp-60-5)和hek-293野生型细胞(阴性对照)的结合。将样品添加到细胞以允许结合5t4。随后，使用荧光缀合物(affinipure山羊抗人类iggfc647；jacksonimmunoresearch，目录号109-605-098)检测humab的结合。igg1-5t4-h8-f405l用作阳性对照，并且chrompure人igg全分子(jacksonimmunoresearch，目录号009-000-003)用作阴性对照。使用imagexpressvelos(moleculardevices，llc，sunnyvale，ca，usa)对样品进行扫描，并总荧光用作读数。当计数高于50且计数x荧光比阴性对照高至少三倍时，样品描述为阳性。humab杂交瘤的产生处死具有足够抗原特异性滴度形成的humab小鼠(如上所述)，并收集腹主动脉和腔静脉侧翼的脾和淋巴结。使用cytopulseceef50电融合系统(cellectis,paris,france)基本上根据制造商的说明通过电融合将脾细胞和淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(sp2.0细胞)融合。接下来，使用clonepix系统(genetix,hampshire,uk)将抗原阳性的初级孔亚克隆。为此，将特定的原代孔杂交瘤接种到由40％clonemedia(genetix,hampshire,uk)和60％hyq2x完全培养基(hyclone，waltham，usa)制成的半固体培养基中。如上所述，根据抗原特异性结合测定法对亚克隆重新测试5t4结合，并使用isocyte系统(moleculardevices)进行扫描。使用octet系统(fortebio,menlopark,usa)测量igg水平，以便选择每个初级孔的最佳生产克隆进行进一步扩增。基于标准方案(例如，如在coliganj.e.,bierer,b.e.,margulies,d.h.,shevach,e.m.andstrober,w.编currentprotocolsinimmunology,johnwiley&sons,inc.,2006中所描述)，对所得的humab杂交瘤进行进一步的扩增和培养。5t4抗体可变域的序列分析和表达载体中的克隆从2至5x106个杂交瘤细胞中制备总rna，并使用smartracecdna扩增试剂盒(clontech)根据制造商的说明，从100ng总rna中制备5'-race互补dna(cdna)。通过pcr扩增vh和vl编码区，并且通过不依赖于连接的克隆(aslanidis,c.andp.j.dejong,nucleicacidsres1990；18(20):6069-74)直接以符合读码框的方式克隆到p33g1f和p33kappa表达载体(分别具有密码子优化的人igg1m(f)和kappa恒定域的基于pcdna3.3的载体)中。对来自这些表达载体的可变域进行测序，并根据imgt的定义(lefrancmp.etal.,nucleicacidsresearch,27,209-212,1999andbrochetx.nucl.acidsres.36,w503-508(2008))注释cdr。表达具有正确的可读框(orf)的克隆并测试与抗原的结合。前导组以密码子优化的序列订购(geneart，thermofisherscientific)，并根据制造商的说明(thermofisherscientific)用expi293表达系统产生。纯化这些上清液中的抗体，并用于功能表征。所得的前导克隆的序列在上表中显示。5t4对照抗体在一些实施例中，使用先前在wo2007/106744中描述的针对5t4的比较抗体(igg1-5t4-h8，igg1-5t4-a3和igg1-5t4-a1)。合成经密码子优化的抗体编码序列，并克隆到pcdna3.3表达载体(thermofisherscientific)中。igg1-b12抗体在一些实施例中，抗体b12，hiv-1gp120特异性抗体(barbas,cf.jmolbiol.1993apr5；230(3):812-23)用作阴性对照。合成用于此对照抗体的密码子优化的抗体编码序列，并克隆到pcdna3.3表达载体(thermofisherscientific)中。在本文分别以seqidno:97和98包括重链可变(vh)区的序列和轻链可变(vl)区的序列。实施例2–使用生物层干涉测量法测定5t4特异性抗体的结合亲和力在octethtx仪器(fortebio,portsmouth,uk)上使用无标记物的生物层干涉测量法测定5t4抗体对重组5t4蛋白的亲和力。将5t4抗体(1μg/ml)在抗人iggfc捕捉生物传感器(fortebio)上固定化600秒。在基线测量(100s)之后，在30℃以1000rpm摇动的情况下使用起始于3.58μg/ml(100nm)人5t4ecdhis或3.99μg/ml(100nm)食蟹猴5t4的2倍稀释系列(范围为100nm至1.56nm)测定样品稀释液(fortebio)中的人5t4ecdhis(seqidno:99的成熟蛋白)或重组食蟹猴5t4蛋白(cusabio；目录号csb-mp024093mov)的缔合(200s)和解离(1000s)。使用数据分析软件v9.0.0.12(fortebio)分析数据。分开对于每种抗体，在缔合和解离步骤期间仅含有样品稀释液的参考孔的值从含有抗原的孔的值中减去。将y轴与基线的最后10s对齐，并应用步骤间校正的与解离的对齐以及savitzky-golay过滤。<0.05nm的响应从分析中排除。使用1:1模型和具有200s缔合时间和1000s或50s解离时间作为感兴趣窗的全局完全拟合(globalfullfit)来拟合数据。默认使用具有完全解离时间(1000s)作为感兴趣窗的拟合。基于r2值和拟合的视觉检查，50s的解离时间用作igg1-5t4-127-fear的感兴趣窗。表1显示了通过生物层干扰测量法测定的用于人5t4ecdh的5t4抗体的缔合速率常数ka(1/ms)、解离速率常数kd(1/s)和平衡解离常数kd(m)。测量抗体对人5t4的亲和力范围，范围为1.3x10-9–2.7x10-8m。igg1-5t4-085-fear的响应低于0.05nm，这阻止数据的正确拟合(对于这些拟合，较低的r2值)。此外，不能正确拟合igg1-5t4-076-fear的响应。这些数据以斜体显示。表2显示了用生物层干扰测量法测定的食蟹猴5t4的缔合速率常数ka(1/ms)、解离速率常数kd(1/s)和平衡解离常数kd(m)。测量抗体对食蟹猴5t4的亲和力范围，范围为1.1x10-9–4.1x10-8m。igg1-5t4-085-fear,igg1-5t4-106-fear和igg1-5t4-h8-fear的响应低于0.05nm，这阻止数据的正确拟合(对于这些拟合，较低的r2值)。此外，不能正确拟合igg1-5t4-076-fear的响应。这些数据以斜体显示。表1：单特异性二价5t4抗体与人5t4细胞外域的结合亲和力，如通过无标记物的生物层干扰测量法测定。表2：单特异性二价5t4抗体与食蟹猴5t4胞外域的结合亲和力，如通过无标记物的生物层干扰测量法测定。实施例3-通过生物层干涉测量法测定的5t4抗体的交叉阻断在octethtx仪器(fortebio)上使用生物层干涉测量法进行抗体交叉阻断分析(表位框并(epitopebinning))。根据制造商的指示，将5t4抗体(在10mm乙酸钠缓冲液，ph6.0中20μg/ml，fortebio)固定化在胺反应性第二代(ar2g)生物传感器(fortebio)上。在样品稀释液(fortebio)中进行基线测量(100s)后，将含有固定化抗体的生物传感器加载100nm(3.6μg/ml)的人5t4ecdhis(seqidno:99的成熟蛋白)500s。接下来，测定第二5t4抗体(10μg/ml)的缔合响应达500s。通过3次5s暴露于10mm甘氨酸ph2.5，然后是样品稀释液，使生物传感器再生，并从基线步骤开始，用一组新的第二5t4抗体重复测量。使用每个生物传感器达四次。在30℃使用1000rpm的摇动器速度进行测量。使用数据分析软件v9.0.0.12(fortebio)分析数据。将y轴与缔合步骤对齐，并应用savitzky-golay过滤。从第二抗体的缔合响应中减去在缔合步骤中样品稀释剂的响应，以校正5t4ecdhis与固定化抗体的解离。经校正的缔合响应以矩阵形式绘制。通常，>0.1nm的响应被认为是非阻断抗体对(白色)，而-0.1至0.1nm之间的响应被认为是阻断抗体对(深灰色)。对于某些抗体对，第二抗体显示初始阳性响应，随后信号减少。这被认为是抗体置换(浅灰色)，即第二抗体置换第一抗体和抗原之间的相互作用(abdicheyn,yeungay,nii,stoned,milesa,morishigew,etal.(2017)antibodiestargetingcloselyadjacentorminimallyoverlappingepitopescandisplaceoneanother.plosone12(1):e0169535.doi:10.1371/journal.pone.0169535)。在某些情况下，数据曲线需要由专家进行目视检查，以将阻断、非阻断或置换特性分配给抗体对。对抗体igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-076-fear,igg1-5t4-085-fear,igg1-5t4-106-fear,igg1-5t4-127-fear,igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear,和现有技术抗体igg1-5t4-h8-fear,igg1-5t4-a1-f405l和igg1-5t4-a3-f405l进行交叉阻断实验。结果总结在表3中。无一抗体(除igg1-5t4-a1-f405l本身外)阻断igg1-5t4-a1-f405l与5t4ecdhis的结合。抗体igg1-5t4-076-fear,igg1-5t4-085-fear,igg1-5t4-127-fear,igg1-5t4-106-fear,igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear(以及igg1-5t4-h8-fear本身)阻断igg1-5t4-h8-fear与5t4ecdhis的结合。抗体igg1-5t4-076-fear,igg1-5t4-085-fear和igg1-5t4-127-fear(以及igg1-5t4-a3-f405l本身)也阻断igg1-5t4-a3-f405l与5t4ecdhis的结合，而抗体igg1-5t4-106-fear和igg1-5t4-h8-fear不阻断igg1-5t4-a3-f405l与5t4ecdhis的结合。抗体igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear与igg1-5t4-a3-f405l(其在实施例4中更详细描述)组合显示抗体置换。表3：如通过生物层干扰测量法测定的抗体交叉阻断。第一列显示固定化的抗体，并且第一行显示溶液中的抗体。显示了溶液中抗体的校正的缔合响应。抗体的交叉阻断由深灰色指示，置换抗体组合由浅灰色和星号指示。非阻断抗体组合未标记(透明背景)。实施例4-与igg1-5t4-a3-f405l组合的igg1-5t4-059-fear，igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear的抗体置换在octethtx仪器(fortebio)上使用生物层干涉仪证明了抗体的置换。根据制造商的指示，将igg1-5t4-a3-f405l(在10mm乙酸钠缓冲液ph6.0中20μg/ml，fortebio)固定化在胺反应性第二代(ar2g)生物传感器(fortebio)上。在样品稀释液(fortebio)中进行基线测量(100s)之后，对含有固定化的igg1-5t4-a3-f405l抗体的生物传感器上加载人5t4ecdhis(seqidno:99的成熟蛋白)100nm(3.6μg/ml)达500s。接下来，测定第二5t4抗体(igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-207-fear或igg1-5t4-226-fear；10μg/ml)或样品稀释液(缓冲液对照)的缔合响应500s。实验在30℃使用1000rpm的振荡器速度进行。使用数据分析软件v9.0.0.12(fortebio)分析数据。从第二抗体的响应中减去缓冲液对照响应，以校正人5t4ecdhis与固定化的igg1-5t4-a3-f405l的解离，将y轴与缔合步骤对齐，并应用savitzky-golay过滤。如图1所示，igg1-5t4-a3-f405l没有显示结合，指示与igg1-5t4-a3-f405l交叉阻断(自我阻断)。igg1-5t4-h8-fear显示与5t4ecdhis结合，因此与igg1-5t4-a3-f405l无交叉阻断。igg1-5t4-059-fear，igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear最初显示阳性响应(指示与igg1-5t4-a3-f405l-5t4ecdhis复合物的结合而不是与igg1-5t4-a3-f405l交叉阻断)，然后响应降低，其下降到igg1-5t4-a3-f405l的自我阻断响应。这证明了从igg1-5t4-a3-f405l-5t4ecdhis复合物的质量损失，指示igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear诱导结合复合物后人5t4ecdhis与igg1-5t4-a3-f405l的解离。这种现象被描述为抗体置换，并且指示表位紧密相邻或最小程度重叠(abdicheyn,yeungay,nii,stoned,milesa,morishigew,etal.(2017)antibodiestargetingcloselyadjacentorminimallyoverlappingepitopescandisplaceoneanother.plosone12(1):e0169535.doi:10.1371/journal.pone.0169535))。这指示与igg1-5t4-a3-f405l相比，抗体igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear结合5t4上的不同表位。实施例5-用流式细胞术测量的5t4抗体与膜结合的5t4的同时结合通过流式细胞术评估在igg1-5t4-a1-f405l和igg1-5t4-a3-f405l的存在下igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear抗体与膜结合的5t4的结合。根据制造商的说明，将igg1-5t4-h8-fear，igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear缀合至异硫氰酸荧光素(fitc,thermofisherscientific)。将表达约20,000个5t4分子/细胞的sk-ov-3细胞(每种条件50,000个细胞)与10μg/ml未缀合的5t4抗体(igg1-5t4-h8-fear,igg1-5t4-a1-f405l,igg1-5t4-a3-f405l,igg1-b12,igg1-5t4-207-fear或igg1-5t4-226-fear)和2μg/ml缀合有fitc的5t4抗体(igg1-5t4-h8-fear-fitc,igg1-5t4-207-fear-fitc和igg1-5t4-226-fear-fitc)的混合物温育。表4显示了测试的组合的概述。在4℃温育30分钟后，将细胞以1200rpm离心5分钟，并弃去上清液。将细胞重悬于补充有1:4000topro-3-iodine(molecularprobes)的100μlfacs缓冲液中。使用流式细胞仪(facsfortessa，bdbiosciences)测量fitc信号的平均荧光强度(mfi)。使用以下公式计算结合百分比：([具有ab-fitc和未缀合的抗体的细胞的mfi–没有ab-fitc或未缀合的抗体的细胞的mfi]*100)(具有ab-fitc和同种型对照的细胞的mfi–没有ab-fitc或未缀合的抗体的细胞的mfi)图2显示igg1-5t4-h8-fear-fitc,igg1-5t4-207-fear-fitc和igg1-5t4-226-fear-fitc的结合在其未缀合的对应物存在下被阻断。但是，在未缀合的igg1-5t4-a1-f405l,igg1-5t4-a3-f405l或igg1-b12存在的情况下，仍然观察到igg1-5t4-207-fear-fitc和igg1-5t4-226-fear-fitc与膜结合5t4的结合，并且与在未缀合的igg1-5t4-a1-f405l,igg1-5t4-a3-f405l或igg1-b12存在下igg1-5t4-h8-fear-fitc与膜结合的5t4的结合相当。与抗体igg1-5t4-a1-f405l和igg1-5t4-a3-f405l相比，抗体igg1-5t4-h8-fear，igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-226-fear结合5t4上不同的表位。表4：流式细胞术实验中使用的抗体组合概述。fitc标记的抗体(2μg/ml)未缀合的抗体(10μg/ml)1igg1-5t4-h8-fear-fitcigg1-5t4-h8-fear2igg1-5t4-h8-fear-fitcigg1-5t4-a3-f405l3igg1-5t4-h8-fear-fitcigg1-5t4-207-fear4igg1-5t4-h8-fear-fitcigg1-5t4-226-fear5igg1-5t4-h8-fear-fitcigg1-5t4-a1-f405l6igg1-5t4-h8-fear-fitcigg1-b127igg1-5t4-207-fear-fitcigg1-5t4-h8-fear8igg1-5t4-207-fear-fitcigg1-5t4-a3-f405l9igg1-5t4-207-fear-fitcigg1-5t4-207-fear10igg1-5t4-207-fear-fitcigg1-5t4-226-fear11igg1-5t4-207-fear-fitcigg1-5t4-a1-f405l12igg1-5t4-207-fear-fitcigg1-b1213igg1-5t4-226-fear-fitcigg1-5t4-h8-fear14igg1-5t4-226-fear-fitcigg1-5t4-a3-f405l15igg1-5t4-226-fear-fitcigg1-5t4-207-fear16igg1-5t4-226-fear-fitcigg1-5t4-226-fear17igg1-5t4-226-fear-fitcigg1-5t4-a1-f405l18igg1-5t4-226-fear-fitcigg1-b12实施例6-5t4抗体与用人或鸡5t4转染的hek-293细胞的结合通过流式细胞术分析5t4抗体与用全长人或鸡5t4瞬时转染的hek-293细胞(如实施例1中所述产生)的结合。在4℃将细胞(5x104个细胞/孔)在聚苯乙烯96孔圆底板(greinerbio-one，目录号650180)中与50μlpbs/0.1％bsa/0.02％叠氮化物(染色缓冲液)中的5t4抗体连续稀释(范围为0.01至10μg/ml，以3倍稀释步骤)温育30分钟。在染色缓冲液中洗涤两次后，在4℃将细胞在50μl缀合有r-藻红蛋白(pe)的山羊抗人iggf(ab')2(在染色缓冲液中1:500；jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.,westgrove,pa,目录号109-116-098)中温育30分钟。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，重悬于20μl染色缓冲液中，并在ique筛选器(intellicytcorporation，usa)上进行分析。使用graphpadprismv7.02软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，通过非线性回归(具有可变斜率的s形剂量-响应)分析结合曲线。图3a显示了igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear,igg1-5t4-059-fear和igg1-5t4-a3-f405l与用全长人5t4转染的hek-293细胞的剂量依赖性结合。图3b显示了虽然观察到igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear和igg1-5t4-059-fear与用全长鸡5t4转染的hek-293细胞的剂量依赖性结合，但igg1-5t4-a3-f405l显示与用全长鸡5t4转染的hek-293细胞的最小结合。阴性对照抗体igg1-b12-k409r在10μg/ml的浓度未显示与用全长人或鸡5t4转染的hek-293细胞的结合。实施例7-5t4抗体在肿瘤细胞中的内在化能力进行实验以表征单价5t4抗体的内在化能力。细胞内有效载荷递送和所产生的细胞毒性用作靶物结合后5t4抗体内在化的读出。通过未缀合的5t4抗体与已经与微管破坏剂duostatin-3缀合的(hiv-1gp120特异性)igg1-b12抗体的受控的fab臂交换产生缀合有毒素的双特异性抗体，该抗体用一个fab臂识别5t4，而用第二个fab臂识别无关的抗原(hiv-1gp120，其在肿瘤细胞上未表达)。产生的双特异性duostatin-3缀合抗体每个抗体携带1个毒素分子(药物-抗体比率1)。将单价结合5t4的duostatin-3缀合的双特异性抗体的连续稀释(0.00152-10μg/ml，3倍)添加到接种在平底96孔组织培养板(5,000细胞/孔；greiner-bio-one，thenetherlands，目录号655180)中的mda-mb-468(乳腺癌细胞系，atcc，htb-132克隆)或hcc1954(乳腺癌细胞系atcc，克隆crl-2338)细胞。将细胞在37℃温育5天，然后根据制造商的说明使用celltiter-glo发光细胞存活力测定法(promega，usa，目录号g7570)评估细胞存活力。使用graphpadprismv7.02软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)使用非线性回归(具有可变斜率的s型剂量-响应)分析细胞毒性曲线。图4显示了在mda-mb-468(a)或hcc1954细胞(b)中单价结合5t4的duostatin-3缀合双特异性抗体的细胞毒性能力。bsigg1-5t4-h8-fearxb12-vcduo3高度能够诱导细胞毒性，指示该抗体的有效的内在化能力。相比之下，bsigg1-5t4-076-fearxb12-vcduo3,bsigg1-5t4-085-fearxb12-vcduo3和bsigg1-5t4-127-fearxb12-vcduo3没有诱导任何细胞毒性；剂量响应曲线类似于非结合igg1-b12-vcduo3对照抗体的剂量响应曲线。这指示与膜结合的5t4结合后，那些抗体的较差内在化。bsigg1-5t4-059-fearxb12-vcduo3,bsigg1-5t4-106-fearxb12-vcduo3,bsigg1-5t4-207-fearxb12-vcduo3和bsigg1-5t4-226-fearxb12-vcduo3在这两种测试细胞系中均诱导中等细胞毒性，指示这些单价5t4抗体诱导内在化，但比bsigg1-5t4-h8-fearxb12-vcduo3以更小的程度诱导。实施例8-用于产生cd3x5t4双特异性抗体的人源化cd3抗体在wo2015/001085的实施例1中描述了人源化抗体igg1-hucd3-h1l1的产生。igg1-hucd3-h1l1在本文中称为“igg1-hucd3”。抗体igg1-hucd3-h1l1-feal是其变体，其除了通过受控的fab臂交换允许产生双特异性抗体的突变：l234f、l235e、d265a和f405l之外在fc域中具有防止与iggfc受体(fcgamma受体[fcγr])和补体的相互作用的氨基酸取代，如上所述。先前已经证明这些突变对引入它们的抗体与靶物的结合没有影响(参见例如，us2015/0337049)。在wo2017/009442的实施例2中描述了人源化抗体igg1-hucd3-h1l1-h101g的产生。igg1-hucd3-h1l1-h101g被称为“igg1-hucd3-h101g”。如上所述，抗体igg1-hucd3-h101g-feal是具有氨基酸取代l234f、l235e、d265a和f405l的变体。实施例9-使用生物层干涉测量法测定cd3结合亲和力如wo2017/009442的实施例7中所述，测定选定的cd3抗体(包括igg1-hucd3和igg1-hucd3-h101g)的结合亲和力。简而言之，使用fortebiooctethtx(fortebio)上的生物层干扰测量法测定igg1-hucd3-feal形式的选定cd3抗体与重组可溶性cd3ε(cd3e27-gska)(seqidno:101的成熟蛋白)的结合亲和力。将抗人fc捕捉生物传感器(fortebio，目录号18-5060)加载hlgg(1mg/ml)达600s。基线测量(200s)后，使用具有三倍稀释步骤的27.11μg/ml-0.04μg/ml(1000nm-1.4nm)的cd3e27-gska浓度范围(样品稀释液，fortebio，目录号18-5028)测定cd3e27-gska的缔合(1000s)和解离(2000s)。为了进行计算，使用基于氨基酸序列的cd3e27-gska的理论分子量，即27.11kda。在30℃以1000rpm摇动的情况下进行实验。在至少两个独立的实验中测试了每种抗体。使用fortebio数据分析软件v8.1，使用1:1模型和具有1000s缔合时间和100s解离时间的全局完全拟合分析数据。通过减去参考曲线(生物传感器上的抗体，仅使用样品稀释剂进行测量)校正数据迹线，将y轴与基线的最后10s对齐，并应用步骤间校正以及savitzky-golay过滤。具有响应<0.05nm的数据迹线从分析中排除。表5显示了通过生物层干扰测量法测定的重组cd3ε的缔合速率常数ka(1/ms)、解离速率常数kd(1/s)和平衡解离常数kd(m)。与igg1-hucd3-h101g-feal(kd:638nm)相比，igg1-hucd3-feal对重组cd3ε显示相对高的结合亲和力(kd：15nm)。表5：单特异性二价cd3抗体与重组cd3ε的结合亲和力，如通过无标记物的生物层干扰测量法测定的实施例10-通过2-mea诱导的fab臂交换产生双特异性抗体如wo2011147986,wo2011131746和wo2013060867(genmab)和labrijn等人(labrijnetal.,pnas2013,110:5145-50；grameretal.,mabs2013,5:962-973)所述，使用平台技术，即2-mea诱导的fab-臂交换，在体外产生双特异性抗体。为了通过这种方法产生双特异性抗体，生成了在ch3域中携带单突变的igg1分子：在一个亲本igg1抗体中为f405l突变(即cd3抗体)，在另一个亲本igg1抗体中为k409r突变(即5t4或对照，hiv-1gp120特异性抗体)。除这些突变外，亲本igg1抗体包含导致无法与iggfc受体(fcgamma受体)和补体相互作用的fc域的取代：l234f、l235e、d265a(fea)。为了产生双特异性抗体，将两种亲本抗体以等质量的量在pbs缓冲液(磷酸盐缓冲盐水；8.7mmhpo42-,1.8mmh2po4-,163.9mmna+,140.3mmcl-,ph7.4)中混合。加入2-巯基乙胺-hcl(2-mea)至终浓度75mm，并将反应混合物在31℃温育5小时。根据制造商的方案，使用10kda分子量截留的slide-a-lyzer滑架(carriages)(thermofisherscientific)，通过透析到pbs缓冲液中去除2-mea，以允许链间二硫键的再氧化和完整的双特异性抗体的形成。在实施例中使用了以下抗体：cd3抗体igg1-hucd3-feal(具有以seqidno:57和seqidno:60所示的vh和vl序列)。igg1-hucd3-h101g-feal(具有以seqidno:68和seqidno:60所示的vh和vl序列)5t4抗体igg1-5t4-207-fear(具有以seqidno:40和seqidno:44所示的vh和vl序列)igg1-5t4-226-fear(具有以seqidno:47和seqidno:51所示的vh和vl序列)igg1-5t4-059-fear(具有以seqidno:5和seqidno:9所示的vh和vl序列)igg1-5t4-076-fear(具有以seqidno:12和seqidno:16所示的vh和vl序列)igg1-5t4-085-fear(具有以seqidno:19和seqidno:23所示的vh和vl序列)igg1-5t4-106-fear(具有以seqidno:26和seqidno:30所示的vh和vl序列)igg1-5t4-127-fear(具有以seqidno:33和seqidno:37所示的vh和vl序列)igg1-5t4-h8-fear(基于来自wyeth的5t4抗体h8(wo2007/106744和us2010/0173382)；具有以seqidno:87和seqidno:88所示的vh和vl序列)igg1-5t4-a1-f405l(基于来自wyeth的5t4抗体a1(wo2007/106744和us8044178)；具有以seqidno:83和seqidno:84所示的vh和vl序列)igg1-5t4-a1-fear(基于来自wyeth的5t4抗体a1(wo2007/106744和us8044178)；具有以seqidno:83和seqidno:84所示的vh和vl序列)igg1-5t4-a3-f405l(基于来自wyeth的5t4抗体a3(wo2007/106744和us8759495)；具有以seqidno:85和seqidno:86所示的vh和vl序列)igg1-5t4-a3-fear(基于来自wyeth的5t4抗体a3(wo2007/106744和us8759495)；具有以seqidno:85和seqidno:86所示的vh和vl序列)双特异性抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-076-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-085-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-127-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-h8-fearbsigg1-hucd3-h101g-fealxb12-fearbsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fearbsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fearbsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fearbsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fearbsigg1-hucd3-fealx5t4-h8-fearbsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fearbsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fearbsigg1-b12-fealx5t4-207-fear异硫氰酸荧光素(fitc)标记的双特异性抗体bsigg1-b12-fealx5t4-059-fear-fitcbsigg1-b12-fealx5t4-207-fear-fitcbsigg1-b12-fealx5t4-226-fear-fitcbsigg1-5t4-a1-f405lxb12-fear-fitcbsigg1-5t4-a3-f405lxb12-fear-fitc缀合有duostatin-3的双特异性抗体bsigg1-5t4-h8-fearxb12-vcduo3bsigg1-5t4-076-fearxb12-vcduo3bsigg1-5t4-085-fearxb12-vcduo3bsigg1-5t4-127-fearxb12-vcduo3bsigg1-5t4-059-fearxb12-vcduo3bsigg1-5t4-106-fearxb12-vcduo3bsigg1-5t4-207-fearxb12-vcduo3bsigg1-5t4-226-fearxb12-vcduo3。非结合对照抗体igg-b12是hiv-1gp120特异性抗体(barbas,cf.jmolbiol.1993apr5；230(3):812-23)，其在某些示例中用作双特异性抗体的阴性、非结合、对照第二臂。igg1-b12-f405l是其具有取代f405l的变体。igg1-b12-feal是其在允许通过受控fab臂交换产生双特异性抗体的突变：l234f、l235e、d265a和f405l外具有下述取代的变体，所述取代导致不能与iggfc受体(fcgamma受体)和补体相互作用的fc域。igg1-b12-k409r是其具有取代k409r的变体。igg1-b12-fear是其在允许通过受控fab臂交换产生双特异性抗体的突变：l234f、l235e、d265a和k409r外具有下述取代的变体，所述取代导致不能与iggfc受体(fcgamma受体)和补体相互作用的fc域。实施例11-cd3x5t4双特异性抗体与hek-293细胞中表达的食蟹猴和人5t4的结合通过流式细胞术分析双特异性单价cd3x5t4抗体和单特异性双价5t4抗体与用人5t4或食蟹猴(成束猴)5t4瞬时转染的hek-293细胞(如实施例1中所述产生)质膜的结合。于4℃将细胞(3x104个细胞/孔)在聚苯乙烯96孔圆底板(greinerbio-one，目录号650180)中与100μlpbs/0.1％bsa/0.02％叠氮化物(染色缓冲液)中的抗体的连续稀释液(范围为0.0137至10μg/ml，以3倍稀释步骤)温育30分钟。实验以技术重复进行。在染色缓冲液中洗涤两次后，将细胞在50μl二抗中于4℃温育30分钟。作为二抗，在所有实验中均使用在染色缓冲液中以1:200稀释的缀合有fitc的山羊抗人iggf(ab’)2(southernbiotech,usa,目录号2043-02)。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，重悬于30μl染色缓冲液中，并在iquescreener(intellicytcorporation，usa)上进行分析。使用graphpadprismv7.02软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析结合曲线。图5(i)(左图)显示了双特异性抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(a),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear(b),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear(c)和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-h8-fear(d)(它们单价结合5t4)分别表现出与用人5t4转染的hek-293细胞的剂量依赖性结合，这与单特异性二价5t4抗体igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear,igg1-5t4-059-fear和igg1-5t4-h8-fear的结合相当。图5(i)(右图)显示了双特异性抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(a),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear(b)和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear(c)(它们单价结合5t4)分别表现出与用食蟹猴5t4转染的hek-293细胞的剂量依赖性结合，这与单特异性二价5t4抗体igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear和igg1-5t4-059-fear的结合相当。bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-h8-fear和igg1-5t4-h8-fear显示较差的与食蟹猴5t4的结合，这与实施例2和wo2007/106744中所述的实验一致。作为阴性对照，这些实验中包括igg1-b12-k409r(3μg/ml)，该抗体与用人或食蟹猴5t4转染的hek-293细胞没有显示结合。在第二个实验中，如上所述在稍作调整的情况下进行染色。将细胞与以5倍稀释步骤的范围为0.000128至10μg/ml的抗体连续稀释液温育。作为二抗，使用在染色缓冲液中以1:200稀释的缀合有藻红蛋白(pe)的山羊抗人iggf(ab’)2(jacksonimmunoresearch,uk，目录号109-116-098)。图5(ii)显示抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和igg1-5t4-207-fear(a),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear(b),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear(c),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear和igg1-5t4-106-fear(d),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-076-fear和igg1-5t4-076-fear(e),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-085-fear和igg1-5t4-085-fear(f),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-127-fear和igg1-5t4-127-fear(g),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和igg1-5t4-a1-fear(h),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear和igg1-5t4-a3-fear(i)表现出与用人5t4转染的hek-293细胞(左图)以及用食蟹猴5t4转染的hek-293细胞(右图)的剂量依赖性结合。同样，二价单特异性和双特异性单价抗体的结合曲线在人和猕猴5t4之间表现出相似的趋势。实施例12-cd3x5t4双特异性抗体与5t4阳性人肿瘤细胞的结合通过流式细胞术分析cd3x5t4双特异性抗体与表达5t4的人类肿瘤细胞系hela(宫颈腺癌；atcc，目录号ccl-2)和mda-mb-231(乳腺癌；atcc，目录号htb-26)细胞系的结合。hela和mda-mb-231细胞均不表达cd3。于4℃将细胞(3x104个细胞/孔)在聚苯乙烯96孔圆底板(greinerbio-one，目录号650180)中与100μlpbs/0.1％bsa/0.02％叠氮化物(染色缓冲液)中的抗体的连续稀释液(范围0.000152至3μg/ml，以3倍稀释步骤)温育30分钟。在染色缓冲液中洗涤两次后，将细胞在50μl二抗中于4℃温育30分钟。作为二抗，使用染色缓冲液中以1:400稀释的缀合有异硫氰酸荧光素(fitc)的山羊抗人iggf(ab’)2(southernbiotech,usa，目录号2043-02)进行第一项实验。接下来，将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，重悬于120μl染色缓冲液中，并在bdlsrfortessafacs(bdbiosciences，usa)上进行分析。使用graphpadprismv7.02软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析结合曲线。图6(i)(左图)显示了cd3x5t4双特异性抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(a)和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear(b)表现出与hela细胞的剂量依赖性结合，比单特异性二价5t4抗体igg1-5t4-207-fear和igg1-5t4-059-fear具有更高的最大结合。对于bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear(c)，最大结合在hela细胞上与单特异性二价5t4抗体igg1-5t4-226-fear的最大结合相似。图6(i)(右图)显示了cd3x5t4双特异性抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(a),bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear(b)和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear(c)表现出与mda-mb-231细胞的剂量依赖性结合，比单特异性二价5t4抗体igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear和igg1-5t4-059-fear具有更高的最大结合。这些实验中包含的阴性对照抗体igg1-b12-k409r(3μg/ml)未显示与hela和mda-mb-231细胞的结合。在第二个实验中，如上所述在稍作调整的情况下进行染色。将细胞与以5倍稀释步骤的范围为0.000128至10μg/ml的抗体连续稀释液温育。作为二抗，使用在染色缓冲液中以1:200稀释的缀合有藻红蛋白(pe)的山羊抗人iggf(ab’)2(jacksonimmunoresearch,uk，目录号109-116-098)。图6(ii)和6(iii)显示抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fearandigg1-5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear和igg1-5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和igg1-5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear和igg1-5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-085-fear和igg1-5t4-085-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-127-fear和igg1-5t4-127-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和igg1-5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear和igg1-5t4-a3-fear表现出与hela和mda-mb-231肿瘤细胞的剂量依赖性结合。通常，与bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear,igg1-5t4-a1-fear和igg1-5t4-a3-fear相比，bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear,igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear,igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-106-fear,igg1-5t4-085-fear和igg1-5t4-127-fear在更低的抗体浓度表现出结合。实施例13-使用纯化的t细胞作为效应细胞，通过cd3x5t4双特异性抗体在体外诱导t细胞活化，细胞因子释放和细胞毒性使用5t4阳性肿瘤细胞系作为靶细胞和纯化的t细胞作为效应细胞，在体外细胞毒性测定法中测试cd3x5t4双特异性抗体。t细胞源自健康人供体血沉棕黄层(sanquin,amsterdam,thenetherlands)，并使用rosettesep人类t细胞富集混合物(stemcelltechnologies,france，目录号15061)根据制造商的说明进行分离。为了测定分离后活t细胞的百分比(总t细胞、cd4+t细胞或cd8+t细胞)，在4℃在u孔96孔板(cellstar，目录号650180)中使用以下抗体将分离的t细胞样品(每种条件为2.5x105个细胞)染色30分钟：100μlpbs/0.1％bsa/0.02％叠氮化物(染色缓冲液)中的pacificbluecd3(ebiosciences，克隆okt3)，apc-cy-抗cd4(ebiosciences，克隆okt4)，af700-抗cd8(biolegend,克隆rpa-t8)和存活力标志物fvs510(bdbiosciences)。接下来，将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，重悬于120μl染色缓冲液中，并在bdlsrfortessafacs(bdbiosciences，usa)上进行分析。表6中描述了用于细胞毒性实验的每个供体的cd3+,cd3+cd4+和cd3+cd8+t细胞的百分比。表6：每个供体的cd3+、cd4+和cd8+t细胞比率将mda-mb-231细胞(16,000个细胞/孔)接种到平底96孔板(greiner-bio-one，thenetherlands，目录号655180)中，并在37℃粘附4小时。将t细胞以e:t比例＝8:1添加到肿瘤细胞。添加双特异性cd3x5t4抗体或单特异性二价5t4抗体的连续稀释液(终浓度范围为1000至0.0128ng/ml；5倍稀释)，并将板在37℃温育72小时。接下来，将110μl含t细胞的上清液转移至u形96孔培养板(cellstar，目录号650180)。将板在4℃离心(300xg)3分钟，然后将75μl上清液转移到新板进行细胞因子产生测量，并保留t细胞以评估t细胞活化标志物(如下所述)。通过多重u-plex测定法(mesoscalediscovery,usa，目录号k15049k)根据制造商的说明分析由0.2μg/mlcd3x5t4双特异性抗体诱导的细胞因子生成。针对t细胞标志物cd3(1:200；ebioscience，克隆okt3，与efluor450缀合)、cd4(1:50；ebioscience，克隆okt4，与apc-efluor780缀合)、cd8(1:100；biolegend，克隆rpa-t8，与af700缀合)和t细胞活化标志物cd69(1:50；bdbiosciences，克隆ab2439，与apc缀合)、cd25(1:50；ebioscience，克隆bc96，与pe-cy7缀合)和cd279/pd1(1:50；biolegend，克隆eh12.2h7，与bv605缀合)染色t细胞。将带有ultracomp珠粒(5μl；invitrogen，目录号01-2222-42)的单次染色样品用于流式细胞仪的补偿调整。在4℃温育30分钟后，将板用pbs/0.1％bsa/0.02％叠氮化物(染色缓冲液)洗涤3次。将细胞重悬于120μl染色缓冲液中，并使用facsfortessa(bdbiosciences)进行分析。使用flowjo(bdbiosciences)处理数据。平行地，使用刃天青(7-羟基-3h-吩恶嗪-3-酮10-氧化物(7-hydroxy-3h-phenoxazin-3-one10-oxide))评估肿瘤细胞的存活力。将粘附肿瘤细胞用pbs洗涤两次，并于37℃与rpmi-1640(lonza,switzerland,目录号be12-115f)培养基中的10％刃天青(150μl；lifetechnologies,thenetherlands,目录号dal1100)一起温育4小时，所述培养基含有10％含铁的供体牛血清(lifetechnologies,thenetherlands,目录号10371-029)和青霉素/链霉素(lonza,目录号de17-603e)。用envision多标记读板仪(perkinelmer,us)测量吸光度。将经星形孢菌素处理的(sigma-aldrich，us，目录号s6942)肿瘤细胞样品的吸光度设为0％存活力，并且将未处理的肿瘤细胞样品的吸光度设为100％存活力。如下计算“活细胞百分比”：％活细胞＝[样品吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]/[未处理的靶细胞的吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]x100使用graphpadprismv7.02软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析剂量响应曲线、ec50和ic50值。图7(i)显示bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear在5t4阳性肿瘤细胞系mda-mb-231中诱导剂量依赖性细胞毒性(显示为％活细胞降低)。观察到供体之间的差异，但是这两个供体的t细胞在1μg/mlcd3x5t4双特异性抗体的存在下诱导最大杀伤。单特异性二价抗体igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear和igg1-5t4-059-fear不诱导细胞毒性。从图计算的ic50值呈现于图7(ii)中。bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear的ic50值分别与bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear相比更低。相反，bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear的ic50值与bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear相当。图8(i)显示bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear在mda-mb-231细胞系中诱导t细胞介导的细胞毒性(显示为肿瘤细胞存活的降低)。二价单特异性抗体igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear,igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-106-fear,igg1-5t4-a1-fear和igg1-5t4-a3-fear未诱导t细胞介导的细胞毒性。从图计算的ic50值呈现于图8(ii)中。由bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear诱导的t细胞介导的细胞毒性的ic50值低于bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear的ic50值。同样，由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear诱导的t细胞介导的细胞毒性的ic50值低于bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear的ic50值。通过流式细胞术通过活化标志物pd1、cd25和cd69的染色测定t细胞活化(图9(i))。单特异性二价抗体igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear和igg1-5t4-059-fear不诱导这些t细胞活化标志物的上调，而双特异性抗体bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear诱导pd1、cd25和cd69的剂量依赖性上调。从图计算的ec50值在图9(ii)中呈现。分别与bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear相比，bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear上调pd1、cd25和cd69的ec50值更低。与bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear相比，bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear上调cd25和cd69的ec50值更低，而pd1上调的ec50值在bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear之间是相当的。图10(i)显示bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear在与mda-mb-231细胞系温育时诱导t细胞活化(在图10(i)中以cd4+和cd8+t细胞群内的％cd69+t细胞增加例示)，而二价单特异性抗体igg1-5t4-207-fear,igg1-5t4-226-fear,igg1-5t4-059-fear,igg1-5t4-106-fear,igg1-5t4-a1-fear和igg1-5t4-a3-fear不诱导t细胞活化。三种t细胞活化标志物的ec50值显示于图10(ii)中。通常，由bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-106-fear诱导的t细胞活化的ec50值(cd4+和cd8+t细胞群内的％cd69+、cd25+和pd1+细胞的增加)低于bsigg1-hucd3-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-fealx5t4-a3-fear的ec50值。同样，由bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-106-fear诱导的t细胞活化的ec50值(以cd4+和cd8+t细胞群内的％cd69+、cd25+和pd1+t细胞的增加)低于bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a1-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-a3-fear的ec50值。将t细胞和mda-mb-231细胞的共培养物暴露于0.2μg/mlcd3x5t4双特异性抗体后，通过多重u-plex测定法在培养上清液中测量细胞因子il-10、il-13和tnf的产生。图11显示了在与双特异性抗体一起温育之后，t细胞-肿瘤细胞共培养物的上清液中的细胞因子水平。使用来自两个不同健康供体的t细胞进行实验；图11a显示了来自与源自供体a的t细胞共培养的结果，图11b显示了来自与源自供体b的t细胞共培养的结果。尽管与含有igg1-hucd3-h101g-feal衍生的cd3特异性fab-臂的cd3x5t4双特异性抗体一起温育的t细胞肿瘤细胞共培养物中的细胞因子水平低于与含有igg1-hucd3-feal衍生的cd3特异性fab-臂的双特异性抗体一起温育的共培养物中的细胞因子水平，但是双特异性抗体bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-226-fear,bsigg1-hucd3-fealx5t4-059-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-059-fear都诱导细胞因子释放。单特异性抗体igg1-5t4-207-fear，igg1-5t4-226-fear和igg1-5t4-059-fear不诱导任何细胞因子释放。实施例14-使用pbmc或纯化的t细胞作为效应细胞，以不同的效应器与靶物比例通过cd3x5t4双特异性抗体体外诱导细胞毒性为了更详细地测定双特异性抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear的t细胞介导的杀伤的效率，以不同的效应细胞与靶细胞(e:t)比例，如实施例13中所述进行细胞毒性测定法。另外，外周血单个核细胞(pbmc)或分离的t细胞用作效应细胞。卵巢癌细胞系sk-ov-3(9,000个细胞/孔，atcc，目录号htb-77)用作靶细胞系。使用ficoll梯度(lonza；淋巴细胞分离介质，目录号17-829e)根据制造商的说明从40ml人血液血沉棕黄层(sanquin)中分离pbmc。如实施例13中所述分离t细胞。对于pbmc，使用以下e:t比例：1:2,1:1,2:1,4:1,8:1和12:1。对于分离的t细胞，使用以下e:t比例：1:2,1:1,2:1,4:1和8:1。在每个实验中，使用来自两个分开供体的效应细胞。表7提供了每个供体的pmbc或t细胞分离物中cd3+,cd3+cd4+和cd3+cd8+t细胞的百分比的概述(如实施例13所述测定)。表7：每个供体的cd3+,cd4+和cd8+t细胞比例。供体活细胞群内的％cd3cd3+细胞内的％cd4+cd3+细胞内的％cd8+c(pbmc)7556.828.9d(pbmcs)6063.232e(t细胞)98.359.631.6f(t细胞)97.27026.4如图12所示，使用来自两个不同供体的效应细胞，以4:1至12:1的e:t比例在bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear存在下导致有效的pbmc介导的对sk-ov-3细胞杀伤。在e:t比例为2:1和更低时，在使用的最高抗体浓度(1000ng/ml)下未实现对sk-ov-3细胞的最大杀伤力。当将分离的t细胞用作效应细胞时观察到相似的结果(图13)。使用来自两个不同供体的效应细胞，在使用的最高抗体浓度(1000ng/ml)，在bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear的存在下，4:1和8:1的e:t比例导致sk-ov-3细胞的最大t细胞介导的杀伤，而较低的e:t比例不足以诱导最大杀伤。因此，由bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear诱导的t细胞介导的杀伤功效取决于足够高的e:t比例。实施例15-cd3x5t4双特异性抗体在人源化免疫系统小鼠异种移植物模型中的抗肿瘤活性在用人mda-mb-231肿瘤细胞皮下接种的人源化(于3-4周龄尾静脉注射cd34+造血干细胞[hsc])nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj(nsg-his)小鼠(从thejacksonlaboratory获得)中评估cd3x5t4双特异性抗体bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear的体内抗肿瘤效力。植入后16周，通过流式细胞术证实了nsg-his小鼠免疫系统的人源化。随后，根据hsc供体(#5239或#2328)和外周血中人cd45+群体内人cd3+t细胞的百分比(分别为平均％hcd45+和％hcd3+细胞；对于pbs组为42％hcd45+和39％hcd3+，对于bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear组为34％hcd45+和25％hcd3+，和对于bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear为36％hcd45+和29％hcd3+)，将nsg-his小鼠随机分为三组(每组8只小鼠)。将5x106个mda-mb-231细胞(在100μlpbs中)皮下(sc)注射到小鼠的体侧中；这在研究中指示为第0天。在第14、18、21和25天，给小鼠静脉内(iv)注射0.5mg/kg抗体或pbs。表8中显示了处理组。使用测径器每周两次(从第14天开始)评估肿瘤生长。从测径器测量以0.52x(长度)x(宽度)2计算肿瘤体积(mm3)。结果显示在图14中。图14a显示，与对照组相比第43天基于mann-whitney统计分析，bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear(p<0.01)和bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(p<0.05)均有效地抑制肿瘤生长。此外，使用mantelcox检验对无肿瘤存活曲线进行的统计分析(kaplanmeier图，使用小于500mm3的肿瘤作为截留)证明无肿瘤存活的差异在统计学上不同，显示与未处理的动物相比，用bsigg1-hucd3-fealx5t4-207-fear(p<0.001)或bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear(p<0.001)处理的动物中的增加的无肿瘤存活(图14b)。表8处理组实施例16.使用丙氨酸扫描法测定5t4氨基酸残基对抗体结合的贡献。文库设计合成了人5t4(uniprotidq13641)单残基丙氨酸文库(geneart,thermofisherscientific)，其中除了已经含有丙氨酸或半胱氨酸的位置以外，人5t4胞外域中的所有氨基酸残基都个别突变为丙氨酸。为了使抗原的结构破坏的机会最小化，不对半胱氨酸进行突变。将文库克隆到包含cmv/tk-polya表达盒、氨苄青霉素抗性基因和pbr322复制起点的pmac表达载体中。文库产生和筛选在freestylehek293细胞中根据制造商的说明(thermofisherscientific，目录号12347-019)个别表达野生型5t4和丙氨酸突变体。转染后一天，收获细胞。在室温将约80,000个细胞与20μl缀合有fitc的抗体(3μg/ml；在facs缓冲液(pbs[lonza，目录号be17-517]+0.1％[w/v]bsa[roche，目录号10735086001]+0.02％[w/v]叠氮化钠[nan3；emelcabioscience，目录号41920044-3]；表9)温育40分钟。随后，使用150-180μlfacs缓冲液通过离心将细胞洗涤两次。将细胞重悬于30μlfacs缓冲液中，并在4℃贮存，直到使用ique筛选器(intellicytcorporation)通过流式细胞术进行分析。整个实验进行两次，产生一式两份测量。表9：用于使用丙氨酸扫描测定5t4氨基酸残基在抗体结合中的贡献的抗体。在进行实验之前，用fitc(thermofisherscientific，目录号46425)标记与5t4单价结合的抗体。igg1-5t4-a1-f405l和igg1-5t4-a3-f405l分别是替代a1和a3抗体，它们被克隆到包含f405l突变的人igg1主链中。因此，替代a1抗体具有与wo2007106744中公开的a1抗体相同的可变区。同样，a3替代抗体具有与wo2007106744中公开的a3抗体相同的可变区。在这两种抗体中，fc域携带f405l取代。抗体测试或对照抗体bsigg1-b12-fealx5t4-059-fear-fitc测试抗体bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear-fitc测试抗体bsigg1-b12-fealx5t4-226-fear-fitc测试抗体bsigg1-5t4-a3-f405lxb12-fear-fitc测试抗体bsigg1-5t4-a1-f405lxb12-fear-fitc用于标准化的对照抗体数据分析对于每个样品，将每个细胞结合的抗体的平均量以活的单细胞群体的荧光强度的几何平均值(gmfi)测定。gmfi受抗体对5t4突变体的亲和力和每个细胞的5t4突变体表达水平的影响。由于特定的丙氨酸突变可影响突变体5t4的表面表达水平，并且通常校正每种5t4突变体的表达差异，因此使用以下等式，相对于非交叉阻断5t4特异性对照抗体的结合强度标准化每种测试抗体的数据：其中“aa位置”是指突变为丙氨酸的位置，且根据以下等式，计算z得分以表达所述抗体结合的丧失或获得：其中μ和σ分别是从所有突变体计算的标准化gmfi的平均值和标准差，其中若特定5t4突变体的对照抗体的gmfi低于平均gmfi对照抗体-2.5x平均gmfi对照抗体的sd(来自所有突变体)，则从分析中排除数据(假设那些5t4突变体的表达水平不足以得到结论)。对于位置296(seqidno:1)处的氨基酸w就是如此。结果图15显示了测试的抗体与在ecd：位置32至355(根据seqidno:1)中具有单一丙氨酸突变的人5t4变体的结合结果。结果指示，当人5t4的位置73处的aar、位置74处的t、位置92处的y、位置94处的r、位置95处的n或位置138处的f被突变为丙氨酸时，抗体bsigg1-b12-fealx5t4-059-fear-fitc显示结合丧失。这提示抗体igg1-5t4-059-04-fear的结合至少依赖于人5t4(seqidno:1)的r73、t74、y92、r94、n95、f138，当人5t4的位置69处的aas、位置73处的r、位置92处的y、位置94处的r、位置111处的f、位置138处的f、位置148处的d被突变为丙氨酸时抗体bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear-fitc显示结合丧失。这提示抗体igg1-5t4-207-fear的结合至少依赖于人5t4(seqidno:1)的aas69、r73、y92、r94、f111、f138和d148，当人5t4的位置73处的aar、位置92处的y、位置94处的r、位置111处的f、位置138处的f、位置144处的l或位置148处的d被突变为丙氨酸时抗体bsigg1-b12-fealx5t4-226-fear-fitc显示结合丧失。这提示抗体igg1-5t4-226-fear的结合至少依赖于人5t4(seqidno:1)的aar73、y92、r94、f111、f138、l144和d148，当人5t4的位置60处的aad、位置61处的q、位置88处的d、位置89处的l、位置92处的y、位置111处的f、位置115处的p、位置117处的l、位置138处的f、位置148处的d或位置152处的n被突变为丙氨酸时，抗体bsigg1-5t4-a3-f405lxb12-fear-fitc显示结合丧失。这提示抗体igg1-5t4-a3-fear的结合至少依赖于人5t4(seqidno:1)的aad60、q61、d88、l89、y92、f111、p115、l117、f138、d148和n152。一些氨基酸可间接参与结合。例如，将疏水残基突变为丙氨酸可影响局部折叠并影响直接相互作用的残基的定位(zhaoetal.,2014structure22,612-620)。根据结构数据(人类5t4晶体结构4cnm；rcsb蛋白数据库)，以下残基是掩埋的，因此有望间接促成与以下项的结合：·抗体bsigg1-b12-fealx5t4-059-04-fear-fitc:f138,·抗体bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear-fitc:f111,f138,d148,·抗体bsigg1-b12-fealx5t4-226-fear-fitc:f111,f138,l144,d148,·抗体bsigg1-5t4-a3-f405lxb12-fear-fitc:l89,f111,l117,f138,d148,n152。由于仅表面暴露的残基可以直接与抗体相互作用，因此预期以下残基与以下抗体直接相互作用：·抗体bsigg1-b12-fealx5t4-059-fear-fitc:r73,t74,y92,r94和n95,·抗体bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear-fitc:s69,r73,y92和r94,·抗体bsigg1-b12-fealx5t4-226-fear-fitc:r73,y92和r94,·抗体bsigg1-5t4-a3-f405lxb12-fear-fitc:d60,q61,d88,y92和p115。这些结果共同提出抗体igg1-5t4-059、igg1-5t4-207和igg1-5t4-226都通过与氨基酸残基r73、y92和r94直接相互作用而结合。结果还指示，抗体igg1-5t4-059、igg1-5t4-207和igg1-5t4-226各自结合表位，该表位与由igg1-5t4-a3结合的表位不同但部分重叠。这与实施例3和4中描述的置换行为一致。实施例17：cd3x5t4双特异性抗体在不同适应症的细胞系中体外诱导t细胞活化和细胞毒性使用胰腺癌和宫颈癌的肿瘤细胞系作为靶细胞，并将纯化的t细胞作为效应细胞，在体外细胞毒性测定法中测试cd3x5t4双特异性抗体。对于每种适应症(胰腺癌和宫颈癌)，选择了两个代表性细胞系。表10总结了用于体外细胞毒性测定法的肿瘤细胞系。t细胞源自人供体血沉棕黄层(sanquin,amsterdam,thenetherlands)，并使用rosettesep人t细胞富集混合物(stemcelltechnologies,france，目录号15061)根据制造商的说明分离。对于每种细胞系，在体外细胞毒性测定法和t细胞活化分析中测试至少三个不同的供体，如表10中汇总。表10：用于体外细胞毒性测定法的肿瘤细胞系将肿瘤细胞(16,000个细胞/孔)接种到平底96孔板(greinerbio-one，thenetherlands，目录号655180)中，并在37℃粘附4小时。将t细胞以e：t比例＝4:1添加到肿瘤细胞。添加bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear或对照抗体(bsigg1-hucd3-h101g-fealxb12-fear,bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear)的连续稀释液(终浓度范围为5000至0.0128ng/ml；5倍稀释)，并将板在37℃温育72小时。接下来，将110μl含t细胞的上清液转移至圆底96孔培养板(cellstar，目录号650180)中，并在4℃离心(300xg)3分钟。通过与50μlpbs/0.1％bsa/0.02％叠氮化物(染色缓冲液)中稀释的cd3-efluor450(1：200；ebioscience，克隆okt3)，cd4-apc-efluor780(1:50；ebioscience，克隆okt4)，cd8-af700(1:100；biolegend，克隆rpa-t8)和t细胞活化标志物cd69-apc(1:50；bdbiosciences，克隆ab2439)，cd25-pe-cy7(1:50；ebioscience，克隆bc96)和cd279/pd1-bv605(1:50；biolegend，克隆eh12.2h7)温育针对t细胞标志物对t细胞染色。将具有ultracomp珠(5μl；invitrogen，目录号01-2222-42)的单一染色样品用于流式细胞仪的补偿调整。在4℃温育30分钟后，将板用染色缓冲液洗涤3次。将细胞重悬于120μl染色缓冲液中，并使用facsfortessa(bdbiosciences)进行分析。使用flowjo(第10版，bdbiosciences)处理数据。平行地，使用刃天青(7-羟基-3h-吩恶嗪-3-酮10-氧化物)评估肿瘤细胞的存活力。将粘附肿瘤细胞用pbs洗涤两次，并于37℃与补充有10％含铁的供体牛血清(lifetechnologies,thenetherlands,目录号10371-029)和青霉素/链霉素(lonza,目录号de17-603e)的rpmi-1640培养基(lonza,switzerland,目录号be12-115f)中的10％刃天青(150μl；lifetechnologies,thenetherlands,目录号dal1100)一起温育4小时。用envision多标记读板仪(perkinelmer,us)测量吸光度。将经星形孢菌素处理的(sigma-aldrich，us，目录号s6942)细胞的吸光度设为0％存活力，并且将未处理的细胞的吸光度设为100％存活力。如下计算“活细胞百分比”：％活细胞＝[样品吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]/[未处理的靶细胞的吸光度–经星形孢菌素处理的靶细胞的吸光度]x100使用graphpadprismv7.02软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s形剂量响应)分析剂量细胞毒性曲线、t细胞活化曲线、ic50(细胞毒性)和ec50(t细胞活化)值。图16(i)显示bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear在一批不同适应症的细胞系中诱导细胞毒性，而仅靶向肿瘤细胞或t细胞的对照双特异性抗体(bsigg1-hucd3-h101g-fealxb12-fear,bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear)没有显示任何细胞毒性。图16(ii)显示了使用不同供体(至少n＝3)测试的每种细胞系的平均ic50值。图17(i)显示了bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear在一批不同适应症细胞系中诱导的t细胞活化，如通过cd4+和cd8+t细胞上cd69(cd4+或cd8+群体内的cd69+细胞％)的上调测量。仅靶向肿瘤细胞或t细胞的对照双特异性抗体(bsigg1-hucd3-h101g-fealxb12-fear,bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear)不诱导任何t细胞活化。图17(ii)显示了使用不同供体(至少n＝3)测试的每种细胞系的平均ec50值。这些数据指示，bsigg1-hucd3-h101g-fealx5t4-207-fear可以特异性诱导胰腺癌和宫颈癌中t细胞介导的细胞毒性和t细胞活化，而对照双特异性抗体bsigg1-hucd3-h101g-fealxb12-fear和bsigg1-b12-fealx5t4-207-fear不诱导t细胞活化和t细胞介导的细胞毒性。参考文献1.zhaoetal.,2014structure22,612-6202.southalletal.,1990brjcancer61,89-953.sternandharrop,2017cancerimmunolimmunother66,415-426；southalletal.,1990brjcancer61,89-954.damelinetal.,2011cancerres71,4236-4246；carsbergetal.,1996intjcancer68,84-925.carsbergetal.,1996intjcancer68,84-926.kagermeier-schenketal.,2011devcell21,1129-11437.eisen,etal.,2014curroncolrep16,3708.sternandharrop,2017cancerimmunolimmunother66,415-426；scurretal.,2017jamaoncol12,109.scurretal.,2017jamaoncol12,10)10.wo200710674411.wo0303809812.wo201104836913.wo201304168714.wo201707220715.abdicheyn,yeungay,nii,stoned,milesa,morishigew,etal.(2017)antibodiestargetingcloselyadjacentorminimallyoverlappingepitopescandisplaceoneanother.plosone12(1):e0169535.doi:10.1371/journal.pone.0169535)16.wo2007/059782；genmaba/s17.wardetal.,nature341,544546(1989)18.holtetal；trendsbiotechnol.2003nov；21(11):484-9019.revetsetal；expertopinbiolther.2005jan；5(1):111-2420.birdetal.,science242,423426(1988)21.hustonetal.,pnasusa85,58795883(1988)22.fundamentalimmunologych.7(paul,w.,ed.,2nded.ravenpress,n.y.(1989)23.lefrancmp.etal.,nucleicacidsresearch,27,209-212,199924.brochetx.nucl.acidsres.36,w503-508(2008)25.abdicheyn,malashockds,pinkertona,ponsj.exploringblockingassaysusingoctet,proteon,andbiacorebiosensors.analbiochem.2009；386(2):172-180)26.wo92/2265327.ep062924028.kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.5thedition-usdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242,pp662,680,689(1991)29.riceetal.,2000,trendsgenet.16:276-27730.wo200710674431.shawetal.(2002),biochem.j.363:137-45,wo98/5560732.wo06/03165333.wuetal.,generationandcharacterizationofadualvariabledomainimmunoglobulin(dvd-igtm)molecule,in:antibodyengineering,springerberlinheidelberg(2010)34.wo2011/131746；genmaba/s35.wo/2002/020039；trionpharma/freseniusbiotech36.wo9850431；genetech37.wo2011117329；roche38.ep1870459；amgen39.wo2009089004；amgen40.us201000155133；chugai41.wo2010129304；oncomed42.wo2007110205；emdserono43.wo2010/015792；regeneron44.wo11143545；pfizer/rinat45.wo2012058768:zymeworks/merck46.wo2011028952；xencor47.wo2009/080254；roche48.wo2008003116；f-star49.us7,262,028；crucell/merus50.us7,612,181；abbott51.wo20100226923；unilever,sanofiaventis52.us007951918；biogenidec53.cn102250246；changzhouadambiotechinc54.wo2012025525；roche55.wo2012025530；roche56.wo2008157379；macrogenics57.wo2010/080538；macrogenics58.wo2008/11935359.wo2011/13174660.wo201500108561.shieldsetal.,2001,j.biol.chem.(276):6591-604)62.sykesandjohnston,natbiotech17,3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