一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用与流程

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用。

背景技术：

鸡新城疫也叫作亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是一种由新城疫病毒引起的急性败血性传染病，该病具有高度接触传染性。鸡科动物都能感染患病，家鸡是最易感的群体,雏鸡易感性高于成年鸡。该病的死亡率较高，发病没有明显的季节特点，一年四季都能感染患病,但春季和秋季是该病的高发季节。

患病鸡具有典型的呼吸困难、下痢、神经萎靡及黏膜、浆膜出血的症状。在发病开始初，首先出现呼吸道症状，表现为患病鸡呼吸不畅，同时伴随咳嗽和喘息，呼吸时有“呼噜”声，口腔和鼻腔内有黏稠的分泌物，摇头。在患病周期内，会时不时地有患病鸡只死亡，大多数患病鸡会在患病1周后逐渐康复，但如果治疗不及时会增加死亡率。病程较长的鸡只粪便呈白色或淡绿色，部分患病鸡会表现出神经症状，走路摇晃，经常抬头；产蛋鸡患病会影响产蛋率，且蛋品质严重下降，部分患病鸡会出现异常的蛋量增多。该病给养禽业带来了巨大的经济损失。

近来我国流行的ndv多属于基因ⅵ、ⅶ、ⅷ、ⅸ型，尤其是基因ⅶ型较多，而我国使用的弱毒疫苗多为基因ⅰ、ⅱ型。我国现有疫苗对流行株的保护力有限，甚至基本没有保护。因此，亟需开发研制新型有效的疫苗以达到有效防治该类传染病之目的。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明专利设计了一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，将裂解位点突变的新城疫基因vii型f基因序列和hn基因序列同时与新城疫基因ii型lasota株的np、p、m和l基因序列构建新城疫嵌合病毒疫苗株。

基于此方法本发明设计了一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株，所述ndvdc株的全基因序列如seqidno.1所示，含有裂解位点突变的新城疫基因vii型f基因序列和hn基因序列，并含有新城疫基因ii型lasota株的np、p、m和l基因序列，所述ndvdc株的建议分类名为：鸡新城疫病毒，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年3月5日，保藏编号为：cgmccno.19298。所述ndvdc株的核苷酸序列的第3170个核苷酸处，p基因序列和m基因序列之间的非编码区插入了如seqidno.3所示的标记性核苷酸序列。

上述新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，包括如下步骤：(1)合成含有如seqidno.2所示的突变裂解位点后的新城疫基因vii型f基因序列和基因vii型的hn基因序列，并扩增新城疫基因ii型lasota株的np、p、m和l基因的全长cdna质粒pok-rndv，按照np(lasota)、p(lasota)、m(lasota)、f(新城疫基因vii型)、hn(新城疫基因vii型)和l(lasota)基因的顺序将各基因组克隆至pok12载体中；

(2)在基因p和m之间(第3170个核苷酸处)插入标记序列tagseq：tttcgcgaggcgcgccaa；在序列的5’上游引入t7启动子序列，在序列的3’端引入具有自我剪切功能的丁肝核酶序列和具有终止t7启动子转录功能的t7终止子序列，将cdna片段在共有的限制性酶切位点进行连接，并且在转录质粒pok12中装配为pok-rndv-dc质粒；

(3)分别将新城疫基因ii型lasota株的全长np、p和l基因插入pci-neo载体，构建辅助质粒pci-np、pci-p、pci-l；

(4)将含有标签的质粒pok-rndv-dc与辅助质粒pci-np、pci-p和pci-l共转染bhk-t7细胞，培养96h，细胞反复冻融后取细胞上清，接种9～11日龄spf鸡胚，收获病毒液即得鸡新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株。

所述步骤(4)中bhk-t7细胞的构建方法为：a、以ncbi官网记录的t7rna聚合酶基因序列为基础合成序列，构建pmv-t7rnapolymerase质粒；

b、将pmv-t7rnapolymerase质粒与p1020载体连接过夜，连接产物转化dh5α感受态细胞，并通过pcr鉴定和测序鉴定筛选出p1020-t7rnapolymerase阳性质粒；

c、将重组构建的p1020-t7rnapolymerase质粒使用质粒大提试剂盒提取质粒，确认无误后进行后续实验；

d、基于电穿孔法将p1020-t7rnapolymerase质粒转染至培养好的bhk-21贴壁细胞；分别依次通过再96孔板、24孔板和6孔板中培养细胞株，完成了细胞株的筛选过程；

e、对筛选出的细胞株进行扩增，使用wb检测方式筛选产量高的阳性细胞株，即转染成功的细胞株，命名为bhk-t7细胞。

进一步的，所述步骤(4)中转染bhk-t7细胞方法具体为：将bhk-t7细胞接种于六孔板中，待其生长至80％～90％的单层细胞时开始转染，转染前用pbs轻轻洗涤细胞3次，将eam01培养基换为opti-mem培养基，将构建好的全长质粒pok-rndv-dc和3个辅助质粒pci-np、pci-p和pci-l用转染试剂lipofectamine^tm2000按照合适的的比例共转染bhk-t7细胞。转染后更换培养基为eam01培养基。混合均匀后继续培养4天，转染后每日观察，适时换液。

本发明还公开了步骤(4)中新城疫嵌合病毒标记疫苗株的拯救方法，收获上述培养液及细胞，反复冻融3次后离心，取上清接种10日龄spf鸡胚(200μl/枚)，接种后的spf鸡胚继续培养5天后收集尿囊液进行ha检测，选取ha阳性的尿囊液进行分装，提取rna并进行测序，鉴定正确后，将拯救出来的病毒命名为ndvdc株，并作为拯救病毒的第一代，进行连续10次传代，以获得具有稳定ha活性的病毒。测定每代病毒液的ha活性，选取第1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)病毒进行序列测定。测序新拯救的病毒基因组为基因vii型的f(突变裂解位点)和hn序列，并含有lasota株的np、p、m和l基因；并含有构建时引入的分子标签，病毒获得成功拯救。

同时本发明获得的新城疫嵌合病毒ndvdc株可用于制备新城疫疫苗，具体制备方法为：(1)将鉴定正确的新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株接种到鸡胚中培养72～96h后收获尿囊液；将尿囊液收获后按照1％的比例接种bhk-21-sc悬浮细胞，加入tpck胰酶培养72h收获细胞培养液，即为新城疫嵌合标记疫苗株ndvdc株细胞毒抗原液；(2)在收获的病毒液中按照比例加入甲醛、β-丙内酯(bpl)或二乙烯亚胺(bei)灭活剂进行灭活；(3)将灭活后抗原液与油佐剂、铝佐剂、蜂胶佐剂、油水双相佐剂中的一种按照比例进行搅拌乳化获得均一的乳剂而获得。

本发明上述的的新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株临床鉴别的方法为：(1)设计并合成鉴别用特异性引物，上游引物jd-f：5’-cacgcccaatgcacccgagttc-3’下游引物jd-r：5’-cagcacttggggtgcctgcactac-3’；(2)提取新城疫病毒疫苗株的rna，用反转录酶将rna反转录为cdna；(3)以cdna为模板，加入特异性引物用pcr的方法扩增dna片段，扩增的片段大小约700bp；(4)将pcr扩增产物送测序公司进行序列测定，测定序列中含有tttcgcgaggcgcgccaa的标记核苷酸序列(位于全长序列的3170个核苷酸处)，则为新城疫病毒标记疫苗株ndvdc株；或者将pcr扩增产物进行胶回收，胶回收产物用nrui内切酶进行酶切，电泳结果为能够切成500bp和200bp两个条带，则所鉴定毒株为新城疫病毒标记疫苗株ndvdc株。

本发明的再一个目的是提供所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株的应用。及所述的新城疫病毒标记疫苗株ndvdc株在制备以新城疫病毒株为骨架的活载体疫苗中的应用。

相对于现有技术，本发明专利设计的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的进步之处在于，本研究中合成了鸡新城疫基因vii的f基因(334-351位的核苷酸序列为：gggagacaggggcgcctt)和hn基因序列，该序列为将f基因突变后的序列(如seqidno.2所示)，该突变后序列能够使新城疫的毒力降低，毒株安全性更好。

在本发明的重组新城疫病毒拯救系统中，使用流行毒株鸡新城疫基因vii型毒株的f(将裂解位点突变为弱毒株的裂解位点)和hn序列，保证了拯救毒株的表面免疫原性蛋白与流行毒株的表面免疫原性蛋白构象和抗原表位一致，具有更好的免疫原性；并使用鸡新城疫基因ii型经典疫苗株lasota株的np、p、m和l基因作为骨架，保留了鸡新城疫基因ii型lasota毒株高繁殖滴度的特性，该毒株在bhk-21-sc悬浮细胞上表现出了优异的生长特性。

本发明通过将构建的重组新城疫病毒标记疫苗株中加入标记序列，并能够通过测序和酶切鉴定的方法来进行毒株的鉴别，标记疫苗株为鉴别感染和疫苗免疫奠定了基础。

该标记疫苗株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性，遗传稳定，免疫原性好，能够用于制造防控目前流行的基因vii型新城疫的同型疫苗。

附图说明

图1为利用高保真聚合酶扩增产生的亚基因组重叠cdna片段装配全长pok-rndv-dc的模式图；

图2为新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株第1代、第2代、第3代、第5代和第10代与新城疫基因vii型f基因裂解位点测序比对结果。

图3为新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株第1代、第2代、第3代、第5代和第10代插入分子标签tagseq：tttcgcgaggcgcgccaa的与lasota株测序比对结果。

图4为新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株与其他疫苗株免疫后14日的hi抗体检测结果；*表示抗体水平显著高于其他组。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明创造一部分的实施例，而不是全部。基于本发明创造中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明创造保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1

重组病毒基因组全长cdna克隆的构建

主要实验材料培养基为含10％胎牛血清的mem培养基，ndv疫苗株lasota株购自中国兽医药品监察所、bhk-21细胞购自atcc、spf鸡胚和spf鸡由勃林格维通实验动物中心提供。

主要试剂质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自天根公司；限制性内切酶、t4dna连接酶购自neb公司；病毒rna提取试剂盒购自天根公司；e.colidh5α感受态细胞购自全式金生物；pmdl8-tvector和gxldnapolymerase购自takara公司；lipofectamine^tm2000转染试剂购自invitrogen公司。

1、引物设计与合成根据鸡新城疫基因vii型合成序列和新城疫基因ii型lasota株的序列，设计引物将突变裂解位点后的基因vii型f基因序列和基因vii型的hn序列，并与lasota株的np、p、m和l基因，按照基因序列顺序构建成全长新城疫pok-rndv序列嵌合毒株。在ndvdc株的全长cdna的第3170个核苷酸处插入标记序列，序列为tttcgcgaggcgcgccaa。设计合成引物(如表1和表2所示)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、合成基因vii型新城疫的f和hn基因

设计合成f蛋白裂解位点(rrqkrf)突变为lasota弱毒株的f蛋白裂解位点(grqgrl)后的f基因和基因vii型新城疫rs株的hn基因，共3602bp片段(如seqidno.2所示)。

3、扩增新城疫基因ii型lasota株的基因组序列

(1)为方便克隆和保证克隆所使用的各个酶切位点的单一性将嵌合毒株全长cdna分为4个片段进行扩增(如表1所示)；(2)并将合成的新城疫基因vii型的f和hn基因插入lasota株的f和hn基因的位置；(3)在序列的5’上游引入t7启动子序列；(4)为保证尾随序列的准确性，在序列的3’端引入具有自我剪切功能的丁肝核酶(hdvrz)序列和具有终止t7启动子转录功能的t7终止子序列；(5)将所获得4个片段连接在pok12载体上，构建pok-seg1，pok-seg2，pok-seg3和pok-seg4质粒，筛选阳性后测序验证，将测序正确的质粒保存备用。(6)依次将各片段克隆至pok12载体中，将构建的质粒命名为pok-rndv。完成全基因组的克隆后进行测序和酶切鉴定，确认构建质粒是正确的。

表1构建全长cdna序列所用引物

注：加下划线部分为酶切位点。

4、标记基因的引入

分别设计引物p9和p10，在引物中引入标记序列ttcgcgaggcgcgccaa，构建获得含有标记序列的pok-rndv-dc载体。

表2引入标记基因的引物序列

注：加下划线部分为加入的标记序列。

如图1所示，为利用高保真聚合酶扩增产生的亚基因组重叠cdna片段装配全长pok-rndv-dc的模式图；将np(lasota)、p(lasota)、m(lasota)、f(新城疫基因vii型)、hn(新城疫基因vii型)和l(lasota)基因按照顺序克隆至pok12载体中；在基因p和m之间插入标记序列tagseq：tttcgcgaggcgcgccaa；在基因序列的3‘端加上t7启动子，在基因序列的5’端加上hdvrz序列和t7终止子；将cdna片段在共有的限制性酶切位点进行连接，并且在转录质粒pok12中装配为pok-rndv-dc质粒。

实施例2

辅助质粒的构建

根据lasota株的全长基因组序列，设计引物分别扩增其编码核蛋白np、磷蛋白p和聚合酶蛋白l的开放阅读框(orf)，引物如表3所示。并将3个orf分别克隆至真核表达载体pci-neo的cmv启动子下游。构建成的辅助质粒分别命名为pci-np、pci-p和pci-l。

表3辅助质粒的构建引物序列

注：加下划线部分为酶切位点。

实施例3

表达t7rna聚合酶的bhkt7细胞的构建

(1)以ncbi官网记录的t7rna聚合酶序列(seqid：fj881694.1)为基础合成序列，构建pmv-t7rnapolymerase质粒；(2)将pmv-t7rnapolymerase质粒与p1020载体连接过夜，连接产物转化dh5α感受态细胞，并通过pcr鉴定和测序鉴定筛选出p1020-t7rnapolymerase阳性质粒；(3)将重组构建的p1020-t7rnapolymerase质粒使用天根生化科技有限公司的质粒大提试剂盒提取质粒，确认无误后进行后续实验；(4)基于电穿孔法将质粒转染至培养好的bhk-21贴壁细胞；(5)分别通过再96孔板、24孔板和6孔板中培养细胞株，完成了细胞株的筛选过程；(6)对筛选出的细胞株进行扩增，使用wb检测方式筛选产量高的阳性细胞株，即转染成功的细胞株，筛选得到最佳的已插入t7rna聚合酶的bhk-21细胞株(命名为bhk-t7)用于病毒的拯救。

实施例4

重组病毒的拯救及鉴定

1、重组病毒的拯救

将bhk-t7细胞接种于六孔板中，待其生长至80％～90％的单层细胞时开始转染，转染前用pbs轻轻洗涤细胞3次，将dmem培养基换为opti-mem培养基，将构建好的全长质粒pok-rndv-dc和3个辅助质粒(pci-np、pci-p和pci-l)用转染试剂lipofectamine^tm2000按照合适的比例共转染bhk-t7细胞。转染后用pbs轻轻洗涤3次，更换培养基为eam01培养基。混合均匀后继续孵育4天，转染后每日观察，适时换液。收获培养液及细胞，反复冻融3次后离心，取上清接种9～11日龄spf鸡胚(200μl/枚)，接种后的spf鸡胚继续培养3～5日后收集尿囊液进行ha检测，选取ha阳性的尿囊液进行分装，并储存于-80℃冰箱中冻存备用。

2、重组病毒分子标签的鉴定

(1)设计并合成鉴别用特异性引物，上游引物jd-f：5’-cacgcccaatgcacccgagttc-3’下游引物jd-r：5’-cagcacttggggtgcctgcactac-3’；(2)提取拯救获得的新城疫病毒疫苗株的rna，用反转录酶将rna反转录为cdna；(3)以提取的cdna为模板，加入特异性引物jd-f和jd-r用pcr的方法扩增dna片段，结果扩增的片段大小约700bp(4)将pcr扩增产物送测序公司进行序列测定，测定序列中含有tttcgcgaggcgcgccaa的标记核苷酸序列；(5)将pcr扩增产物进行胶回收，胶回收产物用nrui内切酶进行酶切，电泳结果为能够切成500bp和200bp两个条带，表明所鉴定毒株插入了tttcgcgaggcgcgccaa的标记核苷酸序列。

3、重组病毒的序列鉴定和遗传稳定性

选择ha阳性的病毒液提取rna并进行反转录后，进行全基因序列测定，若新拯救的病毒基因组为以lasota株为骨架，嵌合基因vii型f和hn基因；并含有构建时引入的分子标签，病毒则获得成功拯救，将拯救的病毒命名为新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株。将拯救的病毒进行连续10次传代，选取第1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)病毒的f和hn基因进行序列测定，并由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果表明第1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)新城疫病毒ndvdc株的f和hn序列均与插入的序列一致，表明该病毒传代过程中遗传稳定(结果如表4和表5所示)；第1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)病毒的f基因裂解位点均为弱毒株的裂解位点(结果如图2所示)。

选取第1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)病毒用分子标签鉴定引物jd-f：5’-cacgcccaatgcacccgagttc-3’和jd-r：5’-cagcacttggggtgcctgcactac-3’进行序列的pcr扩增，并由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果表明第1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)新城疫病毒rndvdc株均含有tttcgcgaggcgcgccaa的标记核苷酸序列(结果如图3所示)。将1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)pcr扩增后回收产物用nrui内切酶进行酶切鉴定，电泳结果表明将1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)用内切酶酶切后均获得500bp和200bp两个条带；而未插入分子标签的毒株则不能被切开。

表4ndvdc株f基因的遗传稳定性分析

表5ndvdc株hn基因的遗传稳定性分析

实施例5

重组病毒的生长特性及致病特性

1、重组病毒的培养特性

将bhk-21-sc悬浮细胞株接种到摇瓶中，当细胞密度达8×10⁶cells/ml时，按moi为0.005接入第1代(f1)、第2代(f2)、第3代(f3)、第5代(f5)和第10代(f10)的rndvdc毒株尿囊液，并加入接毒培养基和tpck胰酶。接毒后24h，36h，48h和72h分别取样计数，在接毒后的72h时收获病毒液，测定ha效价，ha效价能够达到1：2048及以上，对收获的病毒液进行eid50测定，病毒效价10^9.5eid50/0.1ml以上(结果如表6所示)。

表6ndvdc株悬浮培养效价

2、重组病毒的致病特性

按照oie标准测定lasota株、新城疫基因vii型毒株rs株及其嵌合毒株ndvdc株的鸡胚半数致死量(mdt)、脑内接种致病指数(icpi)和静脉接种致病指数(ivpi)的毒力指数测定。结果见表7。实验结果表明利用反向遗传操作技术救获的嵌合病毒株ndvdc株毒力显著低于亲本毒株lasota株和基因vii型毒株rs株，在鸡胚中增殖具有对spf鸡和spf鸡胚毒力明显减弱的生物学特性。

表7嵌合病毒株ndvdc株的病毒毒力指数测定

实施例6

诱导动物保护性抗体的免疫效果

1、灭活疫苗的制备

油相制备：取优质注射用白油94份，加入硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，高压灭菌备用。

水相制备：取检验合格的半成品抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。

乳化：水相与油相按1:2比例，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3500rpm/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

2、免疫攻毒保护试验方案

(1)免疫用30～60日龄健康易感鸡50只，分为4组，第1组为20只/组，皮下免疫ndvdc细胞毒制备的疫苗0.2ml/只；第2、3组为10只/组分别皮下免疫ndv-gvii-1和ndv-gvii-2疫苗0.2ml/只；第4组10只/组不免疫作为对照(如表8所示)。

表8免疫及攻毒信息

(2)采血免疫后21日采血测定抗体hi效价，结果ndvdc株免疫组抗体显著高于ndv-gvii-1和ndv-gvii-2免疫组抗体水平(结果如图4和表9所示)。

表9免疫后21日抗体水平

(3)攻毒在采血后，第1～3组各取10只肌肉注射rs毒株10⁵eld50，第1组取10只肌肉注射f48e8株毒株10⁵eld50；对照组每组各取5只肌肉注射rs毒株10⁵eld50，另各取5只肌肉注射f48e8株毒株10⁵eld50。

(4)临床观察观察鸡群的发病及死亡情况，结果表明，用f48e8株和rs株攻毒，各免疫组均能够提供100％的保护。

(5)病料分离攻毒后5天采肛门和呼吸道拭子，进行病毒分离和滴定，结果表明，攻毒后5天，ndvdc株免疫组用f48e8株和rs株攻毒均未分离出病毒，而ndv-gvii-1株和ndv-gvii-2株分别有20％和50％的排毒率；ndvdc株能够更有效的抑制排毒，能够提供更好的免疫保护(结果如表10所示)。

表10攻毒保护结果

上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。