牛粪中非O157产志贺毒素大肠埃希氏菌的分离鉴定方法与流程

本发明涉及微生物检测分离技术领域，具体涉及一种牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌分离鉴定方法。

背景技术：

产志贺毒素大肠埃希氏菌是一群重要的肠道致病菌，很少的感染剂量(10个菌左右)就可导致感染者出现出血性结肠炎、血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura，ttp)及溶血性尿毒综合症(hemolytic-uremicsyndrome，hus)等临床症状，患者死亡率高。而目前关于产志贺毒素大肠埃希氏菌的检测，也只是针对steco157∶h7制定了相应的检测标准，对非o157的stec菌株的检测还没有一个明确的分离鉴定方法。本专利依据志贺毒素基因是stec的共有特征，通过pcr扩增志贺毒素基因并结合麦康凯选择性平板来达到对stec的快速分离鉴定方法。

技术实现要素：

为克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌的分离鉴定方法，通过pcr扩增志贺毒素基因并结合麦康凯选择性平板来达到对stec的快速分离鉴定方法，其技术方案如下：

牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

s1，细菌选择培养：将采集的待测样本与ec肉汤培养基进行首次增菌，然后将增菌液以1:8～12的比例转移至新鲜的ec肉汤培养基进行二次增菌；

s2，stec分离：利用pcr扩增并结合麦康凯选择平板对s1中增菌后的细菌样本进行stec分离；

s3，stec鉴定：将s2中分离得到的阳性单克隆菌株活化于lb平板，然后对活化的菌株进行stx1/2基因扩增、凝胶电泳及成像，显示阳性的，即为stec菌株；

s4，stec保藏，对s3中经过鉴定为stec的菌株进行菌种保藏。

作为本发明进一步的方案：所述的s1中，首次增菌的具体方法为：将收集的样本称取后加入无菌ec肉汤，振荡均匀，然后培养，得到首次增菌液。其中，样本和无菌ec肉汤的质量比为1:8～12，振荡时间10～20s；二次增菌的具体方法为，将首次增菌液振荡均匀后，加入无菌ec肉汤，所述的首次增菌液与无菌ec肉汤的质量比为1:8～12，振荡均匀后进行培养；首次增菌及二次增菌的培养温度都为41～43℃，将混匀的样本悬浮液放置摇床，在转速为180～200rpm的条件下，培养18～24h。

作为本发明进一步的方案：所述的s2的具体操作为：

s2.1，利用pcr扩增stec所共有的志贺毒素基因(stx1/2)，然后经过凝胶电泳及成像判断牛粪样本中是否携带stec菌株，

s2.2，将s2.1中判断为阳性及疑似样本的菌液分别稀释涂布于麦康凯平板上，然后在每个样本中挑取20个疑似菌落涂抹于lb平板四个区域，

s2.3，在s2.2中所述的四个区域中，每个区域5株菌混合并进行stx1/2基因扩增，根据凝胶电泳及成像来判断每个区域中的5个菌落中是否存在产志贺毒素菌株，所述基因扩增采用pcr扩增方法。

s2.4，经s2.3检测判断为阳性的区域，则继续将该阳性区域中的每株菌进行stx1/2基因扩增，进而判断哪个菌落为产志贺毒素菌株；所述基因扩增采用pcr扩增方法。

菌液稀释涂布时，阳性及疑似样本的稀释倍数是10^-4，10^-5和10^-6，涂布量为48～52μl；

将菌液滴于麦康凯平板的五个区域，五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域。涂布滴加菌液于五个区域，目的是将菌液均匀涂布；

进行pcr扩增时使用的dna模板均是通过煮沸法制得；

作为本发明进一步的方案：所述的s2.2中菌落挑取具体操作为：选取菌落数在30～300之间的麦康凯平板进行挑菌，一个样本挑取一个平板，将该平板用十字线划分为四个区域。四个区域分别为：左上，左下，右上和右下，十字线划分四个区域，目的是提高目的菌株的挑取概率，在上述的四个区域中，各挑取5个单菌落，置于lb平板对应的四个区域，区域编号为1，2，3和4。

作为本发明进一步的方案：所述的s3的具体步骤为：

s3.1，对已经确定的阳性区域进行单克隆菌株鉴定，具体步骤为：

s3.1.1对经s2中鉴定为阳性区域的5个单克隆菌落进行编号；用无菌牙签取少量的菌体涮于500μl的无菌ddh2o，并做好编号；

s3.1.2涡旋振荡10～20s，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；将清洗两次的菌体，加入300μl的无菌ddh2o，吹吸混匀，并涡旋振荡10～20s；

s3.1.3将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，100℃加热煮沸15min，然后将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

s3.1.4将煮沸冷却后的菌液与离心机，13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，然后进行pcr扩增操作，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；

s3.2，进行stec鉴定：将扩增后阳性的单克隆菌株活化于lb平板，37℃恒温培养箱培养18～24h，并利用pcr扩增stx1/2基因，再利用凝胶电泳及成像来确定得到的即为产志贺毒素大肠埃希氏菌。

作为本发明进一步的方案：用棉签将菌体涮于装有1.2ml40％lb-甘油的冻存管中，于-80℃的冰箱进行保存。

作为本发明进一步的方案：所述的dna模板的制备方法为：

(1)将金属加热器开至100℃，稳定30min；

(2)取1ml二次增菌液于1.5mlep管中13000rpm离心5min，弃上清；

(3)加500μl无菌ddh2o将菌体沉淀重悬，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；

(4)将清洗两次的菌体，加300μl无菌ddh2o重悬并用涡旋振荡器振荡10～20s；

(5)将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，加热煮沸15min；

(6)将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

(7)将冷却后煮沸的菌液与离心机13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中。

作为本发明进一步的方案：所述的pcr扩增时，反应体系和反应条件如下：pcr反应体系：dna模板5μl，10×pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，dntp2μl，taqdna聚合酶0.125μl，上下游引物各为0.3μl，ddh2o13.275μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

作为本发明进一步的方案：所述的pcr扩增操作的具体步骤为，

(a)按照反应体系和样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)

(b)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；

(c)分装：将pcr管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μl，然后将5μldna模板加入对应标号的pcr管中，记录编号；

(d)pcr扩增：将pcr管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入pcr仪，再次确认每个pcr管盖子已盖好。设定pcr程序进行扩增。

作为本发明进一步的方案：所述的凝胶电泳及成像方法的具体操作步骤为：

(i)电泳：配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入eb染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μlpcr产物，缓慢放入0.5×tris-borate-edta缓冲区，最后设定程序120v，90ma电泳35min；

(ii)成像：将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。

本发明可以实现以下有益效果：

(1)本发明对牛粪便中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌能够有效的分离，在细菌培培养时，进行两次增菌，由于首次增菌液中有大量牛粪杂质，若进行dna模板提取，杂质较多影响扩增结果，故增加了二次增菌，这样可以提高dna纯度。

(2)首次及二次增菌培养温度为41～43℃，因为较高培养温度可以抑制除目标菌外的菌株生长繁殖，提高目标菌株的筛选几率。首次及二次增菌转速为180～200rpm；这样的转速范围增加菌株接触机会，使菌株大量繁殖。培养时间为18～24h；这样的时间可以保证使菌株处于生长稳定期。

(3)本发明要分离的目标菌株在麦康凯平板菌落颜色为粉红或者紫红色，通过将阳性及疑似样本稀释涂布于麦康凯平板，一方面对初筛的样本是否存在目标菌株再次验证，另一方便稀释涂布后的平板，菌株分布均匀方便挑取。阳性及疑似菌液稀释涂布于麦康凯选择平板，不仅对初筛结果进行验证，而且生长出的菌落形态清晰，便于挑取，为stec菌株的分离降低了难度。

(4)此外，通过增加菌落挑取量尽可能减少漏检的概率。然后对挑取的菌落进行分区域扩增，减少工作量，为快速检测节约了时间。

(5)对各区域5株菌混合扩增鉴定后，进一步对扩增阳性的区域进行单克隆菌株扩增。最后对阳性克隆株，再次进行验证，提高了准确率。

附图说明

图1是是本发明中麦康凯稀释涂布图；

图2为本发明lb分区域培养图；

图3为本发明pcr鉴定stec电泳图。

具体实施方式

以下将参照附图，通过实施例方式详细地描述本发明的技术方案。在此需要说明的是，对于这些实施例方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，单独存在b，同时存在a和b三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，a/和b，可以表示：单独存在a，单独存在a和b两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”关系。

牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

s1，细菌选择培养：将采集的待测样本与ec肉汤培养基进行首次增菌，然后将增菌液以1:8～12的比例转移至新鲜的ec肉汤培养基进行二次增菌；

其中，首次增菌的具体方法为：将收集的样本称取后加入无菌ec肉汤，振荡均匀，然后培养，得到首次增菌液。其中，样本和无菌ec肉汤的质量比为1:8～12，振荡时间10～20s。

其中，二次增菌的具体方法为，将首次增菌液振荡均匀后，加入无菌ec肉汤，所述的首次增菌液与无菌ec肉汤的质量比为1:8～12，振荡均匀后进行培养。

首次增菌及二次增菌的培养温度都为41～43℃，将混匀的样本悬浮液放置摇床，在转速为180～200rpm的条件下，培养18～24h。

在s1中，进行了两次增菌，由于首次增菌液中有大量牛粪杂质，若进行dna模板提取，杂质较多影响扩增结果，故增加了二次增菌，这样可以提高dna纯度。

首次及二次增菌培养温度为41～43℃，因为较高培养温度可以抑制除目标菌外的生长繁殖，提高目标菌株的筛选几率。

首次及二次增菌转速为180～200rpm；这样的转速范围增加菌株接触机会，使菌株大量繁殖。

培养时间为18～24h；这样的时间可以保证使菌株处于生长稳定期。

s2，stec分离：利用pcr扩增并结合麦康凯选择平板对s1中增菌后的细菌样本进行stec分离，具体步骤为：

s2.1，利用pcr扩增stec所共有的志贺毒素基因(stx1/2)，然后经过凝胶电泳及成像判断牛粪样本中是否携带stec菌株，

s2.2，将s2.1中判断为阳性及疑似样本的菌液分别稀释涂布于麦康凯平板上，然后在每个样本中挑取20个疑似菌落涂抹于lb平板四个区域，

s2.3，在s2.2中所述的四个区域中，每个区域5株菌混合并进行stx1/2基因扩增，根据凝胶电泳及成像来判断每个区域中的5个菌落中是否存在产志贺毒素菌株，所述基因扩增采用pcr扩增方法。

s2.4，经s2.3检测判断为阳性的区域，则继续将该阳性区域中的每株菌进行stx1/2基因扩增，进而判断哪个菌落为产志贺毒素菌株；所述基因扩增采用pcr扩增方法。

在进行s2.2中的涂布菌液时，阳性及疑似样本的稀释倍数是10^-4，10^-5和10^-6，涂布量为48～52μl，麦康凯稀释涂布图如图1所示，图中a、b、c三个麦康凯平板对应的稀释倍数分别为10^-4，10^-5和10^-6。图1通过凝胶成像拍摄，可以更加清晰的看到菌落个数。

此处，阳性及疑似样本的稀释倍数是10^-4，10^-5和10^-6：不同菌株存在差异，试验发现10^-4，10^-5和10^-6平板一定存在一个平板菌落数在30～300。而稀释涂布时稀释倍数为10^-1～10^-3菌落数较多，给菌株挑取增加难度，10^-7菌落数较少无法达到所需挑取菌株数。

在具体涂布的时候，将稀释后的菌液滴于麦康凯平板的五个区域，五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域。涂布滴加菌液五个区域，目的是将菌液均匀涂布；

所述的稀释涂布的具体方法为：

(1)将阳性及疑似样本用涡旋振荡器振荡10～20s；

(2)取1ml阳性及疑似样本于1.5mlep管中；

(3)取100μl菌悬液于900μl无菌ddh2o，涡旋振荡10～20s使其混匀，制成10^-1倍稀释液；

(4)以此类推制成10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6和10^-7倍稀释液；

(5)取48～52μl10^-4，10^-5和10^-6倍稀释液滴于麦康凯平板的五个区域(五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域)，然后用涂布棒均匀涂开；

(6)待平板静置10min后，放置37℃恒温培养箱培养18～24h；

(7)挑取菌落数30～300，且菌落颜色为粉红色或紫红色的平板进行之后试验。

其中所有的dna模板均是通过煮沸法制得；

其中，s2.2中菌落挑取具体操作为：选取菌落数在30～300之间的麦康凯平板进行挑菌，一个样本挑取一个平板，将该平板用十字线划分为四个区域。四个区域分别为：左上，左下，右上和右下，十字线划分四个区域，目的是提高目的菌株的挑取概率，在上述的四个区域中，各挑取5个单菌落，置于lb平板对应的四个区域，区域编号为1，2，3和4。

每个样本挑选20个疑似菌落涂抹于lb平板四个区域：因为除目标菌株外，其余类别大肠杆菌在麦康凯平板菌落颜色都为粉红色或紫红色，无法确定哪些属于目标菌落，故增加挑取菌落量来增加目标菌株的挑取几率。由于菌落挑取量较少漏检概率就大，菌落挑取量较大则检出耗时长无法达到快速检测的目的。最终确定挑取量为20个菌落。

在混合区域扩增具体操作为：将lb平板每个区域的5株菌，分别用牙签挑取少量的菌体涮于含无菌ddh2o的一只ep管中，煮沸法制得dna模板，然后进行pcr扩增。

其中，pcr扩增使用的dna模板通过煮沸法制得。

s3，将s2中分离得到的阳性单克隆菌株活化于lb平板，然后对活化的菌株进行stx1/2基因扩增、凝胶电泳及成像，显示阳性的，即为stec菌株；具体实施步骤如下：

s3.1，对已经确定的阳性区域进行单克隆菌株鉴定，具体步骤为：

s3.1.1对经s2中鉴定为阳性区域的5个单克隆菌落进行编号；用无菌牙签取少量的菌体涮于500μl的无菌ddh2o，并做好编号；

s3.1.2涡旋振荡10～20s，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；将清洗两次的菌体，加入300μl的无菌ddh2o，吹吸混匀，并涡旋振荡10～20s；

s3.1.3将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，100℃加热煮沸15min，然后将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

s3.1.4将煮沸冷却后的菌液与离心机，13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，然后进行pcr扩增操作，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；

s3.2，进行stec鉴定：将扩增后阳性的单克隆菌株活化于lb平板，37℃恒温培养箱培养18～24h，并利用pcr扩增stx1/2基因，再利用凝胶电泳及成像来确定得到的即为产志贺毒素大肠埃希氏菌。

s4，stec保藏，对pcr鉴定为stec的菌株进行菌种保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2ml40％lb-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。

本方法中，所述的dna模板的制备方法为：

(1)将金属加热器开至100℃，稳定30min；

(2)取1ml二次增菌液于1.5mlep管中13000rpm离心5min，弃上清；

(3)加500μl无菌ddh2o将菌体沉淀重悬，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；

(4)将清洗两次的菌体，加300μl无菌ddh2o重悬并用涡旋振荡器振荡10～20s；

(5)将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，加热煮沸15min；

(6)将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

(7)将冷却后煮沸的菌液与离心机13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中。

本方法中在进行所述的pcr扩增时，反应体系和反应条件如下：pcr反应体系：dna模板5μl，10×pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，dntp2μl，taqdna聚合酶0.125μl，上下游引物各为0.3μl，ddh2o13.275μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

本方法中所述的pcr扩增操作的具体步骤为，

(a)按照反应体系和样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)

(b)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；

(c)分装：将pcr管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μl，然后将5μldna模板加入对应标号的pcr管中，记录编号；

(d)pcr扩增：将pcr管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入pcr仪，再次确认每个pcr管盖子已盖好。设定pcr程序进行扩增。

本方法中采用的凝胶电泳及成像的具体操作步骤为：

(i)电泳：配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入eb染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μlpcr产物，缓慢放入0.5×tris-borate-edta缓冲区，最后设定程序120v，90ma电泳35min；

(ii)成像：将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。

本发明pcr鉴定stec电泳图，如图3所示，阴性均未检出，阳性均有检出，分离的菌株扩增条带于阳性条带一致，故认为属于目标菌株。

本发明中进行pcr扩增stx1和stx2基因时，选择的引物序列及合成引物序列见表1，所有的引物均由北京奥科鼎盛有限公司合成。进行pcr扩增时的反应体系及反应条件见表2。

表1pcr扩增引物

表2pcr反应体系及反应条件

在进行pcr扩增时最重要的是退火温度和循环数，如果温度过高，特异性较强可能部分阳性菌株存在漏检，退火温度过低则特异性较强，可能出现假阳性；循环数过多可能产生引物二聚体，检测时间延长达不到快速检测的目的，循环数过低，目标条带较模糊，影响结果判断。

参加pcr反应的物质主要有五种即引物、酶、dntp、模板和mg2+：引物是pcr特异性反应的关键；酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少；dntp浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少；模板核酸的量与纯化程度,本研究为煮沸法制得模板，纯度及浓度较低，故选用5μl；mg²⁺浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低taqdna聚合酶的活性，使反应产物减少。

实施例1

牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

s1，细菌选择培养：将采集的待测样本与ec肉汤培养基进行首次增菌，然后将增菌液以1:8的比例转移至新鲜的ec肉汤培养基进行二次增菌；

其中，首次增菌的具体方法为：将收集的样本称取后加入无菌ec肉汤，振荡均匀，然后培养，得到首次增菌液。其中，样本和无菌ec肉汤的质量比为1:8，振荡时间10s。

其中，二次增菌的具体方法为，将首次增菌液振荡均匀后，加入无菌ec肉汤，所述的首次增菌液与无菌ec肉汤的质量比为1:8，振荡均匀后进行培养。

首次增菌及二次增菌的培养温度都为41℃，将混匀的样本悬浮液放置摇床，在转速为180rpm的条件下，培养18h。

s2，stec分离：利用pcr扩增并结合麦康凯选择平板对s1中增菌后的细菌样本进行stec分离，具体步骤为：

s2.1，利用pcr扩增stec所共有的志贺毒素基因(stx1/2)，然后经过凝胶电泳及成像，来判断牛粪样本中是否携带stec菌株，

s2.2，将s2.1中判断为阳性及疑似样本的菌液分别稀释涂布于麦康凯平板，然后在每个样本中挑取20个疑似菌落涂抹于lb平板四个区域，

s2.3，在s2.2中所述的四个区域中，每个区域5株菌混合并进行stx1/2基因扩增，根据凝胶电泳及成像来判断每个区域中的5个菌落中是否存在产志贺毒素菌株，所述基因扩增采用pcr扩增方法。

s2.4，经s2.3检测判断为阳性的区域，则继续将该阳性区域中的每株菌进行stx1/2基因扩增，进而判断哪个菌落为产志贺毒素菌株；所述基因扩增采用pcr扩增方法。

在进行s2.2中的涂布菌液时，阳性及疑似样本的稀释倍数是10^-4，10^-5和10^-6，涂布量为48μl，

在具体涂布的时候，将稀释后的菌液滴于麦康凯平板的五个区域，五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域。涂布滴加菌液五个区域，目的是将菌液均匀涂布；

所述的稀释涂布的具体方法为：

(1)将阳性及疑似样本用涡旋振荡器振荡10s；

(2)取1ml阳性及疑似样本于1.5mlep管中；

(3)取100μl菌悬液于900μl无菌ddh2o，涡旋振荡10～20s使其混匀，制成10^-1倍稀释液；

(4)以此类推制成10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6和10^-7倍稀释液；

(5)取48μl10^-4,10^-5和10^-6倍稀释液滴于麦康凯平板的五个区域(五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域)，然后用涂布棒均匀涂开；

(6)待平板静置10min后，放置37℃恒温培养箱培养18h；

(7)挑取菌落数30～300范围内，且菌落颜色为粉红色或紫红色的平板进行之后试验。

其中所有的dna模板均是通过煮沸法制得；

其中，菌落挑取具体操作为：选取菌落数在30～300之间的麦康凯平板进行挑菌，一个样本挑取一个平板，将该平板用十字线划分为四个区域。四个区域分别为：左上，左下，右上和右下。十字线划分四个区域，目的是提高目的菌株的挑取概率，每个区域挑取5个单菌落于lb平板对应的四个区域，区域编号为1，2，3和4。

在混合区域扩增具体操作为：将lb平板每个区域的5株菌，分别用牙签挑取少量的菌体涮于含无菌ddh2o的一只ep管中，煮沸法制得dna模板，然后进行pcr扩增。

其中，pcr扩增使用的dna模板通过煮沸法制得。

s3，stec鉴定：将s2中分离得到的阳性单克隆菌株活化于lb平板，然后对活化的菌株进行stx1/2基因扩增、凝胶电泳及成像，显示阳性的，即为stec菌株；

s3.1，对已经确定的阳性区域进行单克隆菌株鉴定，具体步骤为：

s3.1.1对经s2中鉴定为阳性区域的5个单克隆菌落进行编号；用无菌牙签取少量的菌体涮于500μl的无菌ddh2o，并做好编号；

s3.1.2涡旋振荡10s，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；将清洗两次的菌体，加入300μl的无菌ddh2o，吹吸混匀，并涡旋振荡10s；

s3.1.3将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，100℃加热煮沸15min，然后将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

s3.1.4将煮沸冷却后的菌液与离心机，13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，然后进行pcr扩增操作，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；

s3.2，进行stec鉴定：将扩增得到的阳性的单克隆菌株活化于lb平板，37℃恒温培养箱培养18h，并利用pcr扩增stx1/2基因，来确定得到的即为产志贺毒素大肠埃希氏菌。

s4，stec保藏，对pcr鉴定为stec的菌株进行菌种保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2ml40％lb-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。

本方法中，所述的dna模板的制备方法为：

(1)将金属加热器开至100℃，稳定30min；

(2)取1ml二次增菌液于1.5mlep管中13000rpm离心5min，弃上清；

(3)加500μl无菌ddh2o将菌体沉淀重悬，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；

(4)将清洗两次的菌体，加300μl无菌ddh2o重悬并用涡旋振荡器振荡10～20s；

(5)将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，加热煮沸15min；

(6)将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

(7)将冷却后煮沸的菌液与离心机13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中。

本方法中在进行所述的pcr扩增时，反应体系和反应条件如下：pcr反应体系：dna模板5μl，10×pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，dntp2μl，taqdna聚合酶0.125μl，上下游引物各为0.3μl，ddh2o13.275μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

本方法中所述的pcr扩增操作的具体步骤为，

(a)按照反应体系和样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)

(b)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；

(c)分装：将pcr管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μl，然后将5μldna模板加入对应标号的pcr管中，记录编号；

(d)pcr扩增：将pcr管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入pcr仪，再次确认每个pcr管盖子已盖好。设定pcr程序进行扩增。

本方法中采用的所述的凝胶电泳及成像方法的具体操作步骤为：

(i)电泳：配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入eb染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μlpcr产物，缓慢放入0.5×tris-borate-edta缓冲区，最后设定程序120v，90ma电泳35min；

(ii)成像：将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。

实施例2

牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

s1，细菌选择培养：将采集的待测样本与ec肉汤培养基进行首次增菌，然后将增菌液以1:8～12的比例转移至新鲜的ec肉汤培养基进行二次增菌；

其中，首次增菌的具体方法为：将收集的样本称取后加入无菌ec肉汤，振荡均匀，然后培养，得到首次增菌液。其中，样本和无菌ec肉汤的质量比为1:12，振荡时间20s。

其中，二次增菌的具体方法为，将首次增菌液振荡均匀后，加入无菌ec肉汤，所述的首次增菌液与无菌ec肉汤的质量比为1:12，振荡均匀后进行培养。

首次增菌及二次增菌的培养温度都为43℃，将混匀的样本悬浮液放置摇床，在转速为200rpm的条件下，培养24h。

s2，stec分离：利用pcr扩增并结合麦康凯选择平板对s1中增菌后的细菌样本进行stec分离，具体步骤为：

s2.1，利用pcr扩增stec所共有的志贺毒素基因(stx1/2)，来判断牛粪样本中是否携带stec菌株，

s2.2，将s2.1中判断为阳性及疑似样本的菌液分别稀释涂布于麦康凯平板，然后在每个样本中挑取20个疑似菌落涂抹于lb平板四个区域，

s2.3，在s2.2中所述的四个区域中，每个区域5株菌混合进行stx1/2基因扩增，根据凝胶电泳检及成像来判断每个区域中的5个菌落中是否存在产志贺毒素菌株，

s2.4，经s2.3判断为阳性的区域，则继续将该阳性区域中的每株菌进行stx1/2基因扩增，进而判断哪个菌落为产志贺毒素菌株。

在进行s2.2中的涂布菌液时，阳性及疑似样本的稀释倍数是10^-4，10^-5和10^-6，涂布量为52μl，在具体涂布的时候，将稀释后的菌液滴于麦康凯平板的五个区域，五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域。涂布滴加菌液五个区域，目的是将菌液均匀涂布；

所述的稀释涂布的具体方法为：

(1)将阳性及疑似样本用涡旋振荡器振荡20s；

(2)取1ml阳性及疑似样本于1.5mlep管中；

(3)取100μl菌悬液于900μl无菌ddh2o，涡旋振荡10～20s使其混匀，制成10^-1倍稀释液；

(4)以此类推制成10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6和10^-7倍稀释液；

(5)取48～52μl10^-4,10^-5和10^-6倍稀释液滴于麦康凯平板的五个区域(五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域)，然后用涂布棒均匀涂开；

(6)待平板静置10min后，放置37℃恒温培养箱培养24h；

(7)挑取菌落数30～300，且菌落颜色为粉红色或紫红色的平板进行之后试验。

其中所有的dna模板均是通过煮沸法制得；

其中，菌落挑取具体操作为：选取落数在30～300之间的麦康凯平板进行挑菌，一个样本挑取一个平板，将该平板用十字线划分为四个区域。四个区域分别为：左上，左下，右上和右下。十字线划分四个区域，目的是提高目的菌株的挑取概率，每个区域挑取5个单菌落于lb平板对应的四个区域，区域编号为1，2，3和4。

在混合区域扩增具体操作为：将lb平板每个区域的5株菌，分别用牙签挑取少量的菌体涮于含无菌ddh2o的一只ep管中，煮沸法制得dna模板，然后进行pcr扩增。

其中，pcr扩增使用的dna模板通过煮沸法制得。

s3，对s2中分离得到的阳性单克隆菌株活化于lb平板，然后对活化的菌株进行stx1/2基因扩增、凝胶电泳及成像，显示阳性的，即为stec菌株；

s3.1，对已经确定的阳性区域进行单克隆菌株鉴定，具体步骤为：

s3.1.1对经s2中鉴定为阳性区域的5个单克隆菌落进行编号；用无菌牙签取少量的菌体涮于500μl的无菌ddh2o，并做好编号；

s3.1.2涡旋振荡20s，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；将清洗两次的菌体，加入300μl的无菌ddh2o，吹吸混匀，并涡旋振荡20s；

s3.1.3将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，100℃加热煮沸15min，然后将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

s3.1.4将冷却后煮沸的菌液与离心机，13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为pcr模板，然后进行pcr扩增操作，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；

s3.2，进行stec鉴定：将扩增得到的阳性的单克隆菌株活化于lb平板，37℃恒温培养箱培养18～24h，并利用pcr扩增stx1/2基因，来确定得到的即为产志贺毒素大肠埃希氏菌。

s4，stec保藏，对pcr鉴定为stec的菌株进行菌种保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2ml40％lb-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。

本方法中，所述的dna模板的制备方法为：

(1)将金属加热器开至100℃，稳定30min；

(2)取1ml二次增菌液于1.5mlep管中13000rpm离心5min，弃上清；

(3)加500μl无菌ddh2o将菌体沉淀重悬，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；

(4)将清洗两次的菌体，加300μl无菌ddh2o重悬并用涡旋振荡器振荡20s；

(5)将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，加热煮沸15min；

(6)将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

(7)将冷却后煮沸的菌液与离心机13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中。

本方法中在进行所述的pcr扩增时，反应体系和反应条件如下：pcr反应体系：dna模板5μl，10×pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，dntp2μl，taqdna聚合酶0.125μl，上下游引物各为0.3μl，ddh2o13.275μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

本方法中所述的pcr扩增操作的具体步骤为，

(a)按照反应体系和样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)

(b)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；

(c)分装：将pcr管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μl，然后将5μldna模板加入对应标号的pcr管中，记录编号；

(d)pcr扩增：将pcr管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入pcr仪，再次确认每个pcr管盖子已盖好。设定pcr程序进行扩增。

本方法中采用的所述的凝胶电泳及成像方法的具体操作步骤为：

(i)电泳：配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入eb染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μlpcr产物，缓慢放入0.5×tris-borate-edta缓冲区，最后设定程序120v，90ma电泳35min；

(ii)成像：将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。

实施例3

牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

s1，细菌选择培养：将采集的待测样本与ec肉汤培养基进行首次增菌，然后将增菌液以1:8～12的比例转移至新鲜的ec肉汤培养基进行二次增菌；

其中，首次增菌的具体方法为：将收集的样本称取后加入无菌ec肉汤，振荡均匀，然后培养，得到首次增菌液。其中，样本和无菌ec肉汤的质量比为1:10，振荡时间15s。

其中，二次增菌的具体方法为，将首次增菌液振荡均匀后，加入无菌ec肉汤，所述的首次增菌液与无菌ec肉汤的质量比为1:10，振荡均匀后进行培养。

首次增菌及二次增菌的培养温度都为42℃，将混匀的样本悬浮液放置摇床，在转速为190rpm的条件下，培养21h。

s2，stec分离：利用pcr扩增并结合麦康凯选择平板对s1中增菌后的细菌样本进行stec分离，具体步骤为：

s2.1，利用pcr扩增stec所共有的志贺毒素基因(stx1/2)，来判断牛粪样本中是否携带stec菌株，

s2.2，将s2.1中判断为阳性及疑似样本的菌液分别稀释涂布于麦康凯平板上，然后在每个样本中挑取20个疑似菌落涂抹于lb平板四个区域，

s2.3，在s2.2中所述的四个区域中，每个区域5株菌混合进行stx1/2基因扩增，根据凝胶电泳及成像来判断每个区域中的5个菌落中是否存在产志贺毒素菌株，

s2.4，经s2.3检测判断为阳性的区域，则继续将该阳性区域中的每株菌进行stx1/2基因扩增，进而判断哪个菌落为产志贺毒素菌株。

在进行s2.2中的涂布菌液时，阳性及疑似样本的稀释倍数是10^-4，10^-5和10^-6，涂布量为50μl，在具体涂布的时候，将稀释后的菌液滴于麦康凯平板的五个区域，五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域。涂布滴加菌液五个区域，目的是将菌液均匀涂布；

所述的稀释涂布的具体方法为：

(1)将阳性及疑似样本用涡旋振荡器振荡15s；

(2)取1ml阳性及疑似样本于1.5mlep管中；

(3)取100μl菌悬液于900μl无菌ddh2o，涡旋振荡15s使其混匀，制成10^-1倍稀释液；

(4)以此类推制成10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6和10^-7倍稀释液；

(5)取50μl10^-4,10^-5和10^-6倍稀释液滴于麦康凯平板的五个区域(五个区域分别为：左上，左下，右上，右下和中部区域)，然后用涂布棒均匀涂开；

(6)待平板静置10min后，放置37℃恒温培养箱培养21h；

(7)挑取菌落数30～300，且菌落颜色为粉红色或紫红色的平板进行之后试验。

其中所有的dna模板均是通过煮沸法制得；

其中，菌落挑取具体操作为：选取落数在30～300之间的麦康凯平板进行挑菌，一个样本挑取一个平板，将该平板用十字线划分为四个区域。四个区域分别为：左上，左下，右上和右下。十字线划分四个区域，目的是提高目的菌株的挑取概率，每个区域挑取5个单菌落于lb平板对应的四个区域，区域编号为1，2，3和4。

在混合区域扩增具体操作为：将lb平板每个区域的5株菌，分别用牙签挑取少量的菌体涮于含无菌ddh2o的一只ep管中，煮沸法制得dna模板，然后进行pcr扩增。

其中，pcr扩增使用的dna模板通过煮沸法制得。

s3，对s2中分离得到的阳性单克隆菌株活化于lb平板，然后对活化的菌株进行stx1/2基因扩增、凝胶电泳及成像，显示阳性的，即为stec菌株；

s3.1，对已经确定的阳性区域进行单克隆菌株鉴定，具体步骤为：

s3.1.1对经s2中鉴定为阳性区域的5个单克隆菌落进行编号；用无菌牙签取少量的菌体涮于500μl的无菌ddh2o，并做好编号；

s3.1.2涡旋振荡10～20s，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；将清洗两次的菌体，加入300μl的无菌ddh2o，吹吸混匀，并涡旋振荡15s；

s3.1.3将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，100℃加热煮沸15min，然后将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

s3.1.4将冷却后煮沸的菌液与离心机，13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为pcr模板，然后进行pcr扩增操作，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中；

s3.2，进行stec鉴定：将扩增后阳性的单克隆菌株活化于lb平板，37℃恒温培养箱培养18～24h，并利用pcr扩增stx1/2基因，来确定得到的即为产志贺毒素大肠埃希氏菌。

s4，stec保藏，对pcr鉴定为stec的菌株进行菌种保藏。具体操作为：用棉签将菌体涮于装有1.2ml40％lb-甘油的冻存管中，于-80℃冰箱进行保存。

本方法中，所述的dna模板的制备方法为：

(1)将金属加热器开至100℃，稳定30min；

(2)取1ml二次增菌液于1.5mlep管中13000rpm离心5min，弃上清；

(3)加500μl无菌ddh2o将菌体沉淀重悬，13000rpm离心5min，弃去上清，重复两次；

(4)将清洗两次的菌体，加300μl无菌ddh2o重悬并用涡旋振荡器振荡15s；

(5)将准备好的菌悬液放入事前预热好的金属加热器，加热煮沸15min；

(6)将煮沸后的菌液于4℃冰箱放置5min；

(7)将冷却后煮沸的菌液与离心机13000rpm离心10min，吸取200μl上清即为dna模板，若模板不立即使用，保存于-20℃冰箱中。

本方法中在进行所述的pcr扩增时，反应体系和反应条件如下：pcr反应体系：dna模板5μl，10×pcrbuffer2.5μl，mgcl21.5μl，dntp2μl，taqdna聚合酶0.125μl，上下游引物各为0.3μl，ddh2o13.275μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

本方法中所述的pcr扩增操作的具体步骤为，

(a)按照反应体系和样本数量计算试剂总用量(注：通常多算1-2个样的体系)

(b)混合体系的配制：试剂全部溶解后，振荡混匀。根据反应体系按步加入，混匀并且离心，置于冰盒上备用；

(c)分装：将pcr管和已配好的体系都置于冰上，先加入事先配好的体系20μl，然后将5μldna模板加入对应标号的pcr管中，记录编号；

(d)pcr扩增：将pcr管管壁上的溶液进行短暂离心，小心取出，按顺序放入pcr仪，再次确认每个pcr管盖子已盖好。设定pcr程序进行扩增。

本方法中采用的所述的凝胶电泳及成像方法的具体操作步骤为：

(i)电泳：配制1％琼脂糖，微波煮沸三次，待冷却到50℃，加入eb染料混匀，缓慢的倒入事先插好梳子的胶板，半小时后拔出梳子，然后每孔上样5μlpcr产物，缓慢放入0.5×tris-borate-edta缓冲区，最后设定程序120v，90ma电泳35min；

(ii)成像：将电泳结束的凝胶放入成像系统中成像，根据成像结果对应的mark区间，是否与引物大小相一致来判断基因的检出，并做好记录。

利用本发明方法对收集的样本进行stec菌株的分离，成功的在育成牛和犊牛的14份样本中，分离出了stec菌株，表3所示

表3stec菌株分离情况

综上所述，该方法可以准确地将stec菌株从牛粪样本中分离，并且操作简单，成本低。

现有技术中，对于牛粪样本中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌的分离鉴定还没有一个明确的方法，故本专利利用pcr扩增并结合麦康凯选择平板进行stec分离。通过增加二次增菌，降低培养液中牛粪样本杂质，提高dna纯度，进而减少对样本中stec菌株检测的影响。然后对阳性及疑似样本进行麦康可以凯平板稀释涂布。由于目标菌株在麦康凯平板菌落颜色为粉红或者紫红色，一方面再次对初筛的样本是否存在目标菌株进行验证，另一方面稀释涂布后的平板菌株分布均匀方便对菌株的挑取。此外，非目标菌株的大肠杆菌在麦康凯平板菌落颜色也为粉红或紫红色，通过增加菌落挑取量尽可能减少漏检的概率。然后对挑取的菌落进行分区域扩增，减少了工作量，为快速检测节约了时间。对扩增阳性的区域进行单克隆扩增。最后将阳性克隆株活化于lb平板，再次进行验证，提高了准确率。

本分离鉴定方法简单易操作，通过几次的扩增和鉴定筛选，能够将stec菌株成功分离，且平板混合阳性样本量与分离出的菌株数一致。由此说明本方法适用于目标菌株从牛粪样本中的分离。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>牛粪中非o157产志贺毒素大肠埃希氏菌分离鉴定方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaatcgccattcgttgactacttct25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

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<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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