一种重组鳗弧菌TolC蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种重组鳗弧菌tolc蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

鳗弧菌(vibrioanguillarum)是一种革兰氏阴性菌，能够感染包括鱼类、虾类、贝类等多种水产动物，鳗弧菌感染可导致弧菌病，该病是世界流行性疾病，可发生在任何季节，多年来给世界产业养殖造成了严重的经济损失。

常见报道的鱼类疫苗有灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等。亚单位疫苗因其接种剂量小、免疫原性强、抗体出现早、滴度高、持续时间长和毒副作用小等优点而得到关注。中国专利文献cn102988968a即公开了一种利用鳗弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其应用，其以鳗弧菌c312为模板进行pcr扩增，并通过大肠杆菌表达系统表达得到了重组鳗弧菌鞭毛蛋白flab，该重组鳗弧菌鞭毛蛋白flab与佐剂混合后用于免疫牙鲆，对免疫后的牙鲆进行终浓度为5x10⁶cfu/ml的鳗弧菌悬液100ul的攻毒实验，该疫苗的相对免疫保护效率可达78％。其中，重组鳗弧菌鞭毛蛋白的用量为15μg。

重组的外膜蛋白能够保持天然的免疫原性，刺激鱼体后产生特异性抗体，对病原菌的感染产生一定的免疫保护效率，某些还能够显著的增强宿主吞噬细胞的吞噬活性，因此逐步成为鱼类亚单位疫苗研究的热点。

细菌外膜蛋白虽然是一个很重要的免疫原，在疫苗中的应用报道很多，但并不是所有外膜蛋白都具有免疫保护效应，并且在不同菌株中同一种外膜蛋白的免疫保护效应也有一定差异。

技术实现要素：

本发明提供一种重组鳗弧菌tolc蛋白，以解决现有技术中鳗弧菌外膜蛋白免疫原性弱的问题。该重组鳗弧菌tolc蛋白可在用量更少的情况下取得与上述重组鳗弧菌鞭毛蛋白flab相当的免疫保护效果。

本发明的目的之二在于提供了所述重组鳗弧菌tolc蛋白的制备方法。

本发明的目的之三在于提供了一种鳗弧菌疫苗。

本发明的目的还在于提供了所述重组鳗弧菌tolc蛋白的用途。

本发明的重组鳗弧菌tolc蛋白采用如下技术方案：一种重组鳗弧菌tolc蛋白，所述重组鳗弧菌tolc蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述重组鳗弧菌tolc蛋白用于增强水产动物对鳗弧菌的免疫。

优选的，编码所述重组鳗弧菌tolc蛋白的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明的重组鳗弧菌tolc蛋白的制备方法，采用如下技术方案：包括下述步骤：(1)以鳗弧菌c312为模板，采用f1/r1为引物进行pcr扩增外膜蛋白tolc基因；(2)将步骤(1)所得pcr扩增产物与peasy-t1simple载体连接，连接液转化大肠杆菌dh5a，筛选质粒为tolc-ts；(3)再将所述质粒tolc-ts用限制性内切酶smai酶切后，纯化、回收tolc基因片段，并构建重组表达质粒pettolc；(4)将所述重组表达质粒pettolc转化大肠杆菌bl21(de3)，表达即为seqidno.1中的氨基酸序列所示的重组鳗弧菌tolc蛋白；

所述引物为f1:5’-cccgggatgaattggatgaacatgaaaacg–3’，带有smai酶切位点；r1:5’-cccggggtactccaccgcatcatgc-3’，带有smai酶切位点；

所述鳗弧菌c312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏编号为：cgmccno.6250。

本发明的鳗弧菌疫苗采用如下技术方案：所述鳗弧菌疫苗的原料包括如上述任意一项所述的重组鳗弧菌tolc蛋白。

优选的，采用腹腔注射所述鳗弧菌疫苗的方式进行免疫，所述重组鳗弧菌tolc蛋白的用量为10μg/次，免疫一次后采用lx10⁷cfu/ml的鳗弧菌对被免疫水产动物进行攻毒，相对免疫保护效率可达77％。正常情况下，疫苗中具有免疫原性的重组鳗弧菌tolc蛋白的用量越大，免疫效果更好，实际使用中可对疫苗中重组鳗弧菌tolc蛋白的用量进行适当增减，以达到更好的免疫效果。

优选的，所述鳗弧菌疫苗的原料还包括佐剂。

优选的，所述佐剂为al(oh)3，所述佐剂由5wt％naoh和5wt％al2(so4)3以2:5的体积比混合、离心后，将离心所得沉淀悬浮于pbs中至0.2mg/ml制备得到；所述鳗弧菌疫苗中重组鳗弧菌tolc蛋白与佐剂的质量比为1:1。

本发明的重组鳗弧菌tolc蛋白的用途采用下述技术方案：如上述任意一项所述的重组鳗弧菌tolc蛋白在制备增强水产动物免疫力的药物中的应用。

优选的，所述水产动物包括但不限于鱼类、虾类和贝类。例如，常见的鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼等。

优选的，所述水产动物为牙鲆。

本发明的有益效果是：本发明的氨基酸序列如seqidno.1所示的重组鳗弧菌tolc蛋白可在用量更少的情况下取得与上述重组鳗弧菌鞭毛蛋白flab相当的免疫保护效果。tolc是存在于革兰氏阴性菌细胞外膜上的一种功能最丰富的外膜蛋白之一，参与细胞质子泵功能，其在细胞毒力以及细胞耐药性等功能方面研究较多，本研究表明重组tolc蛋白具有保护效应，进一步揭示了其潜在的应用价值。

本发明的重组鳗弧菌tolc蛋白用于免疫动物时，在用量为10μg/次，免疫一次后采用lx10⁷cfu/ml的鳗弧菌对被免疫水产动物进行攻毒的情况下，相对免疫保护效率即可达77％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的纯化后的重组鳗弧菌tolc外膜蛋白。泳道m，分子量标准；泳道1，纯化后的重组鳗弧菌tolc蛋白。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、dna(pcr)产物纯化和dna片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司的相应试剂盒”。

2.质粒、dna连接液转化进入大肠杆菌皆用hanahan方法(sambrookandrussell:molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborpress2001)

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

1.1本发明的重组鳗弧菌tolc蛋白的氨基酸序列为：

seqidno.1:

mnwmnmktlsyaialsfpisvysqtleqavsitlatnpniksayneyvskrynseassgaylpridldagigyeavdlasgteneltrkeatitltqliwdgsstlndidrtsadaesvrfqlladaqdialevtkvyldatkafeiltlsesnlsvhkkiyrdiqkrvesgigstadlsqvearlakahgnllaaqnnlfdihtqfkrlvgqppqdlifpradhsalpftvddalekayqdhpvikvaqadvdsakfqykqtqgtnyptlsfeaaqtwrddaggiegssdefsamirmrynlynggsdsartdsaayqmnkakdlrdrtyrsveeglrlswsaldltlqqkefladhvdsasdtviayekqyklgkrtlldvlntenelfearkgyldakydeqyakyrvmnatgsllsslrvdtpkewhdavey

(a)序列特征:

长度:436；

类型:氨基酸序列；

链型:单链；

拓扑结构:线性；

(b)分子类型:蛋白质

(c)假设:否

(d)反义:否

(e)最初来源:鳗弧菌

结构特点:该蛋白预期含有一个类似tolc结构域(25-430)。

1.2编码该重组鳗弧菌tolc蛋白的核苷酸序列为：

seqidno.2：

atgaattggatgaacatgaaaacgttgagctacgccatcgcactcagcttcccgatctctgtatatagccagactcttgagcaagcggtgtcaataacgcttgcaaccaatccaaatattaaaagtgcatataacgaatatgtgagtaagcgctataatagcgaagcctcttctggtgcttaccttccaaggatcgatctcgatgctggtattggctacgaagcggttgatttagcctctggtactgaaaatgaacttactcgtaaagaagccaccattaccttaacccaactaatttgggatggttcttcgactttaaacgatattgatcgtacttcggctgatgccgaatcggttcgtttccaactcttagctgacgctcaagatatcgcattagaggtcactaaggtgtatctcgatgcaacgaaagcgtttgaaatactgacactttctgaaagcaacctctcagtacataagaaaatatatcgtgatatacaaaagcgtgtggaatcaggcattggttcaaccgctgatctttctcaggttgaagctcgtttagctaaagcccatggcaatcttttagctgcacagaataatctgtttgatatacatacccagtttaaacggttggtaggtcaacctcctcaagatttaattttccctagagcagaccattctgctttgccttttaccgttgatgacgctttagaaaaggcctaccaagatcacccggtcatcaaagtagcgcaagccgatgttgattccgcaaagtttcaatataaacaaactcagggaacaaattacccaacgttatctttcgaagctgcacaaacatggcgtgatgatgccggtgggatagaaggtagcagcgatgaattctcggccatgattaggatgcgttacaacctgtacaatggtggttcagattctgcgcgcaccgacagtgctgcctaccaaatgaacaaagcgaaagatttaagagatcggacttatcgtagtgttgaagaggggttgcgtttatcttggagcgctctcgatttgacattacaacaaaaagaatttttagccgatcatgttgattctgcttcagatacggttattgcttatgaaaaacaatataagctcggcaagcgaacactattggatgtgttgaatactgaaaatgagcttttcgaagcaagaaaaggttatctcgatgccaaatacgatgaacagtatgcaaaataccgtgttatgaatgcaactgggtcattgttgagttcgttgagagtggatacacccaaagagtggcatgatgcggtggagtac

实施例2鳗弧菌外膜蛋白tolc表达载体的构建方法:

质粒pettolc的构建：以鳗弧菌c312为模板，采用f1/r1为引物进行pcr扩增鳗弧菌外膜蛋白tolc基因。pcr条件为:94℃，60s预变性模板dna，然后94℃40s，50℃60s，72℃60s，5个循环；然后94℃40s，61℃60s，72℃60s，20个循环后再在72℃延伸反应10min。利用细菌基因组提取试剂盒提取鳗弧菌基因组，以其作为模板pcr扩增目的基因；产物同载体peasy-t1simple(购于transgenbiotech，北京)在室温连接1小时，连接液转化入大肠杆菌dh5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒tolc-ts，利用限制性内切酶smai对tolc-ts载体进行酶切，酶切产物用天根dna产物纯化试剂盒纯化，回收的tolc基因片段，构建重组表达质粒pettolc。将载体pet259(pet259构建过程参见zheng,w.j.,hu,y.h.,sun,l.,2010.cloningandanalysisofaferritinsubunitfromturbot(seophthalmusmaximus).fish.shellfish.immunol.28,829-836)用swai酶切后回收，将其与上述纯化的pcr片段用t4dna连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌dh5α，在含卡那霉素(100μg/ml)的lb培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pettolc，转化感受态细胞后挑取克隆进行pcr验证，阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码。

lb培养基的组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白陈，0.5％酵母粉，1.0％氯化钠，97.5％蒸馏水；鳗弧菌c312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏编号为：cgmccno.6250，保藏日期2012年6月21日，分类命名为鳗弧菌(vibrioanguillarum)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

引物为f1:5-cccgggatgaattggatgaacatgaaaacg-3，带有smai酶切位点。

r1:5-cccggggtactccaccgcatcatgc-3，带有smai酶切位点。

实施例3重组鳗弧菌外膜蛋白tolc的诱导表达和纯化：

将上述的质粒pettolc(实施例2制得)用常规方法转化大肠杆菌bl21(de3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(100μg/ml)的lb固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子，将其命名为bl21/pettolc。

将bl21/pettolc于含有卡那霉素的lb液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml新鲜的含有卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至0d600为0.6，加入终浓度为0.4mm的iptg，30℃继续以转速160rpm摇动培养4-5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白亲和层析柱histraphpcolumns(购于美国gehealthcare公司)回收纯化，纯化的蛋白经sds-page电泳检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后15v/cm电压下电泳2-2.5h)，测定其分子量大小(参见图1)。将纯化的蛋白经质谱分析，发现它的蛋白质质量与tolc相同，证实其为具有tolc序列的外膜蛋白。

裂解液为：终浓度为10mmnah2po4，10mmtris和8m尿素，ph8.0。

实施例4

重组鳗弧菌tolc蛋白作为疫苗的应用

步骤1)佐剂及疫苗混合液的制备

佐剂制备：将5％(质量比)naoh和5％(质量比)al2(so4)3以2:5体积比混合，将混合物以10,000g离5分钟。将沉淀悬浮于pbs中至0.2mg/ml。

疫苗混合液制备：将上述实施例纯化的疫苗蛋白在pbs中稀释至200μg/ml。将稀释后的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。佐剂对照液制备：将pbs与佐剂等体积混合。所述pbs组成成分按重量百分比计：0.8％nacl，0.02％kcl，0.358％na2hpo4.12h2o，0.024％nah2po4，余量为水。

步骤2)以重组鳗弧菌tolc蛋白为原料制备得到的疫苗的免疫应用：将80条牙鲆(每条重约15g)随机分为2组，每组40条。将这2组分别命名为a和b组。将a组的每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤1)的tolc疫苗混合液，将b组的每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤1)的佐剂对照液。

步骤3)鳗弧菌液的制备：在lb培养基中培养鳗弧菌c312至od600为1，然后离心(5000g，4℃)10min。收集菌体，将其悬浮于pbs中至终浓度为lx10⁷cfu/ml。

步骤4)疫苗免疫保护效应检测：在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的鳗弧菌悬液腹腔注射步骤2)的2组鱼，每条鱼的注射量为100μl。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：a组，9条；b组，39条；利用下列公式计算相对免疫保护效率(rps)：

rps＝100x(1-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)根据此公式算出tolc的免疫保护效率为77％，因此，所得疫苗能够有效保护牙鲆抵御鳗弧菌侵染。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南阳师范学院

<120>一种重组鳗弧菌tolc蛋白及其制备方法和应用

<130>aj202993

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>436

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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