一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用与流程

文档序号:21995942发布日期:2020-08-25 19:37阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法,其特征在于,将裂解位点突变的新城疫基因vii型f基因序列和hn基因序列同时与新城疫基因ii型lasota株的np、p、m和l基因序列构建新城疫嵌合病毒疫苗株。

2.一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株,其特征在于,新城疫嵌合病毒标记疫苗株命名为ndvdc株,该新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株的全基因序列如seqidno.1所示,含有裂解位点突变的新城疫基因vii型f基因序列和hn基因序列,并含有新城疫基因ii型lasota株的np、p、m和l基因序列,所述ndvdc株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:cgmccno.19298。

3.根据权利要求2所述新城疫嵌合病毒标记疫苗株,其特征在于,所述ndvdc株的核苷酸序列的第3170个核苷酸处,p基因序列和m基因序列之间的非编码区插入了如seqidno.3所示的标记性核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)合成含有如seqidno.2所示的突变裂解位点后的新城疫基因vii型f基因序列和hn基因序列,并扩增新城疫基因ii型lasota株的np、p、m和l基因的全长cdna质粒pok-rndv,各基因组的排列顺序为np基因、p基因、m基因、f基因、hn基因和l基因;

(2)在位于质粒pok-rndv的第3170个核苷酸处插入标记序列,序列为tttcgcgaggcgcgccaa,构建含有标签的质粒pok-rndv-dc;

(3)分别将新城疫基因ii型lasota株的全长np、p和l基因插入pci-neo载体,另外构建辅助质粒pci-np、pci-p、pci-l;

(4)将含有标签的质粒pok-rndv-dc与辅助质粒pci-np、pci-p和pci-l共转染bhk-t7细胞,培养96h,细胞反复冻融后取细胞上清,接种9~11日龄spf鸡胚,收获病毒液即得鸡新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株。

5.根据权利要求4所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法,其特征在于,所述步骤(2)中质粒pok-rndv-dc在序列的5’上游引入t7启动子序列,在序列的3’端引入具有自我剪切功能的丁肝核酶序列和具有终止t7启动子转录功能的t7终止子序列。

6.根据权利要求5所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法,其特征在于,所述步骤(4)中bhk-t7细胞的构建方法为通过转染的方法将t7rna聚合酶基因插入bhk-21细胞中获得。

7.根据权利要求6所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法,其特征在于,所述bhk-t7细胞的构建方法的步骤为,a、以ncbi官网记录的t7rna聚合酶基因序列为基础合成序列,构建pmv-t7rnapolymerase质粒;

b、将pmv-t7rnapolymerase质粒与p1020载体连接过夜,连接产物转化dh5α感受态细胞,并通过pcr鉴定和测序鉴定筛选出p1020-t7rnapolymerase阳性质粒;

c、将重组构建的p1020-t7rnapolymerase质粒使用质粒大提试剂盒提取质粒,确认无误后进行后续实验;

d、基于电穿孔法将p1020-t7rnapolymerase质粒转染至培养好的bhk-21贴壁细胞;分别依次通过再96孔板、24孔板和6孔板中培养细胞株,完成了细胞株的筛选过程;

e、对筛选出的细胞株进行扩增,使用wb检测方式筛选产量高的阳性细胞株,即转染成功的细胞株,命名为bhk-t7细胞。

8.一种如权利要求3所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株在制备新城疫疫苗中的应用。

9.一种如权利要求3所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株用于制备鸡新城疫疫苗的方法,其特征在于,包括以下步骤,(1)将权利要求2所述嵌合新城疫病毒标记疫苗株ndvdc株通过鸡胚培养或细胞培养的方式进行增殖,收获病毒液;(2)将收获的病毒液采用甲醛、β-丙内酯或二乙烯亚胺中的一种进行灭活;(3)将抗原液和疫苗佐剂进行搅拌乳化获得均一的乳剂。

10.一种临床鉴别如权利要求3所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株ndvdc株的方法,其特征在于,(1)设计并合成鉴别用特异性引物,上游引物jd-f:5’-cacgcccaatgcacccgagttc-3’;下游引物jd-r:5’-cagcacttggggtgcctgcactac-3’;(2)提取新城疫病毒疫苗株的rna,用反转录酶将rna反转录为cdna;(3)以cdna为模板,加入特异性引物用pcr的方法扩增dna片段,扩增的片段大小约700bp;(4)将pcr扩增产物送测序公司进行序列测定,测定序列中含有tttcgcgaggcgcgccaa的标记核苷酸序列(位于全长序列的3170个核苷酸处),则为新城疫病毒标记疫苗株ndvdc株;或将pcr扩增产物进行胶回收,胶回收产物用nrui内切酶进行酶切,电泳结果为能够切成500bp和200bp两个条带,则所鉴定毒株为新城疫病毒标记疫苗株ndvdc株。


技术总结
本发明涉及一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用,属于新城疫嵌合疫苗株的拯救及应用领域。本发明利用新城疫病毒反向遗传操作平台,将新城疫基因GⅦ型毒株的F蛋白裂解位点突变为弱毒株的裂解位点,该突变后的基因VII型新城疫毒株的F和HN基因与基因II型NDV La Sota株的NP、P、M、L构建全长嵌合cDNA序列,并在P和M之间的非编码区插入18bp的核苷酸标记序列。转染细胞拯救获得了新城疫嵌合病毒NDV DC株。本发明构建的嵌合病毒在鸡胚和细胞中均能达到较高的培养滴度。嵌合后的毒株含有基因VII型新城疫毒株的囊膜表面糖蛋白,并含有基因II型毒株的骨架,兼具新城疫基因VII型毒株的免疫原性和基因II型La Sota株的高繁殖和高安全特性。

技术研发人员:张凌云;闫召璐;谢田田;张博;郑杰;马宁宁
受保护的技术使用者:浙江鼎持生物制品有限公司;北京鼎持生物技术有限公司
技术研发日:2020.05.22
技术公布日:2020.08.25
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1