2019-nCoV新型冠状病毒唾液检测生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，特别是涉及一种2019-ncov新型冠状病毒唾液检测生物标志物及其应用。
背景技术：
：由于冠状病毒潜伏期长、感染者个体表现差异较大，为迅速/准确确诊带来了很大的挑战。从卫健委公布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》中我们可以看到多举并进的总和检测方法，分别是：1)流行病学史。主要来确定是否和有嫌疑的人或者场合进行过接触。2)个人生理状况。主要包括是否有发热或者呼吸道症状。3)血液生化检测。主要是通过抽血来检测，比如白细胞总数或者淋巴细胞计数。4)肺炎影像学特。主要是通过ct设备来实现。5)核酸检测。临床诊断策略具有非常重要的意义，针对病原微生物核酸组分的pcr检测方法目前仍然是确诊新冠病毒感染的金标准。国家药监局官网显示，目前已批准了6家公司的7个新型冠状病毒核酸检测试剂盒产品及一款检测软件上市，涉及的上市公司有华大基因(300676.sz)、达安基因(002030.sz)，除了华大基因两款中的一款是联合探针锚定聚合测序法外，其他均基于实时荧光pt-pcr技术。万孚生物(300482.sz)、透景生命(300642.sz)、西陇科学(002584.sz)等公司近日陆续传出官方消息，均研制出新冠病毒检测相关产品。核酸检测需要取样、留样、保存、核酸提取、上机检测这几个步骤，其中每个步骤都有可能引起假阴性。尤其是目前在肺部灌洗液无法规模化进行的紧急时刻，患者的病毒样本是几乎都通过鼻咽拭子采集。鼻咽拭子取样的质量因实验员的操作而异，难以恒定标准化，是造成检测假阴性的重要原因之一。目前新冠病毒核酸检测阳性率仅为30％-40％左右。此外，在鼻咽拭子取样操作中，操作人员很容易受到感染。因此需要更为简单、快速且准确的取样方式，从而降低检测假阴性，同时减少采样人员被感染的风险。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于2019-ncov新型冠状病毒唾液检测生物标志物及其应用。既然新冠病毒可以通过飞沫来传播，患者唾液中很可能带有病毒颗粒和病毒感染细胞后细胞释放的带有病毒核酸信息的外泌体。本发明的唾液核酸纯化试剂(专利)和实验流程，只需要获取100微升的唾液上清液，提取其中的核酸，用目标基因的特异性引物对核酸样本进行rt-pcr扩增，在两小时内即可完成唾液外泌体中含有的与病理状况相关的核酸表达(mrna)标志物以及病原菌特异基因的检测。为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供冠状病毒s蛋白基因作为生物标志物在制备2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品或2019-ncov冠状病毒肺炎辅助唾液诊断产品中的用途。本发明第二方面提供特异性识别冠状病毒s蛋白基因的物质用于制备2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品的用途。本发明第三方面提供一种2019-ncov新型冠状病毒唾液检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别冠状病毒s蛋白基因的物质。如上所述，本发明的2019-ncov新型冠状病毒唾液检测生物标志物及其应用，具有以下有益效果：本发明首次发现冠状病毒s蛋白基因作为生物标志物在制备2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品中的作用，能够快速检测2019ncov新型冠状病毒感染，检测效率高,唾液样本取样简单，数量恒定，有利于检测结果的可靠性和稳定性。取样时，只需患者或疑是患者自行将唾液吐于所提供的收集管内，盖上盖交与实验员即可，大大减少了实验员受感染的机会速度快，无污染，具有很高的敏感性和特异性。附图说明图1：采用本发明所述的唾液所含病毒或唾液外泌体中的冠状病毒s蛋白基因进行rt-pcr扩增电泳图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。各种原料和试剂均购自商业供应商，未经进一步纯化，除非另有说明。易受潮的原料和试剂均存放于全密封瓶中，并直接使用，均未经过特殊处理。本发明提供冠状病毒s蛋白基因作为生物标志物在制备2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品或2019-ncov冠状病毒肺炎辅助唾液诊断产品中的用途。s蛋白基因的靶序列序列如seqidno：7所示。具体的：s蛋白-templete2230bp(seqidno：7)ttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccctgcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccatgctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccatttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggatttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccacaaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattggtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacatagaagttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattatgtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattacagatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttcactgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctcggcgggcacgtagtgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaattctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattcaactgaatgca。所述2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品包括特异性识别冠状病毒s蛋白基因的物质。本发明提供特异性识别冠状病毒s蛋白基因的物质用于制备2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品的用途。所述2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品以唾液作为检测样本来源。进一步的，所述2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品可以检测唾液外泌体中是否含有冠状病毒s蛋白基因。所述2019-ncov新型冠状病毒唾液检测产品检测所需唾液样本用量为1-1.5毫升。所述2019-ncov新型冠状病毒检测产品用于2019ncov新型冠状病毒感染的判断、治疗方案的选择、治疗疗效的判断和/或预后评估。2019-ncov新型冠状病毒的预后评估是指对2019-ncov新型冠状病毒病人的病程和/或结局进行预后判断。所述用药疗效的判断是指，在患者治疗一段时间后，利用本发明的产品进行检测，判断患者是否痊愈。进一步的，所述2019-ncov新型冠状病毒检测产品是指是指用于检测唾液样本中外泌体中的冠状病毒s蛋白表达量的产品，根据检测结果以对病人是否患有2019-ncov新型冠状病毒、选择何种治疗方案和/或病人的病程和/或结局进行预后判断。需要说明的是，所述2019-ncov新型冠状病毒检测产品并不限定为必须为液体形式。所述特异性识别冠状病毒基因s蛋白的物质可选自特异性扩增冠状病毒s蛋白基因的引物。在一种实施方式中，所述特异性扩增冠状病毒基因s蛋白的引物包括以下引物组合中的任一种或多种：(1)如seqidno：1所示的2019ncov新型冠状病毒上游引物和如seqidno：2所示的下游引物；(2)如seqidno：3所示的2019ncov新型冠状病毒上游引物和如seqidno：4所示的下游引物；(3)如seqidno：5所示的2019ncov新型冠状病毒上游引物和如seqidno：6所示的下游引物。具体的，s蛋白-f1ggaccaatggtactaagagg259bp(seqidno：1)，s蛋白-r1tctgaactcactttccatcc(seqidno：2)。s蛋白-f2gactcctggtgattcttcttc233bp(seqidno：3)s蛋白-r2caatagattctgttggttggactc(seqidno：4)s蛋白-f3tccctgttgctattcatgcag215bp(seqidno：5)s蛋白-r3ggattgactagctacactacg(seqidno：6)本发明提供的2019-ncov新型冠状病毒唾液检测试剂盒，所述试剂盒中至少包括特异性识别2019-ncov新型冠状病毒s蛋白的物质。所述特异性识别2019-ncov新型冠状病毒s蛋白的物质可选自特异性扩增冠状病毒s蛋白基因的引物。所述特异性扩增冠状病毒s蛋白基因的引物包括以下引物组合中的任一种或多种：(1)如seqidno：1所示的2019ncov新型冠状病毒上游引物和如seqidno：2所示的下游引物；(2)如seqidno：3所示的2019ncov新型冠状病毒上游引物和如seqidno：4所示的下游引物；(3)如seqidno：5所示的2019ncov新型冠状病毒上游引物和如seqidno：6所示的下游引物。在一种实施方式中，所述2019-ncov新型冠状病毒唾液检测试剂盒中还包括核酸纯化液，所核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：具体的，所述核酸纯化液中，十二烷基硫酸钠的含量为5g/100ml-50g/100ml。例如，十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-15g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为5g/100ml-10g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为10g/100ml-15g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为15g/100ml-20g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为20g/100ml-25g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为25g/100ml-30g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为30g/100ml-35g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为35g/100ml-40g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml-50g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为40g/100ml-45g/100ml。十二烷基硫酸钠的含量可以为45g/100ml-50g/100ml。在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：在一种实施方式中，所述核酸纯化液至少含有以下组分，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的含量为：在一种实施方式中，所述核酸纯化液中，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。在一种实施方式中，所述核酸纯化液中，十二烷基硫酸钠的终浓度为40g/100ml，乙二胺四乙酸二钠的终浓度为0.04g/100ml。唾液中的核酸可通过以下方法纯化提取：将唾液样本的离心后上清液加入核酸纯化液混合处理，沉淀，得纯化后的核酸。纯化核酸时，所需唾液样本用量为1-1.5毫升。唾液样本的离心条件为：2000-3000g/min，离心10-15min。优选的，所述沉淀核酸的方法为：加入异丙醇，混合，离心，弃上清液，得核酸沉淀。进一步的，离心条件为：11000g/min，离心10-15min。优选的，所述洗涤核酸的方法为采用乙醇水溶液进行洗涤。具体的，将核酸沉淀与乙醇水溶液混合，离心，弃去上清液，得到纯化的核酸。进一步的，离心条件为：10000-20000g/min，离心10-15min。优选的，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为75-80％。优选的，所述纯化方法还包括以下步骤：将得到的纯化的核酸溶解保存。进一步的，用于溶解所述纯化的核酸的试剂中不含核酸酶。优选地，用于溶解所述纯化的核酸的试剂为水。实施例1唾液中微量核酸的纯化1.样本来源：上海公共卫生临床中心留取方法：采集前病人以清水漱口3-4次，除去口腔黏液和食物残渣。漱口后静止3-5分钟，将唾液1.5-2毫升由舌下或两颊分泌出，吐于1带盖的唾液收集管内，采集的样本应立即置于摄氏4度冰箱里。总共收集25例。2.采用以下步骤进行唾液中微量核酸的纯化：1)清水漱口3-4遍，去除口腔食物残渣和黏液；静止3分钟。2)将唾液1.5-2毫升吐至高温高压处理过的有盖实验管。3)将样本转置于1.5毫升的高温高压处理过的离心管，3000g/分，离心10-15分钟；4)取上清液100微升，置于另一高温高压处理过的1.5毫升离心管；5)加入300微升核酸纯化液，充分混合10分钟；6)加入320微升异丙醇，充分混合5分钟；7)11000g/分离心15分钟，弃去上清液；8)加入500微升75-80％乙醇清洗核酸沉淀；9)11000g/分离心5分钟，弃去上清液；10)室温空气干燥核酸沉淀；11)溶解核酸沉淀于20微升不含核酸酶的蒸馏水，得到核酸样本，保存备用。步骤5)中，按如下配方配制核酸纯化液，其中，以核酸纯化液的总量为基准计，各组分的百分比为：实施例2纯化结果分析纯化后的唾液上清液核酸经过反向转录后生成cdna(qiagen反向转录试剂盒)，然后用冠状病毒基因s蛋白的特异性扩增引物对实施例1中得到的核酸样本pcr的扩增(pcr)，用冠状病毒基因s蛋白的特异性扩增引物的序列为：上游引物：(seqidno：1)：下游引物：(seqidno：2)：表1扩增反应体系dntp(2.5μm)160μl10xexbuffer2.0μl特异引物200μl模板dna1.0μlteqdna聚合酶10μlpcr缓冲液(10倍工作浓度)200μl(2)pcr结果进行进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，结果证明：经本发明所述方法可知，所述25份样本中，有23例为阳性。1例微弱条带，1例为阴性。阳性对照：入院后，所述患者进行鼻咽拭子核酸检测筛查，结果为均为阳性。与阳性对照方法相比，本发明所述方法的敏感性为92％。可见，本发明的敏感性较高。同时，本发明测试速度快，取样后2小时即可得出检测结果，是一种可选的2019-ncov新型冠状病毒检测手段。也可辅助进行2019-ncov新型冠状病毒临床诊断。本发明还在对健康人进行抽样检测，测试人数为20人，采用本发明的检测方法，所述样本均为阴性。可见，本发明的特异性高。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表<110>上海力拜生物科技有限公司<120>2019-ncov新型冠状病毒唾液检测生物标志物及其应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggaccaatggtactaagagg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tctgaactcactttccatcc20<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gactcctggtgattcttcttc21<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4caatagattctgttggttggactc24<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tccctgttgctattcatgcag21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggattgactagctacactacg21<210>7<211>2230<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattaccccct60gcatacactaattctttcacacgtggtgtttattaccctgacaaagttttcagatcctca120gttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggttccat180gctatacatgtctctgggaccaatggtactaagaggtttgataaccctgtcctaccattt240aatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggattttt300ggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaatgtt360gttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttattaccac420aaaaacaacaaaagttggatggaaagtgagttcagagtttattctagtgcgaataattgc480acttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaatttc540aaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattctaag600cacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaaccattg660gtagatttgccaataggtattaacatcactaggtttcaaactttacttgctttacataga720agttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttattat780gtgggttatcttcaacctaggacttttctattaaaatataatgaaaatggaaccattaca840gatgctgtagactgtgcacttgaccctctctcagaaacaaagtgtacgttgaaatccttc900actgtagaaaaaggaatctatcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctatt960gttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccaga1020tttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattct1080gtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaa1140ttaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaa1200gtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattacca1260gatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggt1320ggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagaga1380gatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggtttt1440aattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaa1500ccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtgga1560cctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggttta1620acaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggc1680agagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgac1740attacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaac1800caggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgca1860gatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgt1920gcaggctgtttaataggggctgaacatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccatt1980ggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaattctcctcggcgggcacgtagt2040gtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaattcagttgct2100tactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaaatt2160ctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggtgattca2220actgaatgca2230当前第1页12