基于多重PCR的靶向高通量测序的MDS检测试剂盒及制备方法与流程

本发明涉及白血病相关基因突变检测
技术领域：
，尤其涉及一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒及制备方法。
背景技术：
：骨髓增生异常综合征(mds)是一组以无效造血和高风险向急性白血病转化为特征的克隆性髓系肿瘤，白血病中最常见的分子生物学异常主要包括：基因突变、融合基因、基因表达，而基因突变中又以点突变、基因片段插入或缺失为主，因此必要的基因检测可为临床诊断分型、预后判断、治疗指导、微小残留病灶(mrd)监测以及克隆演变提供参考，目前，分子生物学中基因突变检测的方法主要有一代测序(sanger)、高通量测序技术(ngs)、实时荧光pcr(rq-pcr)、数字pcr等，而高通量靶向测序技术主流的又以多重pcr的靶向测序和捕获探针的靶向测序为主。与一代(sanger)测序技术相比，多重pcr的靶向测序技术具有更高的灵敏度，并且能够定量检测出基因突变负荷率；与捕获探针的靶向测序相比，多重pcr的靶向测序技术文库构建流程更加简单，能提供更经济、快速的测序方案，但实时荧光pcr(rq-pcr)及数字pcr大多数是针对基因中已知突变位点的进行检测，并且实验周期较长，做多基因突变筛查可行性较差。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒及制备方法，特异性强、实验周期短并提高多基因突变筛查可行性。为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒的制备方法，包括：提取25ng、10ng/uldna，并与5ul的pcr混合液和1ul的pcr反应液进行pcr程序运行，得到扩增子产物；向所述扩增子产物中加入消化液和磁珠进行纯化，得到纯净的所述扩增子产物；向纯化后的所述扩增子产物加入接头引物、pcr混合液和pcr反应液进行pcr反应，并利用磁珠得到纯净的扩增子文库。其中，所述提取25ng、10ng/uldna，并与5ul的pcr混合液和1ul的pcr反应液进行pcr程序运行，得到扩增子产物，包括：利用dna提取试剂盒对待测样本进行提取，得到25ng、10ng/uldna，并向所述dna中加入5ul的pcr混合液、1ul的pcr反应液和各1ul上游引物下游引物，同时用nuclease-freewater补足混合溶液至10ul后运行pcr程序，得到扩增子产物。其中，所述提取25ng、10ng/uldna，并与5ul的pcr混合液和1ul的pcr反应液进行pcr程序运行，得到扩增子产物，包括：将所述混合溶液进行预变性95℃15min后，再依次进行95℃30s、60℃90s和72℃90s共24个循环，并在72℃10min运行后，暂存于4℃中。其中，向所述扩增子产物中加入消化液和磁珠进行纯化，得到纯净的所述扩增子产物，包括：向所述扩增子产物中加入消化液后，依次在pcr仪上进行37℃30min和80℃10min的程序运行，并结合磁珠回收所述扩增子产物后进行洗涤，得到纯净的扩增子产物。其中，向纯化后的所述扩增子产物加入接头引物、pcr混合液和pcr反应液进行pcr反应，并利用磁珠得到纯净的扩增子文库，包括：向纯化后的所述扩增子产物中加入接头p5和接头p7后，再加入pcr混合液和pcr反应液进行pcr反应，并利用磁珠进行回收和洗涤后，得到纯净的扩增子文库。第二方面，本发明提供一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒，所述基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒包括扩增子的全部引物、pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5、接头p7、无水乙醇、磁珠和nuclease-freewater。本发明的一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒及制备方法，所述试剂盒包括扩增子的全部引物、pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5、接头p7、无水乙醇、磁珠和nuclease-freewater，利用dna提取试剂盒提取25ng、10ng/uldna后，并与5ul的pcr混合液和1ul的pcr反应液进行pcr程序运行，得到扩增子产物，然后向所述扩增子产物中加入消化液和磁珠进行纯化，得到纯净的所述扩增子产物，最后向纯化后的所述扩增子产物加入接头p5、接头p7、pcr混合液和pcr反应液后，进行pcr反应，并利用磁珠得到纯净的扩增子文库，特异性强、实验周期短并提高多基因突变筛查可行性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明提供的一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒的制备方法的步骤示意图。图2是本发明提供的多重pcr靶向测序检测技术原理图。图3是本发明提供的多重pcr检测技术的文库检测结果图。图4是本发明提供的突变位点一代测序验证峰图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。请参阅图1和图2，本发明提供一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒的制备方法，包括：s101、提取25ng、10ng/uldna，并与5ul的pcr混合液和1ul的pcr反应液进行pcr程序运行，得到扩增子产物。具体的，利用dna提取试剂盒对待测样本进行提取，得到25ng、10ng/uldna，并向所述dna中加入5ul的pcr混合液、1ul的pcr反应液和各1ul上游引物下游引物，同时用nuclease-freewater补足混合溶液至10ul后运行pcr程序，得到扩增子产物，利用商业化dna提取试剂盒对待测样本进行抽提dna，通过质检确保dna浓度达10ng/ul以上，电泳条带无明显拖尾以确保dna的完整性，当pcr程序运行后，所有扩增子引物中上游5’端均带上一段相同的通用序列t1；下游引物的5’端均带上另外一种相同的通用序列t2。t1序列通常为p5接头序列3’端的一部分；t2序列为p7接头序列3’端的一部分。故通过本轮多重pcr反应，不仅得到多个目标核苷酸的扩增子产物，同时将通用序列t1和t2分别成功引入到扩增子产物的两侧，为后续pcr反应引入完整的接头序列做好准备。s102、向所述扩增子产物中加入消化液和磁珠进行纯化，得到纯净的所述扩增子产物。具体的，将得到的所述扩增子产物进行纯化，由于pcr反应过程中除了会产生扩增子产物还会有残存的少量酶、引物、dntp、盐离子、副产物等多种杂质。通过加入消化液能够去除部分扩增杂质，pcr仪上运行程序：37℃30min，80℃10min。但是消化液不能够完全去除扩增引起的双链副产物，因此，需要通过磁珠结合目标片段来回收扩增子产物，洗涤去除反应中的其他成分，得到纯净的扩增子产物。s103、向纯化后的所述扩增子产物加入接头引物、pcr混合液和pcr反应液进行pcr反应，并利用磁珠得到纯净的扩增子文库。具体的，将纯化后的所述扩增子产物作为模板，加入高通量测序所需的接头引物即接头p5和接头p7，接头p5为通用性接头，接头p7为识别样本的一段特殊序列，通过加入pcr混合液以及pcr反应液进行pcr反应。接头p5和接头p7接头引物分别与所述扩增子产物两侧t1序列和t2序列互补配对。因此本轮pcr反应结束后，接头序列p5和p7分别被引入到扩增子产物的两侧，得到新的扩增子文库。然后通过磁珠结合目标片段来回收扩增子产物，洗涤去除反应中的其他成分，得到纯净的扩增子文库，经过对文库定量和质检后，便可以上机测序，特异性强、实验周期短并提高多基因突变筛查可行性。第二方面，本发明提供一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒，所述基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒包括扩增子的全部引物、pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5、接头p7、无水乙醇、磁珠和nuclease-freewater。在本实施方式中，所述基于多重pcr靶向测序对mds试剂盒的试剂盒包括扩增子的全部引物、pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5、接头p7、无水乙醇、磁珠和nuclease-freewater，其中，pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5和接头p7为商业化的pcr试剂盒，方便使用并降低成本，所述试剂盒主要针对骨髓增生异常综合征(mds)相关的32种基因经典转录本如下：asxl1(nm_015338.5)、bcor(nm_017745.5)、bcorl1(nm_021946)、calr(nm_004343.3)、cbl(nm_005188.3)、ddx41(nm_016222.4)、dnmt3a(nm_022552.4)、etv6(nm_001987.4)、ezh2(nm_004456.4)、flt3(nm_004119.2)、gata2(nm_032638.4)、idh1(nm_005896.3)、idh2(nm_002168.3)、jak2(nm_004972.3)、kras(nm_033360.3)、mpl(nm_005373.2)、nf1(nm_001042492.2)、npm1(nm_001355006.1)、nras(nm_002524.4)、phf6(nm_032458.2)、ppm1d(nm_003620.3)、runx1(nm_001754.4)、setbp1(nm_015559.2)、sf3b1(nm_012433.2)、srsf2(nm_001195427.1)、stag2(nm_001042749.2)、stat3(nm_139276.2)、tet2(nm_001127208.2)、tp53(nm_000546.5)、u2af1(nm_006758.2)、wt1(nm_024426.4)、zrsr2(nm_005089.3)。所设计的引物tm值在60±2℃，对所设计的引物进行优化测试后合理的分配到4管中，保证引物的特异性以及扩增片段的均一性，降低非目的片段的比例，由于选用的是高通量测序illumina平台的novaseq6000进行测序，采用的测序策略为pe150，故目标区域大小均约为300bp的核苷酸片段。基于引物设计原则，利用相关引物设计软件本发明设计了与骨髓增生异常综合征(mds)相关的32种基因外显子引物，相应的的引物序列如下：将本发明所述的试剂盒通过20例临床样本来特异性检测mds中32种基因突变。对20例(编号m1～m20)初诊、难治及复发的髓系白血病患者样本进行了筛查检测，严格执行上述检测方法的流程，运用自建的生信流程进行分析以及专业遗传咨询解读人员进行解读，同时对这20例白血病患者样本进行了一代测序(sanger)的验证，其中，采用多重pcr检测技术的文库检测结果如图3所示，而采用一代测序验证的结果如图4所示，具体的基因位点为：asxl1(nm_015338)c.1900_1922del23；p.e635fs*15，目前一代测序(sanger)还是作为基因突变检测的金标准，采用两种方法检测的结果对比如下：编号m1～m10的患者多重pcr检测方法结果汇总表(一)编号m10～m20的患者多重pcr检测方法结果汇总表(二)编号m1～m10的患者一代检测方法结果汇总表(一)编号m11～m20的患者一代测序检测方法结果汇总表(二)20例(编号m1～m20)初诊、难治及复发的髓系白血患者用多重pcr靶向测序检测32个基因阳性率如下表所示：多重pcr靶向测序检测32个基因阳性率表突变基因突变例数突变比例突变基因突变例数突变比例asxl1735.00％nf115.00％bcor00.00％npm100.00％bcorl100.00％nras15.00％calr00.00％phf6210.00％cbl00.00％ppm1d00.00％ddx4100.00％runx1630.00％dnmt3a525.00％setbp1630.00％etv615.00％sf3b1315.00％ezh2630.00％srsf2525.00％flt300.00％stag200.00％gata200.00％stat300.00％idh1420.00％tet2735.00％idh2315.00％tp53315.00％jak215.00％u2af1525.00％kras00.00％wt115.00％mpl00.00％zrsr2630.00％20例(编号m1～m20)初诊、难治及复发的髓系白血患者用一代测序检测32个基因阳性率如下表所示：一代测序检测32个基因阳性率表通过两种检测方法的结果汇总比较，采用多重pcr靶向检测技术具有更高的检出率，一代测序因受灵敏度(10％～15％)及方法学的限制，低于10％～15％的基因变异情况直接判读为阴性，并且所检出样本的结果无法对基因突变负荷率进行定量，多重pcr灵敏度可达1％以上，对所有检出的基因突变均能给出定量结果。本发明的一种基于多重pcr的靶向高通量测序的mds检测试剂盒及制备方法，所述试剂盒包括扩增子的全部引物、pcr混合液、pcr反应液、消化液、接头p5、接头p7、无水乙醇、磁珠和nuclease-freewater，利用dna提取试剂盒提取25ng、10ng/uldna后，并与5ul的pcr混合液和1ul的pcr反应液进行pcr程序运行，得到扩增子产物，然后向所述扩增子产物中加入消化液和磁珠进行纯化，得到纯净的所述扩增子产物，最后向纯化后的所述扩增子产物加入接头p5、接头p7、pcr混合液和pcr反应液后，进行pcr反应，并利用磁珠得到纯净的扩增子文库，特异性强、实验周期短并提高多基因突变筛查可行性。以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。当前第1页12