本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一株海洋真菌来源的新型骨架杂萜衍生物及其在制备抗炎药物中的应用。
背景技术：
炎症是当机体受到外来抗原性刺激，产生的一种防御性反应。巨噬细胞是机体内重要的一种免疫细胞，具有调控炎症因子，抗感染，抗肿瘤，免疫调节的作用。目前认为，巨噬细胞及其释放的炎症介质参与了多种炎症性疾病的发生与发展，例如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、炎症性肠病、败血症、痛风性关节炎等。
目前，临床上常用的抗炎药主要有两类：非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。虽然这两类抗炎药都有一定的临床抗炎效果，但是长期大量使用这些药物会产生一系列不良反应、副作用和耐受性，如胃粘膜损伤、肝脏损伤、肾脏损害等，给患者带来了很大的负担和损伤。因此，亟需寻找新的抗炎药物来代替现有非甾体抗炎药和甾体类抗炎药，以解决患者对现有抗炎药的耐受性及现有抗炎药对患者的不良反应。
海洋真菌的次级代谢产物是天然产物的重要组成部分，具有可持续性，对环境友好，代谢产物丰富多样等特点，一直是天然药物筛选的重要源头；同时，海洋真菌的次级代谢产物具有广泛的生理活性，如抗菌、抗肿瘤、免疫调节、抗炎和酶抑制等。目前，从海洋真菌中寻找新的药源分子已成为国际国内研究的热点。本申请人在前期的研究工作中，从海蟹躯干中分离筛选得到了一株海洋真菌diaporthesp.gzu-1021，并由该真菌发酵生产得到了一种萘醌类化合物，该化合物具有很好的抗炎活性，能够显著抑制lps诱导的no产生，表明海洋真菌在发酵生产具有抗炎活性的化合物方面具有潜能。因此，分离筛选更多的海洋真菌来发酵生产更多具有抗炎活性的化合物，对于治疗炎症类疾病具有重要意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有抗炎药对患者具有副作用、不良反应和耐受性的缺陷和不足，提供一株海洋真菌来源的新型骨架杂萜衍生物及其在制备抗炎药物中的应用。
本发明的目的是提供一株海洋真菌aspergillusterreusgzu-311。
本发明另一目的是提供所述海洋真菌aspergillusterreusgzu-311在发酵生产杂萜类衍生物中的应用。
本发明又一目的是提供一种杂萜类衍生物。
本发明又一目的是提供所述杂萜类衍生物的制备方法。
本发明再一目的是提供所述杂萜类衍生物在制备抗炎药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一株海洋真菌aspergillusterreusgzu-311，该菌株已于2019年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为gdmccno：60789，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
所述海洋真菌aspergillusterreusgzu-311在发酵生产杂萜类衍生物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种杂萜类衍生物，所述衍生物的结构式如式(i)、式(ii)或式(iii)所示：
本发明还提供了所述杂萜类衍生物的制备方法，利用所述海洋真菌aspergillusterreusgzu-311发酵生产得到。
优选地，所述杂萜类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
s1.将所述海洋真菌aspergillusterreusgzu-311接种液体培养基，培养得种子液；
s2.将步骤s1的种子液接种到固体大米培养基中，于28℃～35℃静置30～60d，得发酵培养产物；
s3.将步骤s2的发酵培养产物用甲醇提取2～5次，浓缩提取液，将得到的浓缩浸膏用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯粗提物；
s4.将步骤s3的乙酸乙酯粗提物用正相硅胶色谱层析进行分离后，用石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集10％～50％石油醚/乙酸乙酯部分，再以硅胶、凝胶和c-18反相柱层析分离技术进行分离纯化，即得所述杂萜类衍生物。
优选地，步骤s1所述斜面培养基的配方为：以质量比计，葡萄糖0.3％，酵母提取物0.1％，蛋白胨0.1％～0.5％，琼脂1.5％～2.5％，氯化钠1.5％～4％，余量为水。
更优选地，步骤s1所述斜面培养基的配方为：以质量比计，葡萄糖0.3％，酵母提取物0.1％，蛋白胨0.5％，琼脂2.5％，氯化钠3％，余量为水。
优选地，步骤s1所述培养的温度为28℃～35℃。
更优选地，步骤s1所述培养的温度为30℃。
优选地，步骤s1所述培养的时间为4～10d。
更优选地，步骤s1所述培养的时间为6d。
优选地，步骤s2所述固体大米培养基的配方为：以质量比计，大米：海水＝1：1～2。
更优选地，步骤s2所述固体大米培养基的配方为：以质量比计，大米：海水＝1：1。
优选地，步骤s2所述静置的温度为35℃。
优选地，步骤s2所述静置的时间为60d。
优选地，步骤s3所述甲醇提取的次数为3次。
优选地，步骤s4所述石油醚/乙酸乙酯是指石油醚/乙酸乙酯体积比的混合物。
本发明经过创造性的探索研究，发现所述杂萜类衍生物显著抑制lps诱导的no产生，具有很好的抗炎活性，能够用于制备抗炎药物。因此，所述杂萜类衍生物在制备抗炎药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用为在制备抑制lps诱导no产生的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株海洋真菌来源的新型骨架杂萜衍生物及其在制备抗炎药物中的应用。本发明从瘤背石磺的躯干中分离筛选得到了一株海洋真菌aspergillusterreusgzu-311，并从该真菌的发酵培养产物中分离鉴定得到了杂萜类衍生物，该衍生物具有较强的抗no产生的活性，其抗炎活性比阳性对照吲哚美辛显著提高2倍左右，且该衍生物在ic50浓度下，不显示有细胞毒活性，具有很大的安全系数。因此，本发明提供的杂萜类衍生物在制备抗炎药物、尤其是制备抑制lps诱导no产生的药物中具有良好的临床应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1海洋真菌aspergillusterreusgzu-311的获得
1、实验方法
发明人团队从广东省湛江市徐闻县沿海瘤背石磺的躯干中分离得到一株海洋真菌，参考文献(natureprotocols,2010,5,480-490；journalofnaturalproducts,2006,69,11,1622-1625)：采用dneasyplantminikit试剂盒，依据说明书的步骤提取该海洋真菌的dna，以dna为模板扩增its区域，测序得到该海洋真菌的its-rrna基因序列，通过序列结果进行鉴定。
2、实验结果
海洋真菌的its-rrna基因序列如seqidno.1所示，通过blast数据库进行相似度检索，经比较，该序列与aspergillusterreus真菌序列相似度达99％以上；因此，鉴定该海洋真菌属于海洋真菌aspergillusterreus，命名为：海洋真菌aspergillusterreusgzu-311，并于2019年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为gdmccno：60789，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
实施例2杂萜类衍生物的分离鉴定
本实施例利用海洋真菌aspergillusterreusgzu-311发酵生产得到杂萜类衍生物，具体的实验方法和实验结果如下：
1、衍生物的分离
衍生物的制备方法包括以下步骤：
s1.将实施例1筛选得到的海洋真菌aspergillusterreusgzu-311接种平面培养基，然后接种到液体培养基中，30℃培养6d得种子液；
s2.将步骤s1的种子液接种到固体大米培养基中，于35℃静置60d，得发酵培养产物；
s3.将步骤s2的发酵培养产物用甲醇提取3次，浓缩提取液，将得到的浓缩浸膏用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯粗提物；
s4.将步骤s3的乙酸乙酯粗提物用正相硅胶色谱层析进行分离后，用石油醚/乙酸乙酯(石油醚/乙酸乙酯体积比分别为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30)进行梯度洗脱，收集10％～50％石油醚/乙酸乙酯部分，再以硅胶、凝胶和c-18反相柱层析分离技术进行分离纯化，即得所述衍生物1、2和3；
其中，斜面培养基的配方为：以质量比计，葡萄糖0.3％，酵母提取物0.1％，蛋白胨0.5％，琼脂2.5％，氯化钠3％，余量为水；
固体大米培养基的配方为：以质量比计，大米：海水＝1：1。
2、衍生物的鉴定
对衍生物1、2和3进行结构测试解析，得到以下实验数据：
衍生物1的分子式：c28h32o10，高分辨质谱(hresi-ms)：527.1902[m-h]-(caldforc28h31o10527.1917)；
衍生物2的分子式：c28h32o10，高分辨质谱(hresi-ms)：527.1914[m-h]-(caldforc28h31o10527.1917)；
衍生物3的分子式：c28h34o10，高分辨质谱(hresi-ms)：529.2056[m-h]-(caldforc28h31o10529.2073)。
衍生物1、2和3的核磁共振(nmr)数据分别如表1所示。
表1衍生物1、2和3的nmr数据(cdcl3，400mhz/100mhz,ppm)
所述衍生物1、2和3的结构式分别如式(i)、式(ii)或式(iii)所示：
实施例3杂萜类衍生物的抗炎细胞筛选模型及细胞毒性筛选研究
当外源性抗原脂多糖lps刺激巨噬细胞时，会产生一系列的免疫反应，同时会释放炎症因子no2-，no2-水平的高低可以间接反映炎症的程度。griess试剂是一种可以与no2-相互作用产生有色素的偶氮染料化合物，可通过酶标仪检测染料的吸光度强弱来判断no2-的水平，从而利用此模型筛选具有抗炎活性的小分子抑制剂。因此，本实施例采用以下实验来研究证明杂萜类衍生物的抗炎作用。具体的实验方法和实验结果如下：
1、抗炎细胞筛选模型
1)实验方法
(1)细胞的培养与处理
将raw264.7细胞培养在含有10％血清的dmem培养基(青霉素60u/ml，链霉素100μg/ml)中，放置在5％co2的培养箱中，设置温度为37℃，进行常规维持培养和传代。
(2)化合物干预
培养一代后待细胞稳定后，将其铺在96孔板中，浓度为2×104cells/well，贴壁24小时；将实施例2得到的衍生物1、2和3的母液分别溶于dmso中，用dmem培养基稀释，保证其dmso的浓度不高于0.1％；将不同浓度梯度的衍生物1、2和3(2～50μm，终浓度)分别作用于96孔板中(200μl，lps:1μg/ml)，同时设置阳性对照组(吲哚美辛)；用griess试剂盒测定no的抑制效果，即100μl细胞上清液混有等体积的griess试剂(0.2％naphthylenediamidedihydrochloride和2％sulfanilamidein5％h3po4)；在540nm波长下用酶标仪测试其吸光度，根据添加的衍生物1和阳性对照的吸光度来判断其抑制效果；亚硝酸钠用来制作标准曲线，同时该实验平行测试三次；抑制率的计算公式为：
抑制率(％)＝([no2-]lps-[no2-]lps+sample)/([no2-]lps-[no2-]untreated)×100。
2)实验结果
衍生物1、2和3的抗炎活性实验结果如表2所示，可以看出，衍生物1、2和3均显示了较强的抗no产生的活性，其ic50分别为17.8μm，14.1μm，13.4μm，而阳性对照吲哚美辛的ic50为24.0μm；表明衍生物1、2和3的抗炎活性比阳性对照吲哚美辛显著提高2倍左右。
表2衍生物1、2和3的抗炎活性实验结果
2、细胞毒性筛选
1)实验方法
(1)原理
依据mtt法来测定，mtt的化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，其商品名为：噻唑蓝。其检测原理为：活细胞和死细胞的区别在于，活细胞中线粒体中存在琥珀酸脱氢酶，能使外源性的mtt还原为水不溶性的蓝色结晶甲臢。二甲基亚砜(dmso)可以溶解沉积在细胞内的甲臢，依据加入化合物的干预组和阳性对照组，在490或者540nm波长处测定其吸光度，可间接反映细胞存活的数量。
(2)细胞毒性筛选实验
将raw264.7细胞培养在含有10％血清的dmem培养基(青霉素60u/ml，链霉素100μg/ml)中，放置在5％co2的培养箱中，设置温度为37℃；
培养一代后待细胞稳定后，将其铺在96孔板中，浓度为2×104cells/well，贴壁24小时；将实施例2得到的衍生物1、2和3的母液分别溶于dmso中，用dmem培养基稀释，保证其dmso的浓度不高于0.1％；将不同浓度梯度的衍生物1、2和3(2～50μm，终浓度)作用于96孔板中(200μl，lps：1g/ml)；
培养作用24小时后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml，用pbs配置)20μl，继续孵育4小时，终止培养，小心吸取上清液，每孔加入150μl的dmso，震荡10min，使结晶充分溶解；通过酶标仪检测490nm波长的吸收，记录结果。
通过如下公式计算抑制率：抑制率(％)＝[(a0–a)/a0]×100％，其中，a0为空白对照的吸光度od值，a为样品的吸光度od值。
测定5个浓度的衍生物1、2和3样品，绘制剂量-抑制率曲线，得出其ic50值；每个样品重复测定三次，结果用平均值±标准偏差表示。
2)实验结果
衍生物1、2和3的细胞毒性筛选结果如表2所示，可以看出，衍生物1、2和3在ic50浓度下，不显示有细胞毒活性，具有很大的安全系数。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>广州中医药大学(广州中医药研究院)
<120>一株海洋真菌来源的新型骨架杂萜衍生物及其在制备抗炎药物中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>614
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ccttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgcgggtctttatggcccaacc60
tcccacccgtgactattgtaccttgttgcttcggcgggcccgccagcgtttgctggccgc120
cggggggcgactcgcccccgggcccgtgcccgccggagaccccaacatgaaccctgttct180
gaaagcttgcagtctgagtgtgattctttgcaatcagttaaaactttcaacaatggatct240
cttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaa300
ttcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatg360
cctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggccctcgtcccccg420
gctcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatg480
gggcttcgtcttccgctccgtaggcccggccggcgcccgccgacgcatttatttgcaact540
tgttttttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatc600
aataagcggaggaa614