一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法与流程

文档序号:21957185发布日期:2020-08-25 18:34阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于dna网状结构灵敏检测mirna的方法,其特征是包括以下步骤:

(1)探针设计

根据目标链序列设计相应的哑铃型挂锁探针pp、修饰aunps的dna序列;其中,哑铃型挂锁探针pp序列的5端修饰了磷酸基团,修饰aunps的dna序列的3端修饰了巯基(c6-sh);

(2)哑铃型挂锁探针pp的连接

哑铃型挂锁探针pp的连接反应在10μl溶液体积中进行,其中包10μm挂锁探针pp,2μl10×t4dna连接酶反应缓冲液,1μmlet-7a,20u/μlt4dna连接酶和5μl的depc处理水,加入t4dna连接酶之前,将反应混合物在55°c下加热5分钟,然后在39°c退火30分钟,冷却至室温,然后加入t4dna连接酶,在16°c下进行连接反应2小时;

(3)滚环扩增反应

向(2)步骤中得到的溶液中加入2.5μl10×phi29dna聚合酶反应缓冲液,0.5μlbsa,3μl浓度为25mm的dntps,1μl的phi29dna聚合酶和8μl的depc处理水;所得混合物在30°c下反应6小时,然后在65°c下孵育10分钟终止反应;

(4)动态光散射技术检测

向(3)步骤中得到的溶液中加入10μldna-aunps,将混合液在37°c孵化30分钟;然后进行动态光散射测量,实验参数如下:25°c,平衡稳定时间10秒和测量角度90°。

2.根据权利要求1所述一种基于dna网状结构灵敏检测mirna的方法,其特征在于,具有串联茎环结构的滚环扩增产物与dna-aunps杂交,形成dna网状结构,使得aunps由分散到聚集,尺寸由小变大。

3.根据权利要求1所述一种基于dna网状结构灵敏检测mirna的方法,其特征在于,哑铃型的挂锁探针以自身为模板连接成为哑铃型的密封探针,只有目标mirna存在时,通过链置换反应才能将密封探针从哑铃型活化成圆形,从而启动滚环扩增反应。

4.如权利要求1所述的一种基于dna网状结构灵敏检测mirna的方法,其特征是步骤中哑铃型挂锁探针pp、修饰aunps的dna序列,它们的核苷酸序列为序列清单中所述序列。


技术总结
本专利公开了一种基于DNA网状结构灵敏检测miRNA的方法,涉及生物传感领域。通过设计结构可切换的哑铃型探针,提高了目标识别的特异性,同时又使得滚环扩增产物具有串联重复茎环结构的特点;滚环扩增产物与修饰DNA‑AuNPs杂交形成DNA网状结构,使得AuNPs发生聚集,利用动态光散射技术对AuNPs尺寸进行测量,从而实现miRNA的检测。本发明灵敏度高、特异性好。

技术研发人员:刘海云;高奕;何涛;颜梅;于京华
受保护的技术使用者:济南大学
技术研发日:2020.04.21
技术公布日:2020.08.25
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