一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法与流程

本发明涉及动态光散射技术检测领域，更具体地说是一种以核酸滚环扩增技术为基础构建dna网状结构，诱导纳米粒子由单分散到聚集状态，利用动态光散射技术检测纳米粒子粒径，进而实现检测mirna的方法。

背景技术：

microrna（mirna）目前是一个十分活跃的研究领域，它对于深入探讨生命现象的本质、解释细胞行为和疾病发生机制、以及疾病诊断、基因治疗药物的开发都具有重大意义。mirna广泛存在于各种动、植物中，参与多种重要的生命活动。它作为基因调控的重要调控因子，在许多生物学过程中发挥着重要作用，但它的调控范围并不仅限于正常的生理活动，还与许多肿瘤、癌症的发生有着密切的联系。

mirna被视为一种新型的生物标志物和各种疾病的潜在治疗靶标。它的广泛存在与进化上的保守性，暗示它在生命活动中具有必不可少的调节作用，他们参与动植物生长发育、细胞分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。mirna无论在数量上还是功能上，可能都远远超过目前的发现，因此mirna的检测成为当前研究的热点和前沿。然而，由于mirna固有的易降解和低丰度的特点，使得难以高灵敏的检测mirna。

为了解决mirna在低浓度下也能被检测的问题，mirna的识别和信号放大检测策略变得尤为重要。然而，目前常见的mirna检测方法，例如荧光比色法、荧光法、化学发光法等光学检测方法灵敏度不高且易受光稳定性和复杂生物样品的影响。因此发展一种既稳定又能高灵敏的检测mirna的方法具有重要意义。本实验试图开发一种灵敏稳定的方法，设计结构可切换的哑铃型探针，利用滚环扩增技术构建dna网状结构，利用稳定的动态光散射技术实现mirna的高灵敏检测。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是通过滚环扩增技术构建dna网状结构实现mirna的高灵敏检测。

一种基于dna网状结构灵敏检测mirna的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）探针设计

根据目标链序列设计相应的挂锁探针pp、修饰金纳米粒子（aunps）的dna序列；其中，哑铃型挂锁探针pp序列的5端修饰了磷酸基团，修饰aunps的dna序列的3端修饰了巯基（c6-sh）；

（2）哑铃型挂锁探针pp的连接

哑铃型挂锁探针pp的连接反应在10μl溶液体积中进行，其中包10μm挂锁探针pp，2μl10×t4dna连接酶反应缓冲液，1μm目标mirna，20u/μlt4dna连接酶和5μl的depc处理水，加入t4dna连接酶之前，将反应混合物在55°c下加热5分钟，然后在39°c退火30分钟，冷却至室温，然后加入t4dna连接酶，在16°c下进行连接反应2小时；

（3）滚环扩增反应

向（2）步骤中得到的溶液中加入2.5μl10×phi29dna聚合酶反应缓冲液，0.5μlbsa，3μl浓度为25mm的dntps，1μl的phi29dna聚合酶和8μl的depc处理水；所得混合物在30°c下反应6小时，然后在65°c下孵育10分钟终止反应；

（4）动态光散射技术检测

向（3）步骤中得到的溶液中加入10μldna-aunps，将混合液在37°c孵化30分钟；然后进行动态光散射测量，实验参数如下：25°c，平衡稳定时间10秒和测量角度90°。

本发明的有益效果

（1）探针的哑铃型结构使得滚环扩增产物具有串联重复茎环序列，与dna-aunps杂交形成dna网状结构，使得aunps发生聚集，尺寸变大；

（2）利用结构可切换的哑铃型探针特异性识别mirna，启动滚环扩增反应，实现信号的放大；

（3）本发明所述方法灵敏度高、特异性好。

附图说明

图一为本文所述方法的实验原理图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。

实施例1

一种基于dna网状结构灵敏检测mirna的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）探针设计

根据目标链let-7a序列设计相应的挂锁探针pp、修饰aunps的dna序列；其中，哑铃型挂锁探针pp序列的5端修饰了磷酸基团，修饰aunps的dna序列的3端修饰了巯基；

（2）哑铃型挂锁探针pp的连接

哑铃型挂锁探针pp的连接反应在10μl溶液体积中进行，其中包10μm挂锁探针pp，2μl10×t4dna连接酶反应缓冲液，1μmlet-7a，20u/μlt4dna连接酶和5μl的depc处理水，加入t4dna连接酶之前，将反应混合物在55°c下加热5分钟，然后在39°c退火30分钟，冷却至室温，然后加入t4dna连接酶，在16°c下进行连接反应2小时；

（3）滚环扩增反应

向（2）步骤中得到的溶液中加入2.5μl10×phi29dna聚合酶反应缓冲液，0.5μlbsa，3μl浓度为25mm的dntps，1μl的phi29dna聚合酶和8μl的depc处理水；所得混合物在30°c下反应6小时，然后在65°c下孵育10分钟终止反应；

（4）动态光散射技术检测

向（3）步骤中得到的溶液中加入10μldna-aunps，将混合液在37°c孵化30分钟；然后进行动态光散射测量，实验参数如下：25°c，平衡稳定时间10秒和测量角度90°。

实施例2

检测步骤同例1，不同之处是：步骤3中反应时间为2小时。

序列表

<110>济南大学

<120>一种基于dna网状结构灵敏检测mirna的方法

<130>3

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>52

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

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<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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