一种红花檵木查尔酮异构酶LcCHI基因及其应用的制作方法

本发明所提供的查合酮异构酶基因是首次从红花檵木中克隆获得的。黄酮类物质是一种重要的植物次生代谢产物。查尔酮异构酶基因是黄酮类物质生物合成途径中的第二个限速酶类。该基因的成功克隆，为红花檵木的品种选育提供重要依据，也为黄酮类化合物富集的转基因植物株系研究提供基础。

背景技术：

本发明通过转录组测序的方法获得红花檵木查尔酮异构酶的cdna序列，pcr扩增得到查尔酮异构酶的orf全序列。利用本发明可以对红花檵木进行基因工程改造，利用转基因的方法对将lcchi转化到红花檵木中，以红花檵木中包括花青苷在内的黄酮类物质含量的提高；或者利用该基因进行红花檵木品种筛选与鉴定，得到高黄酮含量的植物品种等，为红花檵木中特定的目的次生代谢产物富集的提供基础。在红花檵木中克隆到查尔酮异构酶基因，是研究红花檵木中黄酮类物质合成途径的基础，能够为红花檵木品种选育提供理论依据，也为黄酮类物质含量高的转基因株系研究提供基础。

技术实现要素：

红花檵木(loropetalumchinensevar.rubrum)是我国特色的观花观叶植物，其花、叶中均可合成花青苷物质而显红色。红花檵木的红色叶片具有较高的观赏价值，但我国南方地区夏季持续高温会导致其叶片颜色由红变绿，观赏价值严重降低。目前，利用生理学研究方法对红花檵木叶色变化的机制开展了一些研究，并获得了红花檵木叶片响应高温、湿度和干旱条件下的叶色变化机制。然而，尚未有红花檵木中花青苷物质合成分子机制的研究，花青苷合成途径基因的克隆目前只有lcchs基因得到克隆。因此，开展红花檵木花青苷形成的分子机制的研究，筛选花青苷合成酶相关基因及功能鉴定，对于红花檵木的叶色育种有重要的意义。

在植物花青苷生物合成途径中，多个催化酶类参与了花青苷物质的合成。查尔酮异构酶(chalconeisomerase，chi)直接催化底物查尔酮形成二氢黄酮，是花青苷物质合成途径的第二个限速酶类，也影响了其他5种黄酮类物质(包括黄酮醇类、黄烷酮类、黄酮类、异黄酮类、黄烷醇类)的积累。因此，克隆出红花檵木的lcchi基因并对其功能进行研究，为红花檵木花青苷生物合成途径的研究提供基础，能够为红花檵木花色育种提供重要依据，也为黄酮类化合物富集的转基因植株研究提供物质。

2.1红花檵木查尔酮异构酶(以下均称为lcchi)编码基因的克隆

1)红花檵木叶片rna的提取及反转录第一链cdna

以红花檵木叶片为材料，利用北京艾德莱生物科技有限公司的植物多糖多酚试剂盒，按照其操作方法提取rna，获得了红花檵木叶片的总rna，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测(附图1：红花檵木总rna电泳图)，结果表明，红花檵木rna的28s和18s条带清晰，质量较好。

利用生工生物(上海)股份有限公司的m-mulv逆转录酶合成第一链cdna，反应步骤如下：

试剂：总rna7μl，oligo(dt)182μl，depc水1.5μl，总体积11.5μl混匀后，65℃水浴锅孵育5min，放置于冰上冷却。

按指定顺序加入以下组分：

试剂：5×reactionbuffer4μl，rnaseinhibitor0.5μl(20u)，dntpmix，2.5mmeach4μl，m-mulvreversetranscriptase1μl(200u)；总体积20μl。

轻轻混匀后短暂离心。42℃，1h；72℃10min终止反应。即获得红花檵木第一链cdna。

2.2红花檵木lcchi基因的分子克隆

基于转录组测序结果，利用primerpremier5.0软件，设计了可以克隆到红花檵木lcchi基因开放阅读框(openreadingframe，orf)序列的特异引物，上游引物chs-lp的核苷酸序列为：5'-gattcgttttcaatcacca-3'，下游引物chs-rp的核苷酸序列为：5'-aaccatcagcatttccctgt-3'。

pcr扩增红花檵木lcchi的cdna序列，

利用bbi的taqpcr预混液(2×)进行pcr，反应体系如下：

试剂：taqpcrmastermix12.5μl，chs-lp0.7μl，chs-rp0.7μl，cdna0.3μl，ddh2o10.8μl；总体积25μl。

反应程序为：94℃3min；94℃30s，51℃30s，72℃1min，35个循环反应；72℃2min。1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得了红花檵木lcchi的cdna片段(附图2：红花檵木lcchi的cdna序列扩增)。

pcr产物直接送华大基因进行第一代测序，测序引物分别为chi-lp和chi-rp。将测序结果与转录组测序结果进行比对，确定了红花檵木的开放阅读框序列。红花檵木lcchi基因的orf序列全长为657bp，编码218个氨基酸序列。

红花檵木lcchi的开放阅读框的核苷酸序列如下所示：

红花檵木lcchi基因的编码氨基酸序列如下所示：

2.3红花檵木lcchi基因的生物信息学分析

利用以下步骤对红花檵木lcchi基因进行生物信息学分析：

2.3.1将lcchi的orf序列在ncbi的在线软件blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行blastx，获得了与lcchi同源性高的多个植物查尔酮异构酶，并下载其中的5个同源chi基因。利用dnaman软件对红花檵木lcchi及其他5种植物chi的编码氨基酸进行序列比对，结果表明，红花檵木lcchi与来源于玫瑰rrchi(akt71851.1)、月季rcchi(xp_024176829.1)、茶树cschi(asu87415.1)、美洲葡萄vlchi(acs36662.1)和樱桃李pcchi(akv89240.1)的氨基酸序列进行同源性均很高，氨基酸的一致性均在75％以上(附图3：红花檵木lcchi氨基酸序列比对)，可见lcchi基因在进化上高度保守。对lcchi保守氨基酸进行分析，发现5个氨基酸残基arg(38)、thr(46)、tyr(108)、asn(115)和ser(192)执行lcchi酶的催化活性。

2.3.2使用mega6.0软件，对红花檵木lcchi氨基酸序列，以及来源于红花檵木lcchi、玫瑰rrchi、月季rcchi、茶树cschi、美洲葡萄vlchi、樱桃李pcchi、橄榄cachi(aeo36936.1)、龙眼dlchi(aeo36980.1)、美洲葡萄vlchi(acs36662.1)、牡丹pschi(aek70330.1)、芍药plchi(aek32592.1)、烟草ntchi(np_001312216.1)、矮牵牛phchi(caa32730.1)、水稻oschi(aam13448.1)和玉米zmchi(np_001144002.2)的氨基酸序列进行系统进化树构建(附图4：系统进化树构建)。红花檵木lcchi的序列与玫瑰、月季、樱桃李等木本植物的同源性更高。

利用在线软件swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)对lcchi进行三级结构预测，结果表明，以该蛋白的三级结构模型的gmqe值为0.85、qmean值0.45，与序列一致性为74.16％，可见lcchi与模板蛋白拟南芥atchi1的匹配度很好(附图5：红花檵木lcchi的三级结构预测)。lcchi蛋白的结构主要由8个α螺旋和11个β折叠片形成球形蛋白，且在催化区域有两个硝酸根离子(no3^-)。

2.4红花檵木lcchi基因的过表达载体构建及转基因

利用红花檵木lcchi基因的orf序列信息，设计特异引物chi-atg和chi-tga扩增lcchi的orf序列。

chi-atg引物序列为：5'-ccaaatcgactctagaatggctaaagtactgcacg-3’；

chi-tag引物序列为：5'-tcgaccccgggcccctgcagctaggcctccttcaataattca-3’.

以叶片cdna为模板进行pcr扩增，chi-atg和chi-tag为引物进行pcr扩增。pcr扩增体系为25μl：5×gxlbuffer5μl，dntpmixture(2.5mmoleach)2μl，上、下游引物各0.7μl，cdna模板0.3μl，primestargxldna聚合酶0.5μl，ddh2o补足至25μl。扩增程序为：94℃2min；98℃10s，55℃15s，68℃1min，共35个循环反应。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物胶回收后用无缝克隆酶连接到过表达载体psuper1300上。

lcchi的过表达载体plcchi-super1300图谱(附图6：plcchi-super1300过表达载体示意图)。

重组质粒转化dh5α感受态。质粒转化大肠杆菌dh5α方法：

1)从-80℃冰箱内取出大肠杆菌dh5α感受态细胞，迅速插入冰盒内，使其溶解。

2)加入重组质粒并轻轻混匀，冰中放置30min。

3)42℃水浴热激45s，迅速放回冰中放置2min左右，注意不要晃动。添加700μl不含抗生素的无菌培养基，混合均匀。

4)37℃振荡培养1h(160-225rpm)，吸取适量体积均匀涂布到含kan抗生素的lb琼脂培养基平板中。37℃正置至液体被吸收，然后倒置过夜培养。

阳性克隆菌经pcr鉴定(附图7：plcchi-super1300重组质粒转化大肠杆菌的菌落pcr鉴定)，证实为阳性后送华大基因测序鉴定，确定载体构建成功。

提取测序正确的阳性菌质粒，并将plcchi-super1300质粒转化到agl0农杆菌感受态中。质粒转化农杆菌agl0感受态方法如下：

1)从-80℃冰箱中取出agl0感受态100ul，迅速插入冰盒内，使其溶解。

2)加入10ulplcchi-super1300质粒并轻轻混匀，冰中放置30min。

3)放到-80℃冰箱中10min，迅速置于42℃水浴锅中热激1min，再置于冰上2-3min。

4)加入900ul无抗生素lb培养基，于28℃、200rpm摇床中震荡培养3个小时。吸取适量体积均匀涂布到含rif+kan抗生素的lb琼脂培养基平板中。28℃正置至液体被吸收，然后倒置培养约48h。

农杆菌阳性菌菌落pcr鉴定，确定获得了阳性菌(附图8：plcchi-super1300质粒转化农杆菌的菌落pcr鉴定)。

采用农杆菌花序浸染法转化拟南芥，具体方法如下：

1)培养菌液至od600达0.8－1.5；

2)制备重悬渗透培养液(1l)：1/2ms，50g蔗糖，0.5gmes，500μlsilwetl-77，ph5.7。；

3)离心，5000rpm，15min，收集菌体，弃上清，并倒置在消过毒的纸巾上，用5ml重悬渗透培养液重悬，然后加上剩余的悬浮液，使od600至1.0-1.5。

4)转化。将上述农杆菌菌液倒在小烧杯里，静置1h后，将刚开花的拟南芥花序部分浸没于菌液上，2-3min以后取出来，侧置于托盘上，避光、保湿生长，24h后将其直立生长。

5)根据情况在培养3-4天或者一周后，再侵染一次，待种子成熟以后，收获种子。

收获的转化种子在潮霉素浓度为25ug/l的ms培养基上筛选，阳性苗能够正常生长，筛选7-10天后将阳性苗移到营养生长土(腐殖土：珍珠岩：蛭石＝4:1:1)中继续生长，直至收种子。

附图说明

图1为红花檵木总rna电泳图；

图2为红花檵木lcchi的cdna序列扩增；

图3为红花檵木lcchi氨基酸序列比对；

图4为系统进化树构建；

图5为红花檵木lcchi的三级结构预测；

图6为plcchi-super1300过表达载体示意图；

图7为plcchi-super1300重组质粒转化大肠杆菌的菌落pcr鉴定；

图8为plcchi-super1300质粒转化农杆菌的菌落pcr鉴定。