一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及一种维生素c糖苷的制备，特别涉及一种蔗糖磷酸化酶在制备2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-2g)中的应用。

(二)技术背景

l-抗坏血酸(又称维生素c，vc)是一种常见的水溶性维生素和人体所必须的营养元素，其结构如图1所示。缺乏vc会引起坏血病，心脏病，癌症等疾病，由于人体无法合成vc，因此必须从食物中获取。此外，也可作为调味剂，还原剂，抗氧化剂，漂白剂等，广泛应用于食品，饲料，化妆品和医药等领域。由于vc含连烯二醇结构，c2位的氢氧根很容易被氧化，在空气中极不稳定，往往需要衍生化修饰，包括vc棕榈酸酯、vc甲基醚和vc糖苷。其中vc-糖苷具有稳定性强、安全性高、水溶性好和体内容易释放vc等优点。vc上存在多个糖基化位点，如图1所示，其中aa-2g的稳定性最好，也是通常所指的vc糖苷产品。aa-2g进入体内后能被α-葡萄糖苷酶分解为vc和d-葡萄糖，使vc可以在体内保持有活性的烯醇式结构，是vc的最佳替代品。所以，目前aa-2g被广泛应用于化妆品、食品、医疗保健及畜牧业个水产养殖等行业。

目前aa-2g的成熟生产技术是由日本林原公司在上世纪九十年代开发的，依赖耐高温环糊精糖基化转移酶和糖化酶的两步法生产技术(agah,etal.1991,agriculturalandbiologicalchemistry55(7):1751-1756)。近几年，一步法aa-2g的生产工艺取得显著的进步，即采用来源于长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)的蔗糖磷酸化酶的一步糖基化法(gudiminchirk,etal.chembiochem2017,18(14):1387-1390)。但仍存在缺点：①反应速率慢，催化时间过长(72h以上)；②底物vc的转化率低(约40％)；③酶的用量大。

本发明提供了一个更加高效实现一步法生产aa-2g的蔗糖磷酸化酶，即来源于短双歧杆菌(bifidobacteriumbrevis)的蔗糖磷酸化酶，分别通过大肠杆菌(escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)制备蔗糖磷酸化酶用于aa-2g的生产。

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是芽孢杆菌属的一种土壤来源的革兰氏阳性细菌。与大肠感菌相比，其作为一种更加有吸引力的外源基因表达宿主，其优点包括：不产生任何内毒素、无致病性；被认为是一种gras安全菌株；枯草芽孢杆菌只有一层膜，不具有外膜结构，酶的分泌能力较强；营养要求低；遗传背景清晰；已有大量关于其转录和翻译机制、大规模发酵的信息；无显著密码子使用偏好性等等。因为其特有的优势，枯草芽孢杆菌已成为了目前生产各种工业酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的理想宿主菌株。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种利用蔗糖磷酸酶高效制备2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-2g)的重组工程菌及方法，即将短双歧杆菌(bifidobacteriumbrevis)来源的蔗糖磷酸化酶基因分别克隆至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌而构建的重组工程菌，并将工程菌应用于制备2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-2g)的方法，实现生物法一步催化转化高效生产aa-2g。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种蔗糖磷酸化酶在制备2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸(aa-2g)中的应用，所述蔗糖磷酸化酶源于短双歧杆菌(bifidobacteriumbrevis)，所述的蔗糖磷酸化酶基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2(ncbi登录号：aud75790)所示。

本发明所述的蔗糖磷酸化酶包括与seqidno.2所示氨基酸序列≥95％同源性(优选地，≥96％的同源性；更优选地≥97％的同源性；最优选地，≥98％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；以及将seqidno.2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽。

进一步，所述的应用以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵获得的发酵液或发酵液离心后的湿菌体用缓冲液或去离子水重悬的破碎液为催化剂，以l-抗坏血酸(即vc)为底物，以蔗糖为辅助底物，以ph为4.8-6.0(优选5.0-5.5)的缓冲液或去离子水为反应介质构成反应体系，在30-55℃(优选40-45℃)的条件下进行反应，获得含aa-2g的反应液，分离纯化获得aa-2g。所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为5-50g/l(优选20-30g/l)，底物终浓度为50-250g/l(优选100-250g/l)，所述蔗糖终浓度为200-400g/l(优选250-300g/l)。

进一步，所述l-抗坏血酸以ph5.2、0.45kg/l的vc水溶液的形式加入。

进一步，所述反应在30-50℃(优选40-45℃)，ph4.8-6.0(优选5.0-5.5)之间，反应40-90h(优选50-70h)。

进一步，所述含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌以大肠杆菌(escherichiacoli)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtillus)为宿主构建成重组大肠杆菌(优选(e.coli)bl21(de3))或重组枯草芽孢杆菌(优选枯草芽孢杆菌wb800)。

进一步，所述的重组大肠杆菌按如下方法构建：将seqidno.1所述的蔗糖磷酸化酶基因，克隆至表达pet28a上的bamhi和ndei之间，获得重组表达质粒pet28a-bbrsp，将其转化到大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)中，得到重组大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)(pet28a-bbrsp)，记为大肠杆菌(e.coli)ief-bbrsp。

进一步，所述重组枯草芽孢杆菌按如下方法构建：将seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶基因克隆到枯草芽孢杆菌的表达质粒上构建重组表达质粒pp43-bbrsp，将其转化枯草芽孢杆菌(bacillussubtillus)wb800中，得到重组枯草芽孢杆菌b.subtiliswb800(pp43-bbrsp)，记为枯草芽孢杆菌b.subtilisief-bbrsp。

进一步，所述蔗糖磷酸化酶基因以大肠杆菌为宿主时，所述的应用为：以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵获得的发酵液离心后的湿菌体用ph为4.8-6.0(优选5.0-5.5)缓冲液或去离子水重悬的破碎液为催化剂，以l-抗坏血酸(即vc)为底物，以蔗糖为辅助底物，以ph为4.8-6.0(优选5.0-5.5)的缓冲液或去离子水为反应介质构成反应体系，在30-55℃(优选40-45℃)的条件下进行反应，获得含aa-2g的反应液，分离纯化获得aa-2g。

进一步，所述蔗糖磷酸化酶基因以枯草芽孢杆菌为宿主时，所述的应用为：以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵获得的发酵液为催化剂，以l-抗坏血酸(即vc)为底物，以蔗糖为辅助底物，以ph为4.8-6.0(优选5.0-5.5)的去离子水为反应介质构成反应体系，在30-55℃(优选40-45℃)的条件下进行反应，获得含aa-2g的反应液，分离纯化获得aa-2g。

进一步，所述蔗糖磷酸化酶基因以大肠杆菌为宿主时，所述重组大肠杆菌发酵液按如下方法制备：

(1)新鲜种子液培养：将含蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌接种在含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，30-37℃，100-250rpm(37℃，200rpm)培养至对数生长中期，获得种子液，所述lb培养基为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0；

(2)2.5l发酵罐中制备发酵液：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/l的大肠杆菌发酵培养基中，30℃培养4h，加入终浓度为10g/lα-乳糖，控制发酵温度23℃，溶解氧do控制大于20％，用25％的氨水控制发酵ph6.8，继续发酵12h，获得湿菌体的含量为30g/l的发酵液。

(3)5l发酵罐中的分批补料发酵：将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/l卡那霉素的大肠杆菌发酵培养基中，32℃培养7h；加入终浓度为5-22g/l(优选15g/l)的α-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧do控制大于20％，用25％的氨水控制发酵ph6.8，开始以35ml/min恒速补料甘油溶液，继续发酵15-30h(优选24h)，甘油共计补料20-150g/l(优选140g/l)起始发酵培养基，获得发酵液；所述甘油溶液终浓度组成：甘油350g/l，生物素4.5mg/l，mgso4·7h2o10g/l，溶剂为水；所述大肠杆菌发酵培养基质量终浓度组成：酵母粉12g/l、蛋白胨15g/l、甘油10g/l、na2hpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.3g/l，溶剂为去离子水，ph6.8-7.0。

进一步，所述蔗糖磷酸化酶基因以枯草芽孢杆菌为宿主时，本发明所述重组枯草芽孢杆菌发酵液按如下方法制备：

(1)新鲜培养种子液：将含蔗糖磷酸化酶基因的重组枯草芽孢杆菌接种在含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，100-250rpm培养至对数生长中期，获得种子液，所述lb培养基终浓度组成：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0；

(2)5l发酵罐中的分批补料发酵：将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/l卡那霉素的发酵培养基中，控制温度37℃，溶解氧do控制大于20％，用25％的氨水控制发酵ph6.8-7.5(优选ph7.0)；开始发酵的前8小时内，从0ml/h/l起始发酵培养基匀速增加至60ml/h/l起始发酵培养基的速率添加补料培养基；发酵8小时后，将补料速率降至30ml/h/l起始发酵培养基，继续培养20h，获得发酵液；所述补料培养基为葡萄糖200g/l葡萄糖水溶液；所述枯草芽孢杆菌发酵培养基质量终浓度组成：酵母粉50g/l、蛋白胨30g/l、kh2po46g/l、葡萄糖10g/l、柠檬酸钠1g/l，溶剂为去离子水，ph6.8-7.0。

本发明所述大肠杆菌发酵液的破碎液制备方法为：将大肠杆菌发酵液离心，取湿菌体重新悬浮于ph4.8.0-6.0(优选ph5.2)，10-100mm(优选50mm)柠檬酸钠缓冲液或去离子水中，用高压匀浆仪将菌体破碎。

本发明所述的枯草芽孢杆菌发酵液，可直接加入去离子水稀释后，用于催化反应。

与现有技术(agriculturalandbiologicalchemistry55(7):1751-1756；chembiochem.2017,18(14):1387-1390)相比，本发明有益效果体现在：①采用b.brevis来源的蔗糖磷酸化酶，可实现一步法的更高效率的生产aa-2g，即45h内催化生产156g/l的aa-2g，其生产效为3.47g·l^-1·h^-1，较现有报道的b.longum来源的蔗糖磷酸化酶提高了34.5％，其最高的aa-2g浓度可达178g/l；②本发明重组枯草芽孢杆菌能够高效分泌表达蔗糖磷酸化酶，将发酵液直接用于食品级aa-2g的制备。

(四)附图说明

图1为aa-2g结构式。

图2为pet28a-bbrsp载体的结构示意图。

图3为pp43-bbrsp载体的结构示意图。

图4vc、aa-2g的hplc分析图谱。

图5aa-2g的hplc分析的标准曲线。

图6短双歧杆菌来源与长双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶催化活性的比较。

(五)具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

lb培养基：酵母粉5.0g/l，蛋白胨10g/l、nacl10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。

tb培养基组成：酵母粉24g/l、蛋白胨12g/l、甘油4ml、kh2po42.3g/l、k2hpo412.5g/l，溶剂为去离子水，ph6.8-7.0。

大肠杆菌的发酵培养基质量组成：酵母粉12g/l、蛋白胨15g/l、甘油10g/l、na2hpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.3g/l，溶剂为去离子水，ph6.8-7.0。

枯草芽孢杆菌的发酵培养基质量组成：酵母粉50g/l、蛋白胨30g/l、kh2po46g/l、葡萄糖10g/l、柠檬酸钠1g/l，溶剂为去离子水，ph6.8-7.0。

实施例1构建含蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌工程菌

参考ncbi数据库上的短双歧杆菌(bifidobacteriumbrevis)来源的蔗糖磷酸化酶基因bbrsp序列(ncbi登录号no.cp021391，基因即为seqidno.1所示)和长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)来源的蔗糖磷酸化酶blosp基因序列(ncbi登录号no.ay236071)，交由基因合成公司(华大基因青兰生物科技有限公司)，人工合成蔗糖磷酸化酶基因bbrsp和蔗糖磷酸化酶基因blosp，分别克隆到表达载体pet28a的ndei/bamhi之间，获得重组质粒pet28a-bbrsp和重组质粒pet28a-blosp。

将重组质粒pet28a-bbrsp和重组质粒pet28a-blosp分别转化到表达宿主e.colibl21(de3)中，具体操作如下：取2μl重组质粒pet28a-bbrsp或重组质粒pet28a-blosp，加入到100μl的e.colibl21(de3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μl不含抗生素的lb培养基，37℃孵育60min使其抗性复苏。5000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μl，均匀涂布在含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。挑取菌落pcr为阳性的克隆，经过划线纯化和摇床培养，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到验证正确的阳性克隆子。

将含重组质粒pet28a-bbrsp和重组质粒pet28a-blosp的阳性克隆子e.colibl(de3)(pet28a-bbrsp)和e.colibl(de3)(pet28a-blosp)命名为重组大肠杆菌e.coliife-bbrsp和重组大肠杆菌e.coliife-blosp，即得到2个能够高效表达蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌工程菌株。

实施例2、制备生产aa-2g的发酵液菌剂

将实施例1制备的e.coliife-bbrsp接种在含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。

2.5l发酵罐中制备bbrsp发酵液：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/l的大肠杆菌发酵培养基中，30℃培养4h，加入终浓度为10g/lα-乳糖，控制发酵温度23℃，溶解氧do控制大于20％，用25％的氨水控制发酵ph6.8，继续发酵12h，获得湿菌体含量为30g/l的发酵液，记为bbrsp发酵液。blosp发酵液的制备方法同bbrsp发酵液。

离心发酵液，用ph5.2，50mm柠檬酸钠缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

实施例3比较短双歧杆菌bbrsp与长双歧杆菌blosp的催化能力

1、发酵液催化活性的检测

短双歧杆菌bbrsp催化反应体系：将实施例2方法制备的bbrsp发酵液离心，取湿菌体细胞5.0g重新悬浮于50ml的ph5.2，50mm柠檬酸钠缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入0.45kg/l的vc水溶液、蔗糖和去离子水构成100ml反应体系，使vc终浓度210g/l，蔗糖终浓度270g/l，再次调整ph为5.2，在45℃水浴锅中，搅拌催化反应5h；反应液用于hplc分析，其中bbrsp催化形成产物aa-2g的浓度为20g/l，结果表明bbrsp发酵液催化生产aa-2g的活性正常。

hplc分析：取10μl反应液，加入900μl的0.01mol/l稀盐酸中，12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液用超纯水稀释到1/100体积后加入液相样品瓶中；色谱柱：c18柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：k2hpo4·3h2o：0.57g/l，溶剂为超纯水；磷酸调ph＝2.00；流速：1ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl。

长双歧杆菌blosp的催化反应体系：将短双歧杆菌的bbrsp催化反应体系中bbrsp发酵液替换为实施例2方法制备的blosp发酵液，其他操作相同，反应液用于hplc分析，blosp催化产生产物aa-2g的浓度为12g/l，结果表明blosp发酵液催化合成aa-2g的活性正常。

2、比较短双歧杆菌bbrsp与长双歧杆菌blosp催化制备aa-2g的生产曲线

短双歧杆菌bbrsp：取实施例2方法制备的bbrsp发酵液离心，取湿菌体3g，重新悬浮于100ml的ph5.2，50mm柠檬酸钠缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入ph5.2、0.45kg/l的vc水溶液，并加入蔗糖，用ph5.2，50mm柠檬酸钠缓冲液定容至200ml，即湿菌体细胞含量为15g/l，vc终浓度210g/l，蔗糖终浓度为270g/l，再次调节反应ph5.2，将反应液加入到棕色烧瓶中，在45℃水浴锅中，磁力搅拌，催化反应87h，定期取样用于hplc分析，aa-2g的生产曲线如图6所示。

长双歧杆菌blosp：取实施例2方法制备的blosp发酵液离心，取湿菌体3g，重新悬浮于100ml的ph5.2，50mm柠檬酸钠缓冲液中，用高压匀浆仪将菌体破碎，加入ph5.2、0.45kg/l的vc水溶液，并加入蔗糖，ph5.2，50mm柠檬酸钠缓冲液定容至200ml，即湿菌体细胞含量为15g/l，vc终浓度210g/l，蔗糖终浓度为270g/l，调节反应ph5.2，将反应液加入到棕色烧瓶中，在40℃水浴锅中，磁力搅拌，催化反应93h，定期取样用于hplc分析，产物aa-2g生产曲线如图6所示。

结果表明，与长双歧杆菌blosp相比(chembiochem2017,18(14):1387-1390)，本发明提供的短双歧杆菌bbrsp具有更高的催化效率，如反应87h，bbrsp产生了175g/l的aa-2g，而blosp催化93h产生160g/l的aa-2g。催化反应45h时，bbrsp催化得到156g/l的aa-2g，其产率为3.47g·l^-1·h^-1，而blosp催化得到116g/l的aa-2g，其产率为2.58g·l^-1·h^-1。bbrsp的产率较blosp提高了34.5％，这可能与bbrsp具有更高的最适催化温度(45℃)和更好的热稳定性相关。

实施案例4、重组大肠杆菌ief-bbrsp在生产aa-2g中的应用

1、5l发酵罐中催化剂制备及其在15l反应体系中转化的应用

(1)菌种活化

实施例1制备的大肠杆菌ief-bbrsp接种在含有50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

(2)5l发酵罐中的催化剂制备

将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到2.0l的含质量浓度0.05％消泡剂和50mg/l卡那霉素的大肠杆菌发酵培养基中，32℃培养7h；加入终浓度为15g/l的α-乳糖，控制发酵温度24℃，溶解氧do控制大于20％，用25％的氨水控制发酵ph6.8，开始以35ml/min恒速补料800ml的甘油溶液(甘油350g/l，生物素4.5mg/l，mgso4·7h2o10g/l，溶剂为水)，补料发酵24h，得到用于生产aa-2g的大肠杆菌ief-bbrsp发酵液，湿菌体含量为90g/l。

(3)15l体系的催化转化制备aa-2g

取步骤(2)制备的大肠杆菌ief-bbrsp发酵液，离心收集湿菌体300g，重新悬浮于8l去离子水中，用高压匀浆仪破碎细胞得到细胞破碎液，加入3.9kg蔗糖使其终浓度260g/l，加入ph5.2、0.45kg/l的vc水溶液(称取3.15kg的vc，加入7l去离子水溶解，用固体naoh调节ph5.2)使vc终浓度210g/l，再次调节ph5.2并加去离子水定容至15l，将底物混合后安装全自动机械搅拌，在45℃条件下进行催化反应65h后，得到aa-2g催化液。

(4)aa-2g产物浓度检测

样品前处理：取10μlaa-2g催化液，加入900μl的0.01mol/l稀盐酸中，12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液用超纯水稀释到1/100体积后加入液相样品瓶中；色谱柱：c18柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：k2hpo4·3h2o：0.57g/l，溶剂为超纯水；磷酸调ph＝2.00；流速：1ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl。底物vc(l-抗坏血酸)的出峰时间一般为5.06min。产物aa-2g的出峰时间为6.3min。经过65h的转化反应，形成的产物aa-2g浓度为178g/l，其产量显著高于文献报道的环糊精糖基转移酶、α-糖苷酶、淀粉酶等催化转化aa-2g的水平(hanretal.applmicrobiolbiotechnol,2012,95:313–320)，以及双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶催化转化的水平(gudiminchirk,etal.chembiochem2017,18(14):1387-1390)。

实施例5含bbrsp基因的重组枯草芽孢杆菌b.subtilisief-bbrsp的构建

(1)bbrsp的扩增：以重组质粒pet28a-bbrsp为dna模板，用以下引物p43-blsp-f/p43-blsp-r进行pcr扩增短双歧杆菌蔗糖磷酸化酶基因bbrsp(产物大小为1500bp)。采用南京诺唯赞生物科技有限公司(vazymebiotechco.,ltd)的高效保真酶phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase进行pcr扩增得到lrsp基因，其pcr扩增程序为：95℃30s；95℃15s、58℃15s、72℃1.5min，30个循环；72℃5min；4℃保存。用dna胶回收试剂盒纯化pcr产物，获得bbrsp产物。

p43-blsp-f:

taggtaagagaggaatgtacacatgaaaaacaaagtgcagctcatc；

p43-blsp-r:

ctatgaccatgattacgccaagcttttagtcgatatcggcaatcggcg。

(2)p43启动子扩增：提取枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pp43nmk(ncbi数据库的登录号：dq264732)作为dna模板，以引物p43-promoter-f/p43-promoter-r为引物，采用高效保真酶phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase进行pcr扩增得到启动子p43，其pcr扩增程序为：95℃30s；95℃10s、58℃15s、72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保存。pcr产物大小330bp，用dna胶回收试剂盒纯化pcr产物，获得p43产物。

p43-promoter-f:

gagatttttttgagcaactggatcctgataggtggtatgttttcgcttg；

pp43-promoter-r:

catgtgtacattcctctcttaccta

(3)融合pcr连接bbrsp与启动子p43：将上述纯化的bbrsp的pcr产物和p43产物，各用超纯水稀释50倍后，取2μl作为模板，以pp43-promoter-f/p43-blsp-r作为引物，进行pcr扩增。采用高效保真酶phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase进行pcr扩增，其pcr扩增程序为：95℃40s；95℃15s、58℃15s、72℃1.5min，30个循环；72℃5min；4℃保存。用dna胶回收试剂盒纯化pcr产物，得到p43-bbrsp的扩增产物。

(4)p43-bbrsp克隆至pp43nmk质粒上，得到重组质粒pp43-bbrsp。提取质粒pp43nmk，经过bamhi/hindiii酶切后，采用dna胶回收试剂盒回收线性化的质粒pp43nmk；将已纯化的p43-bbrsp的pcr产物与线性化的pp43nmk进行重组连接反应：采用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒onestepcloningkit(根据试剂盒说明书操作)，转化e.colidh5α的高效感受态细胞中，在含终浓度50mg/l氨苄青霉素的lb平板上筛选。菌落pcr验证阳性克隆子，并提取质粒进行测序分析。阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pp43-bbrsp(图3)，其中蔗糖磷酸化酶基因bbrsp核苷酸序列为seqidno.1所示，编码蛋白氨基酸序列为seqidno.2所示。

(5)将重组质粒pp43-bbrsp转化到枯草芽孢杆菌wb800中，得到重组芽孢杆菌b.subtilisief-bbrsp。从上述阳性克隆e.colidh5α(pp43-bbrsp)菌株中提取重组质粒pp43-bbrsp；转化到b.subtiliswb800感受态中，涂布于含终浓度50mg/l卡那霉素的lb平板上筛选。菌落pcr验证阳性克隆子。含重组穿梭载体pp43-bbrsp的阳性克隆子b.subtiliswb800(pp43-lrsp)记为枯草芽孢杆菌b.subtilisife-bbrsp。

实施例6、2l发酵罐制备枯草芽孢杆菌ife-bbrsp的发酵液

(1)种子活化。将b.subtilisife-bbrsp接种到含有50mg/l卡那霉素的种子培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得种子液。

(2)将新鲜培养的种子液按体积浓度5％的接种量，接种到1l的含体积浓度0.05％(v/v)消泡剂和50mg/l卡那霉素的枯草芽孢杆菌发酵培养基中，发酵温度37℃，溶解氧do控制大于20％，用25％的氨水控制发酵ph6.8。从接种发酵罐开始进行补料：在最初8个小时内，其补料速率从0ml/h/l起始发酵培养基匀速增加至60ml/h/l起始发酵培养基，补料培养基为质量浓度200g/l葡萄糖水溶液；发酵8小时后，将补料速率降至恒速30ml/h/l起始发酵培养基，继续培养20h，最终获得湿菌体的含量为60g/l的发酵液，作为催化剂。

将新鲜发酵液按需作适当倍数稀释，即可直接用作催化剂，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

实施例7枯草芽孢杆菌ife-bbrsp在生产2-αgg中的应用

1、发酵液中蔗糖磷酸化酶的vc糖基化活力检测

取实施例6制备的25mlb.subtilisife-bbrsp发酵液，加入终浓度270g/l蔗糖，加入ph5.2、0.45kg/l的vc水溶液使vc终浓度210g/l，用naoh调节ph5.2，用去离子水定容到50ml，将反应液加入到棕色烧瓶中，在45℃水浴锅中，磁力搅拌，反应5h后，采用实施例4方法测得到aa-2g的浓度为16g/l，结果表明b.subtilisife-bbrsp菌剂酶活正常。

2、枯草芽孢杆菌ife-bbrsp发酵液制备aa-2g

取实施例6制备的50mlb.subtilisife-bbrsp发酵液，加入终浓度270g/l蔗糖，加入ph5.2、0.45kg/l的vc水溶液使vc终浓度210g/l，用naoh调节ph5.2，用去离子水定容到100ml，将反应液加入到棕色烧瓶中，在45℃水浴锅中，磁力搅拌，反应72h后，采用实施例4方法测得到aa-2g的浓度为146g/l。

(4)aa-2g产物浓度检测

样品前处理：取10μl反应液，加入900μl的0.01mol/l稀盐酸中，12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液用超纯水稀释到1/100体积后加入液相样品瓶中；色谱柱：c18柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：k2hpo4·3h2o：0.57g/l，溶剂为超纯水；磷酸调ph＝2.00；流速：1ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl。底物l-抗坏血酸的出峰时间一般为5.06min。产物aa-2g的出峰时间为6.3min。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种蔗糖磷酸化酶在制备2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<213>短双歧杆菌(bifidobacteriumbrevis)

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<213>短双歧杆菌(bifidobacteriumbrevis)

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500505