用于解决基因检测中荧光定量PCR非特异性扩增干扰的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于解决基因检测中荧光定量pcr非特异性扩增干扰的方法。

背景技术：

荧光定量pcr技术是一种定量pcr检测技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对pcr扩增产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，再结合相应的软件对产物进行分析，计算出模板的初始浓度。荧光定量pcr技术根据标记方法的不同，常用的有荧光染料法和水解探针法。

荧光染料法是在pcr反应体系中，加入过量的sybrgreen等荧光染料，sybrgreen荧光染料能够非特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的sybrgreen染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步，以此来监控pcr反应的进行。荧光染料法实时定量pcr技术适用性强，成本低，使用简便，但是由于sybrgreen等染料是非特异性的掺入到所有扩增出的dna双链片段中，就不可避免的会导致一些非特异性扩增的片段被染料掺入后产生荧光信号干扰检测。

而目前用于基因检测过程中常常是用一步法或者两步法进行pcr扩增，需要全程收集荧光信号，并且不可避免的会产生二聚体等非特异性扩增信号造成干扰，还需要对检测的结果根据反应时间和荧光信号的变化绘制熔解曲线，过程繁琐，反应时间长，并且检测准确性低。而如何针对目前的技术问题进行改进获取一种方便操作、缩短反应时间且能提高检测准确性的方法具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于解决基因检测中荧光定量pcr非特异性扩增干扰的方法，采用三步法扩增，将荧光定量信号收集过程设定在延伸阶段，既有效避免了非特异性扩增信号的干扰，又省去了熔解曲线的构建过程，缩短了反应时间，提高了检测准确性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于解决基因检测中荧光定量pcr非特异性扩增干扰的方法，包括：pcr扩增反应条件为：90—95℃预变性1—15min；90—95℃变性10—30s；50—65℃退火30s—90s；70—85℃延伸10s—30s；35-50个循环；信号收集设置在延伸环节。

优选的是，还包括：20μlpcr反应体系；

所述20μlpcr反应体系包括以下组分：2×sybrgreenipcrmastermix10μl，特异性引物对各0.4μl，dna模板10—100ng，ddh2o补充至20μl。

优选的是，所述特异性引物对包括以下7对引物对中任意一对：

引物对1：

上游引物序列如seqidno.1所示；

下游引物序列如seqidno.2所示；

引物对2：

上游引物序列如seqidno.3所示；

下游引物序列如seqidno.2所示；

引物对3：

上游引物序列如seqidno.4所示；

下游引物序列如seqidno.2所示；

引物对4：

上游引物序列如seqidno.5所示；

下游引物序列如seqidno.2所示；

引物对5：

上游引物序列如seqidno.6所示；

下游引物序列如seqidno.2所示；

引物对6：

上游引物序列如seqidno.7所示；

下游引物序列如seqidno.2所示；

引物对7：

上游引物序列如seqidno.7所示；

下游引物序列如seqidno.8所示。

优选的是，在80℃收集荧光信号。

优选的是，所述基因为人k-ras基因。

本发明还提供所述的方法在荧光染料法定量pcr反应实验中的应用。

本发明还提供所述的方法在荧光染料法定量pcr反应试剂盒中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明针对荧光染料法进行定量pcr基因检测过程中，加入sybrgreen等荧光染料后会由于荧光染料对于扩增的dna双链没有选择性，因此会造成一些非特异性扩增片段被染料掺入后产生荧光信号干扰检测；扩增引物的存在也可能造成引物本身形成的引物二聚体存在，也会影响荧光信号的检测；此外，现有技术中一般采用二步法进行荧光定量pcr检测，而此检测方法需要全程进行信号收集，并在收集完荧光信号后还需要设定熔解曲线反应过程，导致反应时间长，并且受到各种干扰导致检测准确性低，而本申请改变常规的二步法荧光定量pcr检测方法，采用三步法，并且将荧光信号收集设计在延伸阶段(80℃高温)，由于非特异性扩增产物往往片段比较短，在70-85℃范围时会发生变性解螺旋，无法结合荧光染料发射荧光，所以此时收集的荧光信号就全部来自于目的基因扩增片段，可以有效的排除非特异性扩增对荧光染料法定量pcr反应造成的干扰。本发明公开的用于解决基因检测中荧光定量pcr非特异性扩增干扰的方法，适应于大多数荧光染料法荧光定量pcr反应，并且可以减少各种情况造成的荧光信号干扰现象的产生，提高了检测准确性，同时还省去了熔解曲线反应过程，缩短了反应时间，对于科研过程中提高荧光染料法荧光定量pcr检测效率具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1改进后和对比例1改进前两种荧光定量pcr方法在检测k-ras基因的扩增曲线比较图；

如图2为本发明实施例1改进后和对比例1改进前两种荧光定量pcr方法在检测k-ras基因的熔解曲线比较图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

用于解决基因检测中荧光定量pcr非特异性扩增干扰的方法。

采用正常人外周血新鲜样本，从血液样本中提取dna供以下实验应用，用sybrgreen荧光pcr法检测人的k-ras基因，设计多组特异性引物对分别进行检测。引物对如下所示：

k-ras基因检测引物对1：

上游引物序列如seqidno.1所示：

tgaggttattgtgtttggaa；

下游引物序列如seqidno.2所示：

gtaggtcacaggctctac；

k-ras基因检测引物对2：

上游引物序列如seqidno.3所示：

cactgtttgaggttattgtg；

下游引物序列如seqidno.2所示：

gtaggtcacaggctctac；

k-ras基因检测引物对3：

上游引物序列如seqidno.4所示：

accactgtttgaggttattg；

下游引物序列如seqidno.2所示：

gtaggtcacaggctctac；

k-ras基因检测引物对4：

上游引物序列如seqidno.5所示：

agaccactgtttgaggtta；

下游引物序列如seqidno.2所示：

gtaggtcacaggctctac；

k-ras基因检测引物对5：

上游引物序列如seqidno.6所示：

agtgcttagagaccactg；

下游引物序列如seqidno.2所示：

gtaggtcacaggctctac；

k-ras基因检测引物对6：

上游引物序列如seqidno.7所示：

gagcataggaaagtgctta；

下游引物序列如seqidno.2所示：

gtaggtcacaggctctac；

k-ras基因检测引物对7：

上游引物序列如seqidno.7所示：

gagcataggaaagtgctta；

下游引物序列如seqidno.8所示：

cacaggctctacgtgtag。

配制荧光定量pcr扩增体系(20μl)，如表1所示：

表1

pcr扩增反应条件：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火50s，80℃延伸10s，40个循环，在80℃收集荧光信号；熔解曲线过程95℃1min，65℃30s，95℃30s，全过程收集荧光信号。

对比例1

与实施例1不同之处在于，pcr扩增反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火50s，40个循环，在60℃收集荧光信号；熔解曲线过程95℃1min，65℃30s，95℃30s，全过程收集荧光信号。

结果如图1所示的实施例1改进后和对比例1改进前两种荧光定量pcr方法在检测k-ras基因的扩增曲线比较图，以及如图2所示的实施例1改进后和对比例1改进前两种荧光定量pcr方法在检测k-ras基因的熔解曲线比较图。从结果可以看出对比例1普通的sybrgreen荧光pcr的扩增曲线ct值较大，且都有扩增，但熔解曲线杂乱，有不同位置的单峰，表明有引物二聚体存在；经过改进后的方法，扩增曲线ct值较小，扩增效率提高，熔解曲线单峰且位置一致，排除了引物二聚体的扩增干扰。

在上述实施例1中熔解曲线反应过程仅仅是为了与对比例1进行两种荧光pcr法扩增的比较，在实际检测中可以省去。从结果可以看出，本发明具有以下优点：(1)适用范围广：本发明仅对荧光定量pcr反应的过程进行了改进，无需额外添加试剂或改变反应体系配比，可适用于多大多数的染料法荧光定量pcr反应。(2)准确性提高：排除了非特异性扩增的干扰，使目的基因片段的增加与荧光信号强度的增长正相关性更强，对实验结果的分析判定更为准确。(3)引物设计要求降低：在有引物二聚体等结构干扰时，也可以正常检测目的基因片段的信号。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

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<120>用于解决基因检测中荧光定量pcr非特异性扩增干扰的方法

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgaggttattgtgtttggaa20

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accactgtttgaggttattg20

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agaccactgtttgaggtta19

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<212>dna

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agtgcttagagaccactg18

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gagcataggaaagtgctta19

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cacaggctctacgtgtag18