一种蔗糖磷酸化酶在制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用的制作方法

文档序号:20787165发布日期:2020-05-19 21:49阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种蔗糖磷酸化酶在制备2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸中的应用,其特征在于所述蔗糖磷酸化酶氨基酸序列如seqidno.2所示。

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述蔗糖磷酸化酶编码基因核苷酸序列如seqidno.1所示。

3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述的应用以含蔗糖磷酸化酶编码基因的工程菌经发酵获得的发酵液或发酵液离心后的湿菌体用缓冲液或去离子水重悬的破碎液为催化剂,以l-抗坏血酸为底物,以蔗糖为辅助底物,以ph为4.8-6.0的缓冲液或去离子水为反应介质构成反应体系,在30-55℃的条件下进行反应,获得含2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液,分离纯化获得2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述反应体系中,催化剂用量以湿菌体重量计为5-50g/l,底物终浓度为50-250g/l,所述蔗糖终浓度为200-400g/l。

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述l-抗坏血酸以ph5.2、0.45kg/l的vc水溶液的形式加入。

6.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌以大肠杆菌(escherichiacoli)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtillus)为宿主构建成重组大肠杆菌或重组枯草芽孢杆菌。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌以大肠杆菌为宿主时,所述的应用为:以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵获得的发酵液离心后的湿菌体用ph为4.8-6.0缓冲液或去离子水重悬的破碎液为催化剂,以l-抗坏血酸为底物,以蔗糖为辅助底物,以ph为4.8-6.0的缓冲液或去离子水为反应介质构成反应体系,在30-55℃的条件下进行反应,获得含2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液,分离纯化获得2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述蔗糖磷酸化酶基因以枯草芽孢杆菌为宿主时,所述的应用为:以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵获得的发酵液为催化剂,以l-抗坏血酸为底物,以蔗糖为辅助底物,以ph为4.8-6.0的去离子水为反应介质构成反应体系,在30-55℃的条件下进行反应,获得含2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸的反应液,分离纯化获得2-o-α-d-葡萄糖基-l-抗坏血酸。

9.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述蔗糖磷酸化酶基因以大肠杆菌为宿主时,所述重组大肠杆菌发酵液按如下方法制备:

(1)新鲜种子液培养:将含蔗糖磷酸化酶基因的重组大肠杆菌接种在含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中,30-37℃,100-250rpm培养至对数生长中期,获得种子液,所述lb培养基为:酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l,溶剂为去离子水,ph7.0;

(2)5l发酵罐中的分批补料发酵:将新鲜培养的种子液按体积浓度5%的接种量,接种到含质量浓度0.05%消泡剂和50mg/l卡那霉素的大肠杆菌发酵培养基中,32℃培养7h;加入终浓度为5-22g/l的α-乳糖,控制发酵温度24℃,溶解氧do控制大于20%,用25%的氨水控制发酵ph6.8,开始以35ml/min恒速补料甘油溶液,继续发酵15-30h,甘油共计补料20-150g/l起始发酵培养基,获得发酵液;所述甘油溶液终浓度组成:甘油350g/l,生物素4.5mg/l,mgso4·7h2o10g/l,溶剂为水;所述大肠杆菌发酵培养基质量终浓度组成:酵母粉12g/l、蛋白胨15g/l、甘油10g/l、na2hpo4·12h2o8.9g/l、kh2po43.4g/l、nh4cl2.67g/l、na2so40.71g/l、mgso4·7h2o0.3g/l,溶剂为去离子水,ph6.8-7.0。

10.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述蔗糖磷酸化酶基因以枯草芽孢杆菌为宿主时,所述重组枯草芽孢杆菌发酵液按如下方法制备:

(1)新鲜培养种子液:将含蔗糖磷酸化酶基因的重组枯草芽孢杆菌接种在含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中,37℃,100-250rpm培养至对数生长中期,获得种子液,所述lb培养基终浓度组成:酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、nacl10g/l,溶剂为去离子水,ph7.0;

(2)5l发酵罐中的分批补料发酵:将新鲜培养的种子液按体积浓度5%的接种量,接种到含质量浓度0.05%消泡剂和50mg/l卡那霉素的发酵培养基中,控制温度37℃,溶解氧do控制大于20%,用25%的氨水控制发酵ph6.8-7.5;开始发酵的前8小时内,从0ml/h/l起始发酵培养基匀速增加至60ml/h/l起始发酵培养基的速率添加补料培养基;发酵8小时后,将补料速率降至30ml/h/l起始发酵培养基,继续培养20h,获得发酵液;所述补料培养基为葡萄糖200g/l葡萄糖水溶液;所述枯草芽孢杆菌发酵培养基质量终浓度组成:酵母粉50g/l、蛋白胨30g/l、kh2po46g/l、葡萄糖10g/l、柠檬酸钠1g/l,溶剂为去离子水,ph6.8-7.0。


技术总结
本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶在制备2‑O‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸中的应用,以含蔗糖磷酸化酶基因的工程菌经发酵获得的发酵液或发酵液离心后的湿菌体用缓冲液重悬的破碎液为催化剂,以L‑抗坏血酸为底物,以蔗糖为辅助底物,以pH为4.8‑6.0的缓冲液为反应介质构成反应体系,在30‑55℃的条件下进行反应,获得AA‑2G。本发明采用蔗糖磷酸化酶高效生产AA‑2G,其产率为3.47g·L‑1·h‑1,较现有报道的B.longum来源的蔗糖磷酸化酶提高了34.5%,AA‑2G的最高浓度可达178g/L;本发明重组枯草芽孢杆菌能够高效分泌表达蔗糖磷酸化酶,将发酵液直接用于食品级AA‑2G的制备。

技术研发人员:陈小龙;甘恬;朱林江;周瑶瑶;陆跃乐;陈翰驰;范永仙
受保护的技术使用者:浙江工业大学
技术研发日:2020.01.21
技术公布日:2020.05.19
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